专利名称：：残留酶的测定的制作方法
技术领域：
：本发明涉及纺织品上残留酶量的测定方法和包含采用所述方法的从多肽文库筛选目的酶的方法。
背景技术：
：不同的酶，例如蛋白酶、脂肪酶和糖酶，经常被用于洗涤剂工业中，其作为洗涤剂的组分在洗涤的过程中与衣物通常接触，随后在漂洗衣物的过程中被去除。取决于具体的酶，酶和衣物和/或衣物上污渍的相互作用，可能如此之强，以至于在漂洗后酶仍存在衣物上。通常，可以通过在分析试验中筛选多肽文库来鉴定新的和/或改良的酶，所述分析试验能够在一定条件下测定酶的功能。通常，在这样库中鉴定新的和/或改进的酶的能力取决于鉴定的质量，例如，鉴定的强壮性(robustness)和/或其能够多大程度近似地模拟人们认为被鉴定的酶能够作用的那些条件。本发明提供纺织品上残留酶量的测定方法。发明概述本发明提供纺织品上残留酶量的测定方法，包括测定酶活性，其中纺织品在测定酶活性之前已经与酶接触并随后漂洗过(rinsed)。而且，本发明也提供从多肽文库中筛选目的酶的方法，包括a)测定纺织品上残留酶量，包括测定所述酶的活性，其中纺织品在测定所述活性之前已经与多肽文库接触并随后漂洗过。b)选择目的酶。发明详述酶/目的酶所述酶/目的酶可属于已知的酶类，或可属于未知的酶类，例如，具有所需要的功能活性但不一定属于已知酶类的酶。此处所用的术语“酶类”(E.C.)指国际通用的酶分类系统，国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会的建议(Recommendations(1992)oftheNomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)，AcademicPress，Inc.，1992。例如，酶/目的酶属于下述一种已知的酶类氧化还原酶(EC1.-.-.-)、转移酶(EC2.-.-.-)、水解酶(EC3.-.-.-)、裂合酶(EC4.-.-.-)、异构酶(EC5.-.-.-)和连接酶(EC6.-.-.-)。氧化还原酶还原酶的例子包括过氧化物酶(EC1.11.1)，漆酶(EC1.10.3.2)和葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)。转移酶转移酶的例子可以是属于下述任一亚类的转移酶a)转移一个碳的基团的转移酶(EC2.1)；b)转移醛或酮残基(EC2.2)的转移酶；酰基转移酶(EC2.3)；c)糖基转移酶(EC2.4)；d)转移非甲基的烷基基团或芳基基团的转移酶(EC2.5)；和e)转移含氮(nitrogenous)基团的转移酶(EC2.6)特别地，转移酶可以是转谷氨酰胺酶(蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶；EC2.3.2.13)。水解酶水解酶的例子包括羧酸酯水解酶(EC3.1.1.-)。特别地，它可以是脂肪分解酶，也就是，可以水解酯键的酶。这样的酶包括，例如，脂肪酶，例如三酰甘油脂肪酶(EC3.1.1.3)、脂蛋白脂肪酶(EC3.1.1.34)、单酸甘油酯脂肪酶(EC3.1.1.23)、溶血磷脂酶(lysophospholipase)、阿魏酸酯酶和酯酶(EC3.1.1.1，EC3.1.1.2)。括号内的数字是国际生物化学联合会酶学委员会根据酶的活性种类指定的系统数字。脂肪酶可以是原核的，特别是细菌的酶，例如，源自假单胞菌属(Pseudomonas)。假单胞菌属脂肪酶的例子，例如，源自洋葱假单胞菌(P.cepacia)(US5,290,694，蛋白质数据库文件(pdbfile)1OIL)，荚壳假单胞菌(P.glumae)(NFrenken等，(1992)，Appl.En-vir.Microbiol.583787-3791，蛋白质数据库文件1TAH和1QGE)，假产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP334462)和假单胞菌属菌株SD705(FERMBP-4772)(WO95/06720，EP721981，WO96/27002，EP812910)。