一种负载细胞三维支架的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞打印和生物材料技术领域，特别适用于生物医学组织工程支架材料的制备，具体为一种制备负载细胞三维支架的方法。
【背景技术】
[0002]生命科学、信息科学与制造科学相结合，是二十一世纪科技发展的重要趋势。基于先进制造理论和组织工程理论的细胞三维打印技术，为组织工程学、病理模型构建、药物筛选与检测、细胞生物学研究等领域拓展了新的理论和技术空间。
[0003]与传统组织工程方法相比，细胞打印的优势主要有:(I)同时构建有生物活性的二维或三维“细胞/材料”体系；(2)在时间和空间上准确沉积不同种类的细胞；(3)构建细胞所需的三维微环境。细胞打印输出技术主要包括喷墨打印(压电容积驱动式和热气泡式)、激光直写、激光诱导转移、静电喷射、聚焦超声波喷射、微挤出等，传统细胞打印的可行性和可靠性方面均已得到验证，但在如何保持细胞活性方面还有局限性:打印时，大多数哺乳动物细胞较为脆弱，易受到环境的影响，而在打印过程中喷嘴的最高温度在300°C以上，且存在着较大的剪切应力，在细胞打印过程中产生瞬间高温、高压或瞬间强静电场对细胞造成了伤害。因此制备具有合适孔隙结构且厚度大于300 μ m的负载细胞三维支架时，在打印过程中保持细胞活性，减少对其生物学特性的不利影响是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于细胞打印输出技术制备负载细胞三维支架的方法，具有保持细胞活性的特点。
[0005]一种负载细胞三维支架的制备方法，是将自体细胞与高温间歇灭菌的水凝胶溶液混合均匀得到混合液，喷射到交联剂溶液中，静置，然后去除交联剂溶液，漂洗后得到负载细胞微球体；将负载细胞微球体与基质材料混合得到细胞共混物；采用生物打印机将细胞共混物挤出在三维微动平台上，层层叠加，形成负载细胞三维支架。
[0006]进一步的，所述水凝胶溶液为水凝胶单体和水凝胶溶剂混合均匀配制而成，浓度为0.05-10 wt% ;所述水凝胶单体为胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖或海藻酸纳中的一种或几种的混合物；所述水凝胶溶剂为水或PH值为5.7-8.0的磷酸盐缓冲溶液。
[0007]进一步的，所述混合液中自体细胞的浓度为105_107/mL。
[0008]进一步的，所述喷射的压力为10-200 kPa，喷头直径为500-1000 μ m。
[0009]进一步的，所述交联剂溶液为CaCl2溶液，浓度为0.1-20 wt%0
[0010]进一步的，所述的自体细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞、成骨细胞中的一种或几种组合。
[0011]进一步的，所述漂洗是先用PBS溶液漂洗3遍，然后使用DMEM培养液漂洗3遍。
[0012]进一步的，所述基质材料的制备方法为:分别配制重组胶原溶液和海藻酸钠溶液，按质量比1:1-5混合，高温间歇灭菌，所述重组胶原溶液的浓度为2-10 wt %，所述海藻酸钠溶液的浓度为2-10 wt %;配置浓度为0.05- 2 wt %的CaCl2溶液，将重组胶原-海藻酸钠混合液与CaCl2溶液按体积比7:3混合均匀，得到基质材料。
[0013]进一步的，所述细胞共混物中负载细胞微球体的浓度为105-107/mL。
[0014]所述负载细胞三维支架用于制备组织工程支架。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是:本发明通过采用与细胞外基质成分类似的水凝胶材料对细胞进行包裹，能够有效减少打印过程中的机械和热环境对细胞造成的损伤。本发明通过将细胞与水凝胶混合溶液喷射到CaCl2溶液中的方法，制备得到负载细胞的微球体，水凝胶材料的包裹可对细胞形成保护，减轻细胞打印过程对细胞活性及生物活性造成的损害，保证高活性的细胞打印。本发明所用的种子细胞为自体细胞，无免疫排斥。本发明能根据人体组织或器官的不同需要，调整打印参数，能直接制备具有各种结构(多孔、管状)和力学性能的三维支架，用于组织工程和再生医学研究。本发明方法简单，易于操作，成本低，能三维成型具有复杂形态的支架，能满足临床需要，适合于工程支架的制备。
