一种猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法及其用途，属于生物材料 领域。
【背景技术】
[0002] 近几十年来我国女性乳腺癌发病率持续飘升，目前已成为我国妇女第一大恶性肿 瘤，同时由于皮肤软组织肿瘤、外伤、先天崎形、深度烧伤后及慢性溃瘍等疾病也会造成不 同程度软组织缺损，直接影响患者的外形美观乃至功能，对患者的生活质量造成直接的影 响；加之人体形体的美学再塑需求旺盛；根据美国整形外科医师协会统计，2012年美国共 进行28. 6万次隆乳术，在全美整形术中排名第一；而软组织填充W 200万次在微整形术中 排名第二。可见理想的软组织缺损修复材料市场需求巨大。根据BCC2012年1月发布的报告 显示，全球对组织工程和再生医学相关医用产品的市场在2011年达到598亿美元，2016年 预计能达到897亿美元，复合年增长率（Compounded annual growth rate, CAGR)为8. 4%。 而BCC发布的报告称2011年全球对整形相关材料的市场在240万公吨，而2016年预计将 达到460万公吨，复合年增长率为13. 8%。
[0003] 脂肪组织是软组织缺损修复重建，特别是女性乳房修复重建理想的填充物，但我 国组织工程产业化总体正处于临床前研究阶段，研究产品多集中于骨、软骨、皮肤、角膜等， 脂肪等软组织领域研究相对滞后，但是需求持续增长，因此具有广阔的发展空间和市场需 求。
[0004] 然而，因脂肪组织上具有多种免疫原性物质，直接用于机体会产生强烈的免疫反 应，副作用强，需要采用脱细胞方法脱去其免疫原性物质。
[0005] 脱细胞的方法包括物理法、化学法、酶法，化学法包括酸碱处理、非离子去垢剂处 理、离子去垢剂处理、两性离子去垢剂助理、=磯酸盐处理、低渗和高渗液处理、馨合剂处 理。其中，物理法和化学法中的非离子去垢剂吹了、低渗和高渗液处理较为温和，对细胞外 基质的影响较小，但是脱细胞不彻底；化学法中离子去垢剂可W有效脱细胞，但是对细胞外 基质有影响；而酶法处理可W有效脱细胞，且对细胞外基质的影响较小，但是存在价格昂 贵，成本高，难W工业应用的缺陷。
[0006] 由于脂肪组织的特殊性，目前报道的脂肪脱细胞方法均采用了膜酶、DNA酶来处 理，可W有效脱细胞和维持细胞外基质的结构，但是酶的价格昂贵，导致生产成本太高，难 W大工业应用，同时，整个处理时间过长，通常需要处理5天或更长时间。
[0007] 急需一种成本低廉、处理时间短的脱细胞方法，制备脂肪组织无细胞基质制备方 法。
【发明内容】
[000引为了解决上述问题，本发明提供了一种新的制备猪脂肪组织无细胞基质材料的方 法。
[0009] 本发明制备猪脂肪组织无细胞基质材料的方法，包括如下步骤：
[0010] (1)取新鲜猪皮下脂肪，清洗，剪碎，加水或者生理盐水，匀浆，离屯、，得沉淀，PBS 溶液或水漂洗；
[0011] (2)将沉淀粉碎，用SDS溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，离屯、，得沉淀；
[001引 做将沉淀用异丙醇溶液漂洗，再用PBS溶液或水漂洗，即可。
[0013] 漂洗；是指用水或者溶液反复洗漆。
[0014] 步骤（1)中，剪碎至大小为（0. 5 ?1. 5) cmX (0. 5 ?1. 5) cmX (0. 5 ?1. 5) cm。
[0015] 优选地，剪碎至大小为IcmXlcmXlcm。
[0016] 步骤（1)中，匀浆前，所述水或生理盐水的用量为皮下脂肪体积的0.5?2倍。优 选地，所述水或生理盐水的用量为皮下脂肪体积的1倍。
[0017] 步骤（1)中，所述匀浆的转速为10000?15000巧m，时间为3?7min。优选地，所 述匀浆的转速为120(K)巧m，时间为5min。
[001引步骤（1)中，所述离屯、的转速为3000?4000巧m，时间为3?7min。优选地，所述 离屯、的转速为3500巧m，时间为5min。
[0019] 步骤（2)中，所述粉碎是球磨粉碎，球磨的转速为2000?3000r/s，时间为3? 7min。优选地，所述球磨的转速为2500/s，时间为5min。
[0020] 步骤（2)中，所述SDS溶液的浓度为0. 25 %?1 %。
[0021] 优选地，所述SDS溶液的浓度为0. 5 %。
[002引步骤（2)中，所述SDS溶液漂洗的时间为2?化。
[0023] 优选地，所述SDS溶液漂洗的时间为祉。
[0024] 步骤（3)中，所述异丙醇溶液的浓度为80?100 %。
[0025] 优选地，所述异丙醇溶液的浓度为100%。
[0026] 步骤（3)中，所述异丙醇溶液的漂洗时间为1?化。
[0027] 优选地，所述异丙醇溶液的漂洗时间为化。
[002引本发明还提供了前述任意一项方法制备得到的猪脂肪组织无细胞基质材料。
[0029] 本发明人通过研究发现，本发明采用SDS溶液、异丙醇溶液，在特定工艺条件下， 结合特定的前处理步骤，在有效脱细胞的同时，可W有效维持基质材料的=维结构和多孔 结构，孔径平均大小为61. 16um，可用于体内修复，取得了意料不到的技术效果。
[0030] 本发明方法制备的猪脂肪组织无细胞基质材料脱细胞彻底，S维结构良好，同时， 本发明使用的试剂便宜，整个工艺时间仅仅1化左右，生产成本低廉，工业应用前景良好。
[0031] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可W做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0032] W下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于W下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0033] 图1脱细胞鉴定。a肥染色：猪脂肪组织（100幻；b;DAPI染色；猪脂肪组织 (100幻；C;本发明猪脂肪组织无细胞基质材料（100幻；d本发明猪脂肪组织无细胞基质材 料（200幻；