荚壳假单胞菌脂肪酶序列与粘稠色杆菌(Chromobacteriumviscosum)(DE3908131A1)的氨基酸序列相同。其他的例子有细菌角质酶(cutinases)，例如，源自，假单胞菌属如门多萨假单胞菌(P.mendocina)(US5,389,536)或腐臭假单胞菌(P.putida)(WO88/09367)。或者，脂肪分解酶可以是真核的，例如，真菌脂肪分解酶，如腐质霉(Humicola)科和接合菌(Zygomycetes)科的脂肪分解酶和真菌角质酶。真菌角质酶的例子有豌豆腐皮镰孢(Fusariumsolanipisi)的角质酶(S.Longhi等，JournalofMolecularBiology，268(4)，779-799(1997))和Humicolainsolens(US5,827,719)。腐质霉科的脂肪分解酶由源自H.lanuginosa株DSM4109的脂肪酶和具有与所述酶高于50％同源性的脂肪酶组成。在EP258068和EP305216中描述了源自H.lanuginosa(同义语为THermomyceslanuginosus)的脂肪酶，具有US5,869,438中SEQIDNO2的1-269位所示的氨基酸序列。腐质霉科也包括下述脂肪分解酶源自沙门柏干酪青霉(Penicilliumcamembertii)(P25234)的脂肪酶、源自尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)的脂肪酶/磷脂酶(EP130064，WO98/26057)、源自异孢镰孢(F.heterosporum)(R87979)的脂肪酶、源自臭曲霉(Aspergillusfoetidus)的溶血磷脂酶(W33009)、源自米曲霉(A.oryzae)的磷脂酶(JP-A10-155493)、源自米曲霉的脂肪酶(D85895)、源自黑曲霉(A.niger)的脂肪酶/阿魏酸酯酶(Y09330)、源自塔宾曲霉(A.tubingensis)的脂肪酶/阿魏酸酯酶(Y09331)、源自塔宾曲霉的脂肪酶(WO98/45453)、源自黑曲霉的溶血磷脂酶(WO98/31790)、和源自腐皮镰孢的脂肪酶，其等电点为6.9，表观分子量30kDa(WO96/18729)。接合菌科包括具有与曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)的脂肪酶(P19515)至少50％同源性的脂肪酶。也包括脂肪酶源自反射犁头霉(Absidiareflexa)、A.Sporophora、冠毛犁头酶(A.corymbifera)、A.Blakesleeana、A.griseola(在WO96/13578和WO97/27276中都有描述)和稻根霉菌(Rhizopusoryzae)(P21811)。括号内的数值表示EMBL、GenBank、GeneSeqp或Swiss-Prot数据库的公开号或登录号。其他相关的水解酶包括，但不限于肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.-)，例如3-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.8)和6-肌醇六磷酸酶(EC3.1.3.26)；糖苷酶(EC3.2，其属于在本文中成为“糖酶”的群体)，如α-淀粉酶(EC3.2.1.1)；肽酶(EC3.4，也称蛋白酶)；和其他羰基水解酶。其他水解酶包括木葡聚糖酶、阿拉伯糖酶、鼠李半乳糖苷酶(rhamnogalactoronase)、果胶酶、木质素酶(例如多酚水解酶)。相关的蛋白酶(E.C.3.4)的例子包括而不限于那些来源于动物、植物或微生物或化学修饰的或蛋白工程突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，特别是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的例子有枯草杆菌蛋白酶，特别是那些来自芽孢杆菌(Bacillus)的，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的例子有胰蛋白酶(例如源自猪或牛的)和镰孢属(Fusarium)蛋白酶，描述在WO89/06270和WO94/25583中。