取出，沥净多余液体，称重并作好记录后切成长条状，均匀铺于10mm培养皿中，向培养皿中加入中性蛋白酶(Dispase)浓度为2.5mg/ml的中性蛋白酶(Dispase)酶液，每5g皮肤组织中加入20ml酶液，使每一块皮肤组织都完全浸没在酶液中，将皮肤组织在4°C下静止孵育过夜；
[0103](Ι-d)将在中性蛋白酶(Dispase)酶液中孵育过夜的皮肤组织用尖形镊子将表皮从真皮上小心剥离下来，将表皮和真皮分别转入一个新的培养皿中，沥净多余液体，将分离得到的表皮和真皮分别切碎成粘稠状，制得表皮匀浆和真皮匀浆；
[0104](Ι-e)将表皮匀浆置于含胰酶浓度为0.05%的磷酸盐缓冲液(PBS)中，每5g表皮匀浆中加入20ml上述酶液，在37°C下消化30分钟，消化过程中将聚团的表皮匀浆摇散，制得表皮细胞悬液；将真皮匀浆置于I型胶原酶中，每5g真皮匀浆中加入20ml上述酶液，在37°C下消化30分钟，消化过程中将聚团的真皮匀浆摇散，制得真皮细胞悬液；
[0105](Ι-f)向消化完的表皮细胞悬液中加入与表皮细胞悬液体积相同的含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液中的酶液，吹打20-30次，避免吹出气泡；向消化完的真皮细胞悬液中加入相同体积的含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中和真皮细胞悬液中的酶液，吹打20-30次，避免吹出气泡；
[0106](Ι-g)将中和后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液分别用100 μm的过滤筛网过滤，过滤过程中用移液管搅动溶液，使其过滤完全，并根据皮肤组织量多少用适量(5-10ml)的含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(含双抗)冲洗过滤器；然后将过滤后的表皮细胞悬液和真皮细胞悬液置于离心管中，100rpm离心5分钟，弃上清；再向每个离心管中加入1mL不含双抗的F12培养基重悬沉淀后，100rpm离心5分钟，将表皮细胞和真皮细胞分别从表皮细胞悬液和真皮细胞悬液中分离出来，计数并做好记录；
[0107](Ι-h)将分离得到的表皮细胞置于含1mM Rho激酶抑制剂(Rock Inhibitor)Y27632的CNT-07培养基中重悬得表皮细胞悬液，将细胞悬液接到铺有胶原蛋白的直径为10mm的细胞培养皿中培养，细胞密度为400-500万/皿；将分离得到的真皮细胞直接铺板，细胞密度为200-300万/皿，用含20ng/ml表皮生长因子(EGF)和20ng/ml成纤维细胞生长因子(FGF)的DMEM/F12(1:1) (Gibco, Cat.#11039)混合培养基中进行培养；培养环境接近人体生理环境，培养温度为35-37°C ;
[0108](2)表皮细胞和真皮细胞传代:
[0109](2-a)将步骤(Ι-h)中培养得到的表皮细胞和真皮细胞用5-10ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗去残留的血清后，置于T75细胞培养瓶中，向培养瓶中加入3ml含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶浓度为0.05%的胰酶酶液中，在37°C培养箱中消化10分钟；
[0110](2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞和真皮细胞全部脱落后，每个细胞培养瓶中加入1ml含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中和(可轻柔吹打几次，然后将含有表皮细胞和真皮细胞的酶液中加入含FBS的DMEM中和)，然后将中和后的表皮细胞和真皮细胞溶液分别倒入50ml离心管中，100rpm离心5分钟，弃上清；再分别加入1ml含双抗的F12培养基重悬细胞，计数，100rpm离心5分钟，弃上清；
[0111](2-c)将分离好的表皮细胞按1:3的比例传代，真皮细胞按1:6比例传代，表皮细胞培养到第二代，真皮细胞培养到第三代；
[0112](3)组织工程表皮片培养:
[0113](3-a)铺Pl或P2或P3的表皮细胞到六孔细胞培养皿中，150万/孔，Pl细胞为原代分离的细胞传过一代之后的细胞，P2为传过两代的细胞，P3为传过三代的细胞，加入3ml
表皮培养基培养，每隔一天更换新的表皮培养基；
[0114](3-b)当六孔板中每孔细胞长满后，将原表皮培养基换成3ml含0.1 %胎牛血清(FBS)的 DMEM/F12(3:1)混合培养基；
[0115](3-c)次日早上，将表皮细胞用I倍磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗一次后，每孔加入3ml中性蛋白酶(Dispase)酶液，放在37°C培养箱中培养30-45分钟，至表皮细胞成片分离下来形成表皮细胞层；
[0116](4)表皮细胞层转膜并结合真皮细胞:
[0117](4-a)将DMEM培养基提前在37°C下温浴30min，然后用温浴后的的DMEM清洗表皮细胞至少2次，不要损伤细胞层，每次清洗留取少量DMEM培养基，使表皮细胞层漂浮于DMEM培养基表面；