【附图说明】
[0015]图1.本发明负载细胞三维支架的制备方法流程图；
图2.本发明的负载细胞微球体的显微观察图；
图3.本发明的负载细胞三维支架结构图；
图4.本发明中实施例1所述支架细胞活性检测染色结果。
【具体实施方式】
[0016]下面结合【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
[0017]一种负载细胞三维支架，是利用自身细胞制备含有细胞的微球载体，与基质材料混合得到细胞共混物，利用细胞打印输出技术将细胞共混物层层叠加，形成负载细胞三维支架，具体步骤如下:
I)制备负载细胞微球体:将自体细胞与高温间歇灭菌的水凝胶溶液混合均匀得到混合液，所述混合液中自体细胞浓度为15-1OVmL ;按照压力10-200 kPa，喷头直径500-1000μ m的喷射条件将混合液喷射到交联剂溶液中，使喷射出的含有细胞的微液滴在交联剂中交联，形成负载细胞微球体，所述交联剂溶液为CaCl2溶液，浓度为0.1-20 wt%,静置2_60min，用移液器吸除交联剂溶液，然后使用PBS缓冲溶液漂洗3遍，使用DMEN(DulbeCC0’ sModified Eagle Media)细胞培养液漂洗3遍,得到负载细胞微球体,如图2所示。
[0018]所述的自体细胞可以为骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、软骨细胞、成骨细胞中的一种或几种组合。
[0019]所述水凝胶溶胶为水凝胶单体和水凝胶溶剂混合均匀配制成的，质量浓度为
0.05-10 wt% ;所述水凝胶单体为胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖或海藻酸纳中的一种或几种的混合物；所述水凝胶溶剂为水或PH值为5.7-8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液。水凝胶材料的包裹可对细胞形成保护，减轻细胞打印过程对细胞活性及生物活性造成的损害，保证高活性的细胞打印。
[0020]2)制备基质材料:分别配制重组胶原溶液和海藻酸钠溶液，按质量比1:1-5混合，高温间歇灭菌，所述重组胶原溶液的浓度为2-10 wt %，所述海藻酸钠溶液的浓度为2-10wt %。配置浓度为0.05- 2 wt %的CaCl2溶液，将重组胶原-海藻酸钠混合液与CaCl 2溶液按体积比7:3混合均匀，得到基质材料。
[0021]所述重组胶原为重组胶原蛋白，也称为重组类人胶原蛋白，具有可加工性、无病毒隐患、低排异反应、变形温度提高的优点。
[0022]所述基质材料做为细胞载体，具有天然细胞外基质的三维结构和组成成分，以实现相同的生理功能。理想的基质材料具有无毒性、有良好的生物相容性、一定成形性的。目前用于细胞组装的基质材料以天然生物材料为主，包括明胶、纤维蛋白、海藻酸钠、壳聚糖等。这些天然材料来自生物体，与细胞外基质的成分相似，与细胞亲和性强，且含有促进细胞生长、增殖等生命活动的因子。基于对于基质材料要求的分析和天然高分子物质的特点，本发明选择了具有良好生物相容性、可降解性和细胞亲和性的重组类人胶原蛋白和海藻酸钠做为基质材料。
[0023]3)细胞共混物制备:通过医用三通阀将负载细胞微球体和基质材料混合，其中负载细胞微球体的浓度为105-107/mL。
[0024]4)打印负载细胞三维支架:采用生物打印机将材料挤出在载有灭菌玻璃底板的三维微动平台上，在具有层片信息的CAD模型直接驱动下，形成不同的层面，不同的层面之间再层层交错叠加，形成三维结构体，用无菌1-20 wt % 0&(:12溶液交联2-20 min，制得负载细胞三维支架。
5)第五步，支架交联，将负载细胞三维支架用无菌2 wt % 0&(:12溶液浸泡，交联2 min。
[0025]6)用PBS溶液漂洗负载细胞三维支架3遍，DMEM培养液漂洗3遍后，置六孔板中常规体外培养，隔天换液并定期观察。
[0026]利用本发明方法制备得