商业可获得的蛋白酶的例子包括AlcalaseTM、SavinaseTM、PrimaseTM、DuralaseTM、EsperaseTM、和KannaseTM(NovozymesA/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2TM、和FN3TM(GenencorInternationalInc.)。在本文中，术语“糖酶”不仅用于表示能够打断糖链(例如淀粉)特别是五和六元环结构(也就是糖苷酶，EC3.2)的酶，也用于能够将糖类，例如六元环结构如D-葡萄糖，异构为五元环结构如D-果糖的酶。相关的糖酶包括下述(括号内是EC号)α-淀粉酶(3.2.1.1)、β-淀粉酶(3.2.1.2)、葡聚糖1，4-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.3)、纤维素酶(3.2.1.4)、内切-1，3(4)-β-葡聚糖酶(3.2.1.6)、内切-1，4-β-木聚糖酶(3.2.1.8)、葡聚糖酶(3.2.1.11)、几丁质酶(3.2.1.14)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases)(3.2.1.15)、溶菌酶(3.2.1.17)、β-葡萄糖苷酶(3.2.1.21)、α-半乳糖苷酶(3.2.1.22)，β-半乳糖苷酶(3.2.1.23)、甘露聚糖酶(3.2.1.25)、淀粉(amylo)-1，6-葡萄糖苷酶(3.2.1.33)、木聚糖1，4-β-木糖苷酶(3.2.1.37)、葡聚糖内切-1，3-β-D-葡萄糖苷酶(3.2.1.39)、α-糊精内切-1，6-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.41)、蔗糖α-葡萄糖苷酶(3.2.1.48)、葡聚糖内切-1，3-α-葡萄糖苷酶(3.2.1.59)、葡聚糖1，4-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.74)、葡聚糖内切-1，6-β-葡萄糖苷酶(3.2.1.75)、内切-1，4-β-甘露聚糖酶(3.2.1.78)、阿拉伯聚糖内切-1，5-α-L-阿拉伯糖苷酶(3.2.1.99)、内切-1，6-β-甘露聚糖酶(3.2.1.101)、乳糖酶(3.2.1.108)、壳聚糖酶(chitosanases)(3.2.1.132)和木糖异构酶(5.3.1.5)。然而，没有分类的酶也可能与本发明相关。酶/目的酶可以是已知酶的变体，其中的术语“变体”可理解为这样的酶，其与另外一种酶-通常是已知的酶，一般称为亲本酶(parentenzyme)-至少有一个氨基酸位点不同。多肽文库本发明也涉及从多肽文库筛选目的酶的方法。在本发明的上下文中术语“多肽文库”可理解为至少两种不同多肽的集合；也就是至少两种相差一个或更多个氨基酸位点的多肽，例如多肽中的氨基酸的数目不同或具体位点的氨基酸不同。典型地，制备多肽文库可通过将编码多肽文库的核酸序列文库导入能够表达所述多肽的宿主中。由于遗传简并性，所述文库中不同核酸序列的数目要比不同多肽的数目大。具体地，所述的核酸序列文库可能编码亲本酶的变体，也就是，与亲本酶相比至少有一个氨基酸位点不同的多肽。因而该筛选方法可用于筛选亲本酶的变体。生产这样变体，可通过例如亲本酶的随机诱变或定点诱变或本领域技术人员已知的其他方法。因而在一个具体的实施方案中，多肽文库可以是亲本酶的变体文库。合适的亲本酶的例子包括而不限于那些上述“酶”部分提到的酶类。具体地，亲本酶可以是脂肪分解酶例如源自腐质霉属如H.lanuginosa、或假单胞菌属或芽孢杆菌属的脂肪酶。在另外一个实施方案中，所述核酸序列文库编码源自一种或许多种不同有机体(organisms)的的多肽。因而该方法可用于筛选用于表达脂肪分解酶活性的不同有机体的一种或多种。在另外一个实施方案中，多肽文库的制备可通过合成多肽。