[0118](4-b)使清洗后的表皮细胞层基底细胞表面向下放置，将要转移的硅胶膜(Invitrogen)放置在表皮细胞层上面，将表皮细胞层的边缘提起贴附在硅胶膜上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在硅胶膜上，制得带有表皮细胞层的硅胶膜；
[0119](4-c)将带有表皮细胞层的膜转移到100_的培养皿中，取步骤(2-c)中培养好的4百万真皮细胞和黑色素细胞溶于F12培养基制得75 μ I细胞悬液后，均匀铺在硅胶膜上的表皮细胞层上，然后在37°C下在C02培养箱中培养1-2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮，转移到冰盒中，低温保存待移植。
[0120]本发明制备出的带有真皮细胞的组织工程表皮在裸鼠上再生出具有色素沉着的人皮肤和毛囊的试验
[0121]本发明制备出的带有真皮细胞的组织工程表皮在裸鼠上再生出具有色素沉着的人皮肤和毛囊的试验:
[0122]I材料和方法:
[0123]1.1试验动物:免疫缺陷的裸鼠(或纯合子nu/nu突变鼠)或非糖尿病肥胖小鼠/重症联合免疫缺陷鼠，这两种鼠都因免疫缺陷使其降低对异体组织产生排异反应，因此适于作为各种异体组织移植和肿瘤移植。
[0124]1.2组织工程表皮的标记:
[0125]为了展示再生的皮肤来自移植的本实施例制备获得的组织工程表皮，培养过程的包皮角质细胞在移植前用绿色荧光蛋白-标记逆转录病毒感染，以便移植细胞在荧光显微镜下可追踪。
[0126]1.3带有真皮细胞的组织工程表皮的移植:
[0127]从有免疫缺陷的裸鼠背上切掉一块0.5-2.0平方厘米大小的完整皮肤组织，形成无皮肤组织但没损害皮下肌肉组织的创口 ；将附有带有真皮细胞的组织工程表皮的硅胶膜覆盖在整个伤口上，使组织工程表皮的细胞面接触伤口，硅胶膜面朝上，并将硅胶膜与裸鼠皮肤缝合，将涂有药膏的消毒纱布至于伤口上，并用消毒绷带包裹裸鼠。
[0128]2观察指标及结果:
[0129]2.1观察时间:
[0130]每周观察移植组织工程表皮后的裸鼠并拍照记录，观察12周到一年。
[0131]2.2组织学分析:
[0132]2.2.1光学显微镜检测分析所用再生皮肤样本的采集及处理:
[0133]移植3个月后用解剖光学显微镜检查在裸鼠身上再生的新皮肤，并切除、收集再生皮肤的样本，样本冷冻处理后做10 μ??组织生理切片，先在10%的福尔马林中浸泡定形，用I倍磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，再用苏木紫染色三分钟，用蒸馏水冲洗，然后用伊红染色30秒；再分别用浓度为70%、90%和100%的乙醇冲洗和脱水；脱水后的切片用二甲苯漂净，盖玻片覆盖，用二甲苯基定型剂固化定型，并用光学显微镜检测再生皮肤的组织结构。
[0134]2.2.1荧光免疫检验法分析所用再生皮肤样本的采集及处理:
[0135]移植3个月后用解剖光学显微镜检查在裸鼠身上再生的新皮肤，并切除、收集再生皮肤的样本，样本冷冻后做ΙΟμπι组织生理切片，用4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液(PBS)固定10分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，室温下封闭缓冲液孵育I小时，所述磷酸盐缓冲液(PBS)中含10%驴血清和2%牛血清蛋白。一抗孵育:基底膜标记一抗(共轭鼠抗牛血清白蛋白(CD49) α6_合素(干细胞，cat.10111))、表皮细胞或底层细胞层标记(抗人角蛋白(BD, cat.550951))或真皮(间叶)细胞标记(兔抗波形蛋白(细胞信号传导，cat.3932))，将切片置于以上抗体溶液中4°C孵育过夜。次日，将切片置于磷酸盐缓冲液(PBS)中冲洗，带有荧光标记的抗鼠的二抗常温下孵育I小时。用含有固形剂的DAPKVectorLaboratory)固形，通过共聚焦显微镜分析来检查各蛋白的表达情况。
[0136]2.3观察结果:
[0137]移植4周后，移植处的创面已完全愈合，并形成有色素的新皮肤，没有疤痕形成，说明可以用于无疤痕的创伤愈合。
[0138]到第12周，皮肤表面产生肉眼清晰可辨的带有色素的毛发。因为免疫缺陷的裸鼠没有黑色素细胞不会形成色素的皮肤和毛发，所以说明新生的皮肤和毛发是来自移植的培养的细胞。
[0139]长出来的毛发持续增长，6个月可以达到3cm长，详见说明书附图图1_A、图1_B所示。这进一步证明在向移植区或周边皮肤注射或和皮肤细胞混合，并配合使用免疫抑制剂的情况下，同种异体的黑色素细胞可被应用到再生的皮肤和毛囊中，达到外观上接受的肤色。
[0140]6个月组织切片染色(苏木紫-伊红染色方法)分析显示，再生皮肤的结构和成人头皮的皮肤结构非常相似，含有表皮层、真皮层和皮下组织层，而再生的毛发其成熟毛干连接至皮脂腺和真皮乳突，详见说明书附图图2所示。
[0141]3 结论:
[0142]3.1再生皮肤具有毛囊循环生长能力:
[0143]我们观察到不同生长期的毛囊出现在同一个组织切片上，这说明再生的毛囊是有功能的进行循环生长。毛囊循环生长的能力是