衡量成熟毛囊的重要标准，为了更进一步监测毛发循环的功能，将裸鼠身上的毛发剪短以便观测毛发循环周期。在剪后一个月，发现再生的毛发能够重新生长出来，这进一步证明再生的毛发是有功能的。并且，在有些再生皮肤区域还观察到有汗腺的形成，而汗腺的再生以前没有被报导过。
[0144]为了进一步分析再生毛发的结构，我们利用碱性磷酸酶染色标识重组毛囊的真皮乳突(dermal papilla)。碱性磷酸酶是区分识别真皮乳突和其他真皮成纤维细胞的标志物。为了进一步标记再生毛发和皮肤，对第6周和第12周再生皮肤进行碱性磷酸酶染色标识再生的毛囊。染色显示移植后第6周早期阶段的毛发的乳突呈碱性磷酸酶阳性，而第12周成熟的毛发的毛囊及其周边呈碱性磷酸酶阳性，表明再生的毛囊是正常成熟的。
[0145]3.2再生皮肤来自移植组织工程表皮:
[0146]在移植后12周，将再生皮肤从移植体分离，在荧光显微镜下进行分析，发现所有的再生皮肤的表皮细胞部分其中包括表皮层、毛发和皮脂腺都呈现荧光绿，表明它们来源于绿色荧光蛋白-标记的培养的包皮角质细胞。与之相反，所有的真皮部分，包括毛囊的乳突，则对于绿色荧光蛋白都是阴性的。这个实验也建议我们可以体外对培养的细胞进行基因修饰来建立特殊皮肤疾病的模型。
[0147]为进一步证明再生的皮肤和毛囊不是由受体的老鼠细胞形成，而是来自移植的体外培养的人的皮肤细胞，我们用只识别人的细胞蛋白质抗体的免疫荧光染色法来分析再生的皮肤和毛囊。通过免疫荧光显微镜分析，再次确认再生的皮肤是来源于人体细胞。首先，我们用细胞角质蛋白(Pan-cytokeratin)抗体，该抗体可识别所有的人体表皮组织细胞。角质蛋白染色显示再生皮肤所有的表皮细胞的成分，包括表皮层、毛囊和皮脂腺，都显阳性，而鼠的表皮组织是阴性。然后，我们用抗人的波形蛋白抗体(vimentin)识别人体所有的真皮细胞。该染色显示再生的真皮组织包括真皮的乳突和皮下脂肪组织显阳性，但鼠的真皮组织是阴性。以上结果表明再生的皮肤完全是人体组织。
[0148]3.3再生皮肤有自身的愈合能力:
[0149]为进一步证明再生的皮肤是功能性的皮肤，我们在移植后12周，在裸鼠上形成的再生皮肤中间开一个直径和深度在2_的创口，同时也在裸鼠身上开一个同样大小的创口作为对照，来观察再生的皮肤又没有能力愈合。我们发现再生的皮肤9天左右创口完全愈合，愈合过程和人的皮肤一致，但比鼠的皮肤愈合时间要长(鼠5-7天就愈合)。免疫染色显示愈合的组织也是人体皮肤组织，说明再生皮肤有自身的愈合能力。这结果进一步表明再生皮肤是使功能性的人体皮肤，可以用于各种疾病如创伤愈合的研宄。
[0150]总之，从以上结果可以看出通过本发明用体外培养的表皮细胞混合真皮细胞和黑色素细胞后移植到免疫缺陷的裸鼠背上可再生出含有黑色素的人类皮肤组织，具备完整的有功能的皮肤和毛发，该技术可以用于建立特殊皮肤疾病模型，如牛皮癣，皮肤癌，湿瘆，斑秃，表皮水泡病，粉刺，白化病，皮肤老化等；也可以用于开发细胞产品用于临床上治疗白癜风、牛皮癣和皮肤白化病等，为人类多种皮肤疾病的治疗提供了崭新的途径。
【主权项】
1.一种带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤1:获得表皮细胞； 步骤2:接种所述表皮细胞，用表皮培养基培养至密度达到80% -100%，之后，更换为混合培养基，培养16h-24h，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；所述混合培养基包含胎牛血清、DMEM培养基和F12培养基； 步骤3:转移所述组织工程表皮片至半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，得带有表皮细胞层的膜；其中，所述表皮细胞层的分化细胞层与所述半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布接触； 步骤4:培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所述带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，培养lh-2h，即得； 所述真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞或所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤I中所述表皮细胞的制备方法为: 取皮肤组织，用中性蛋白酶孵育12h-20h，之后分离表皮，得表皮； 取所述表皮，切碎后，用胰酶酶解，收集，即得表皮细胞。