制备核酸序列文库、将其导入宿主细胞、表达宿主细胞中所述多肽文库编码的多肽和已知的合成多肽的方法是本领域技术人员熟知的，例如可在下述文献中找到“MolecularcloningAlaboratorymanual”，Sambrook等，(1989)，ColdSpringHarborlab.，ColdSpringHarbor，NY；Ausubel，F.M.等(编)；“CurrentprotocolsinMolecularBiology”，JohnWileyandSons，(1995)；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(编)；“MolecularBiologicalMethodsforBacillus”，JohnWileyandSons，(1990)；“DNACloningAPracticalApproach，VolumesIandII”，D.N.Glover编(1985)；“OligonucleotideSynthesis”，M.J.Gait编(1984)；“NucleicAcidHybridization”，B.D.Hames&S.J.Higgins编(1985)；“TranscriptionAndTranslation”，B.D.Hames&S.J.Higgins，编(1984)；“AnimalCellCulture”，R.I.Freshney，编(1986)；“ImmobilizedCellsAndEnzymes”，IRLPress，(1986)；“APracticalGuideToMolecularCloning”，B.Perbal，(1984)。纺织品本发明上下文中术语“纺织品”(textile)包括织物(fabric)、服装(garments)和纱线(yarns)。织物可以由纤维通过编织(weaving)、针织(knitting)或无纺(non-woven)操作制得。编织和针织需要输入纱线，而无纺织物是纤维随机搭接(bonding)的结果(纸可以认为是无纺织物)。在本文中，术语“织物”也可以包括纤维和其他类型的经加工的织物。编织物(wovenfabric)通过在织机上纵向拉伸的经纱之间织入“纬纱”(filling)或纬纱(weftyarns)而构成。经纱必须在编织前上浆，以润滑并保护它们在编织期间以高速插入纬纱时不受磨损。纬纱可以以“一上一下(overone-underthenext)”的方式(平纹编织(plainweave))或通过“一上两下(overone-undertwo)”(斜纹织物(twill))或任何其它多种的排列方式穿过经纱。强度、纹理和图案不仅与纱线的类型/质量有关，也与编织类型有关。通常，女服(dresses)、衬衫、裤子、床单、毛巾、帷帘(draperies)等由编织物产生。针织是通过将联锁(interlocking)的纱线环连接在一起而形成织物。它与编织相反，编织是构成自两种类型的纱线，并具有许多“末端”，而针织的织物则产生自单股连续的纱线。同编织一样，有许多不同的将纱线圈结在一起的方式，并且最终的织物性质既取决于纱线也取决于针织类型。内衣、毛线衫(sweaters)、袜子、运动衫、汗衫等由针织物制成。无纺织品是通过机械、热、化学或溶剂介导的过程使纤维和细丝搭接和/或相互联锁而形成的织物片。所得到的织物可以为网状结构(web-likestructures)、叠层(laminates)或薄膜(film)的形式。常见实例是一次性使用的婴儿尿布、毛巾、抹布(wipes)、手术罩衣(surgicalgowns)、“环保(enviromentalfrendly)”纤维、过滤介质、被褥(bedding)、屋面材料(roofingmaterials)、二维织物的底布(backing)以及其他多种。用于本发明的纺织品可以是任何已知的纺织品(编织、针织或无纺的(non-woven))。具体的纺织品可以是包含纤维素的或有纤维质的纺织品，如棉、粘胶纤维(viscose)、人造丝(rayon)、苎麻(ramie)、亚麻布(linen)、lyocell(例如Tencel，由CourtauldsFibers制造)，或其混合物，或是合成纺织品，如聚酯、聚酰胺(polyamic)或尼龙中的一种或其混合物，或包含纤维素的或纤维质化的纤维与合成纤维的混合物。