[0034] 图2脱脂程度鉴定。a ;猪脂肪组织（100幻；b ;本发明猪脂肪组织无细胞基质材料 (100 幻；
[003引图3扫描电镜。a ;本发明猪脂肪组织无细胞基质材料；b ;本发明猪脂肪组织无细 胞基质材料；C ;本发明猪脂肪组织无细胞基质材料胶原纤维完整，无断裂。
[0036] 图4天狼星红染色。a ;天狼星红染色100X ;b天狼星红染色200X ;
[0037] 图5实验方法。a ;术前备皮；b ;示皮下筋膜腔；C ;水化完全的本发明猪脂肪组织 无细胞基质材料；d ;缝合皮肤；
[003引图6本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的体内降解。a ;皮下植入3天；b ;皮下植 入1周；C ;皮下植入2周；d ;本发明猪脂肪组织无细胞基质材料皮下植入4周；e ;各观察时 间点本发明猪脂肪组织无细胞基质材料横径变化；
[0039] 图7免疫组织化学染色。a ;本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入3天，材料周 边（200幻；b:本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入3天，材料中央（200幻；C:本发明猪 脂肪组织无细胞基质材料植入1周，材料周边（200幻；d:本发明猪脂肪组织无细胞基质材 料植入1周，材料中央（200幻；e:本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入2周，材料周边 (200幻；f:本发明猪脂肪组织无细胞基质材料植入2周，材料内部（200幻；g:4周，材料内 部（200幻；h;4周，材料内部（200幻；
[0040] 图8CD68阳性细胞计数观察；
[0041] 图9组织标本制作方法流程图；
[0042] 图10切片脱蜡和水化过程流程图；
[00创图11肥染色流程图；
[0044] 图12DAPI染色流程图；
[0045] 图13新鲜脱细胞基质冰冻切片的制备流程图；
[0046] 图14天狼星红染色流程图。
【具体实施方式】
[0047] 实施例1本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法
[0048] 1、制备方法
[0049] (1)取新鲜皮下脂肪，使用生理盐水漂洗，去除脂肪表面血迹及其他杂质；
[0050] 似将脂肪组织剪碎至1cm X 1cm X 1cm大小，脂肪组织与生理盐水按体积比1:1进 行匀浆（12000巧m，5min)。将匀浆后获得的溶液W 3500巧m，5min进行离屯、，弃掉上层油脂； [0化1] (3)将离屯、获得的下层材料使用PBS溶液漂洗后球磨仪打粉（250化/s，5min);
[0化2] (4)室温下使用0. 5 % SDS溶液漂洗粉末状材料化，大量PBS溶液漂洗至无泡沫， 离屯、（3500巧m，5min);
[0化3] 巧）100%异丙醇溶液漂洗粉末状材料化脱脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料无异 味，即可。
[0化4] 制备粉末状材料后，可将粉末放入不同的模具中，冻干制成不同形状的猪脂肪组 织源性无细胞基质材料，包装后环氧己烧消毒。
[0055] 实施例2本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法
[0056] 1、制备方法
[0057] (1)取新鲜皮下脂肪，使用水漂洗，去除脂肪表面血迹及其他杂质；
[0化引 （2)将脂肪组织剪碎至0. 5cmX0. 5cmX0. 5cm大小，脂肪组织与生理盐水按体积 比1:0. 5进行匀浆（10000;rpm，3min)。将匀浆后获得的溶液W 3000;rpm，3min进行离心弃 掉上层油脂；
[0化9] (3)将离屯、获得的下层材料使用PBS溶液漂洗后球磨仪打粉（200化/s，3min);
[0060] (4)室温下使用0. 25 % SDS溶液漂洗粉末状材料化，大量PBS溶液漂洗至无泡沫， 离屯、；
[0061] (5) 80 %异丙醇溶液漂洗粉末状材料比脱脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料无异 味，即可。
[0062] 制备粉末状材料后，可将粉末放入不同的模具中，冻干制成不同形状的猪脂肪组 织源性无细胞基质材料，包装后环氧己烧消毒。
[0063] 实施例3本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的制备方法
[0064] 1、制备方法
[00化](1)取新鲜皮下脂肪，使用水漂洗，去除脂肪表面血迹及其他杂质；
[0066] (2)将脂肪组织剪碎至1. 5cmX 1. 5cmX 1. 5cm大小，脂肪组织与生理盐水按体积 比1:2进行匀浆（15000巧m，7min)。将匀浆后获得的溶液W 4000巧m，7min进行离屯、，弃掉 上层油脂；
[0067] (3)将离屯、获得的下层材料使用PBS溶液漂洗后球磨仪打粉（300化/s，7min);
[0068] (4)室温下使用1 % SDS溶液漂洗粉末状材料化，大量PBS溶液漂洗至无泡沫，离 屯、；
[0069] 巧）100%异丙醇溶液漂洗粉末状材料化脱脂，大量PBS溶液漂洗，直至材料无异 味，即可。
[0070] 制备粉末状材料后，可将粉末放入不同的模具中，冻干制成不同形状的猪脂肪组 织源性无细胞基质材料，包装后环氧己烧消毒。
[0071] 实施例4本发明猪脂肪组织无细胞基质材料的参数筛选
[0072] 1、实验方法
[0073] 实验分组；
[0074] 组 1