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述接种之前，还包括表皮细胞的传代培养； 所述接种所用的表皮细胞为Pl代表皮细胞、P2代表皮细胞或P3代表皮细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤: 步骤(I):表皮细胞分离: (1-a)采集含有表皮的皮肤组织； (Ι-b)将所述皮肤组织消毒后用含双抗的磷酸盐缓冲液冲洗； (Ι-c)将所述冲洗后的皮肤组织切成长条状，浸没于中性蛋白酶酶液中，(TC _4°C消化孵育 12h-20h ； (1-d)分离所述消化孵育后的长条状皮肤组织，收集表皮部分，得表皮，切碎成粘稠状，制得表皮匀浆； (Ι-e)将所述表皮匀浆置于含胰酶的磷酸盐缓冲液中在37°C下消化25分钟-35分钟，制得表皮细胞悬液； (Ι-f)向所述表皮细胞悬液中加入含胎牛血清的DMEM培养基，中和表皮细胞悬液； (Ι-g)过滤中和后的表皮细胞悬液，离心、收集沉淀，得表皮细胞； 步骤(2):所述表皮细胞的传代培养: 将所述表皮细胞作为初始细胞，接种，培养至密度达80% — 100%，进行传代； 所述传代操作具体包括: (2-a)将培养至密度达80% -100%的表皮细胞用磷酸盐缓冲液洗去残留的血清后，浸没于含乙二胺四乙酸的胰酶酶液中，在37°C下消化5分钟一 15分钟； (2-b)在显微镜下观察，当表皮细胞从培养板中脱落后，向其酶液中加入含胎牛血清的DMEM培养基中和后，离心，收集沉淀；向所述沉淀中加入含双抗的F12培养基重悬细胞后，离心分离，收集沉淀，得原代表皮细胞； (2-c)将所述原代表皮细胞按1:2-3的比例传代，所述传代次数为I代-5代； 步骤(3):组织工程表皮片培养: (3-a)铺所述Pl代表皮细胞、所述P2代表皮细胞或所述P3代表皮细胞到细胞培养皿中，铺板密度在50% -80%，然后加入表皮培养基培养；每隔一天更换新的所述表皮培养基; (3-b)当细胞密度达80% -100%后，将表皮培养基换成混合培养基；所述混合培养基含胎牛血清、DMEM培养基和F12培养基； (3-c)培养16-24小时后，用磷酸盐缓冲液冲洗，之后浸没于中性蛋白酶酶液中，在37°C下培养30分钟-45分钟，至表皮细胞成片分离下来，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片; 步骤(4):所述组织工程表皮片转膜并结合真皮细胞: (4-a)用含胎牛血清的DMEM培养基反复清洗所述组织工程表皮片； (4-b)将所述清洗后的组织工程表皮片的基底细胞表面向下放置，将半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布放置在所述组织工程表皮片上面，之后将所述组织工程表皮片的边缘提起贴附在所述半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，使表皮细胞层的分化细胞层表面紧贴在半渗透性聚合物或硅胶膜底物或凡士林纱布上，制得带有表皮细胞层的膜； (4-c)培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所述带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，然后在37°C下培养I小时-2小时，使真皮细胞上完全附着表皮细胞，即制得带有真皮细胞的组织工程表皮； 所述真皮细胞为从皮肤真皮中分离的真皮细胞或所述从皮肤真皮中分离的真皮细胞和黑色素细胞的混合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(Ι-c)中的所述中性蛋白酶酶液的浓度为2.5mg/mL。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以g/mL计，步骤(Ι-e)中所述含胰酶的磷酸盐缓冲液中胰酶的浓度为0.05% ； 每5g所述表皮匀浆加入20mL所述含胰酶的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，以体积百分比计，步骤(1-f)中所述含胎牛血清的DMEM培养基中，所述胎牛血清的含量为5% -10% ; 向所述表皮细胞悬液中加入与所述表皮细胞悬液体积相同的所述含胎牛血清的DMEM培养基。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述表皮细胞的培养方法具体为: 将所述表皮细胞置于含Rho激酶抑制剂的CNT-07培养基中重悬得表皮细胞悬液，将所述表皮细胞悬液接到铺有胶原蛋白的培养皿中培养。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2-b)中所述含双抗的F12培养基中的双抗为青霉素和链霉素溶液的混合液； 其中，所述青霉素的浓度为100U/mL，所述链霉素的浓度为100ug/mL。
10.如权利要求1至9中任一项所述的制备方法制备获得的带有真皮细胞的组织工程表皮。
【专利摘要】本发明属于组织细胞学和组织工程学领域，公开了一种带有真皮细胞的组织工程表皮及其制备方法。该带有真皮细胞的组织工程表皮的制备方法包括：获得表皮细胞；接种所得表皮细胞，用表皮培养基培养至密度达到80％-100％，之后，更换为混合培养基，培养16h-24h，收集表皮细胞层，得组织工程表皮片；转移所得组织工程表皮至半渗透性聚合物、或硅胶模底物、或凡士林纱布上，得带有表皮细胞层的膜；培养真皮细胞，将所得真皮细胞铺在所得带有表皮细胞层的膜的表皮细胞层之上，培养1h-2h，即得。发明提供的制备方法操作简单，周期短，可以与受体自身皮肤组织相互刺激和诱导、促进受体完整表皮结构的形成。
【IPC分类】A61L27-60, A61L27-38, C12N5-071
【公开号】CN104548209
【申请号】CN201510054034
【发明人】吴训伟, 邢志青, 王景昆
【申请人】苏州磐升生物技术有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年2月3日