合适的纺织品的其他例子有这样的混合物，其包含其他天然纤维，如毛，丝的或其混合物，和一种或多种上述提到的纤维。纤维混合物的例子包括而不限于粘胶纤维(viscose)/棉混合物、lyocell/棉混合、粘胶纤维/毛混合、lyocell/毛混合、棉/毛混合；亚麻(亚麻布)、苎麻(ramie)和其他以纤维素纤维为基础的织物，包括纤维素纤维与其他纤维如毛、聚酰胺、丙烯酸类和聚酯纤维的所有混合物，例如棉/聚酯混合、粘胶纤维/棉/聚酯混合、毛/棉/聚酯混合、亚麻/棉混合等等。术语“毛”(wool)指任何商业上有用的动物毛产品，例如，来自绵羊、骆驼、兔、山羊、美洲驼(llama)的毛，并被称为美利奴羊毛(merinowool)，设得兰羊毛(Shetlandwool)，克什米尔羊绒(cashmerewool)，羊驼绒(alpacawool)，马海毛(mohair)等等，并且包括毛纤维和动物毛。纺织品可以是漂白的、染色的或未染色的。术语“聚酯”指的是聚(对苯二甲酸亚乙酯(ethyleneterephthalate))，其由缩合合成，由熔体牵拉形成纤维，可切段分级(stables)、可与其他类型的纤维混合，并纺成纱线。纱线被染色并织成布或制成地毯，或者，纱线编织成织物并染色。酶与纺织原料结合或粘附的能力不仅取决于具体的酶也取决于纺织品的种类。例如脂肪分解酶在漂洗过程中在聚酯纺织品上似乎比棉纺织品上更难清除，一般，脂肪分解酶与疏水材料的粘附和结合比与较亲水的材料的粘附和结合要强。更多的物质在本发明的一个具体实施方案中，纺织品可进一步包含其他物质如蛋白质、脂类、糖类或其混合物。具体的这样更多的物质可与人们日常生活中衣服沾上的污渍相似。作为人们通常沾到衣服上的污渍的此类物质的例子包括但不限于草、泥浆、粘土、咖啡、茶、血、鸡蛋、猪油、霉(湿污的)或已经加工过的物质如黄油、加工的肉、染色的猪油、油、化妆品、调味料、加工的土豆(调味番茄酱或浓汤)、巧克力、冰淇淋、可可、婴儿食品等等。纺织品也包括人造组合物，其包括选自精制蛋白组合物、精制多糖组合物、精制脂肪酸组合物、精制甘油三酯组合物的化合物或其他精制的生物的或非生物的化合物。其他合适的进一步物质的例子包括具体的组合物如碳粒，例如碳黑或氧化铁。纺织品染色可采用染色材料如其或以水溶液形式通过浸泡、刷和/或喷而施用于纺织品表面。染色的纺织品在使用前一般要干燥。纺织品包括一系列不同的商业可获得的染料/物质商品名EMPA_样本，由EMPASt.Gallen，Lerchfeldstrasse5，CH-9014St.Gallen，瑞士销售。本发明的发明人相信这些进一步物质的一些可与纺织品形成基质，在洗涤中酶可能被“截留”在其中，因此使得在漂洗过程中很难将酶去除。存在纺织品上蛋白质的例子包括但不限于牛奶、肉、蛋、血中存在的蛋白质，或前面所述的纺织品可能染污的那些物质或组合物中的任何一种中可能存在的其他蛋白质。术语“脂类”在本发明的上下文中可理解为一组化合物，其不能在水中溶解，但在有机溶剂中溶解如醚、丙酮和氯仿。所述组包括脂肪、油、甘油三酯、脂肪酸、糖脂类、磷脂类和类固醇。脂肪酸是简单的脂类，包括碳氢链(经常很长)末端的羧酸基团，具有通式CH3(CxHy)COOH，其是更复杂脂类的组分。三酰甘油是脂肪酸和甘油的三酯，其中甘油三酯的脂肪酸可以是相同的，但是在许多三酰甘油中它们是不同的。脂肪是一类物质，其通常包括三酰甘油和脂肪酸的混合物，其在20℃是固体。油与脂肪类似，除了其在20℃是液体，因为其包含的不饱和脂肪酸的量比脂肪高。脂肪和油的组成(composition)通常是通过其脂肪酸的组成来描述，包括那些存在于三酰甘油中脂肪酸和那些游离的脂肪酸。糖脂类是包含糖基的脂类。磷脂类是包含位于化合物亲水部分的磷酸基团的脂类。类固醇是一组化合物，包括胆固醇和高等动物的性激素，胆固醇是天然合成这些物质的前体。在本发明的一个具体实施方案中，脂类可以是“致污脂类(stain-causinglipid)”，也就是，在日常生活中经常造成衣物上染污的脂类或脂类混合物，这样脂类的例子包括但不限于，橄榄油、黄油、猪油、奶脂(milkfat)、口红(lipstick)、植物油或牛油。这样脂类的组成通常以其脂肪酸的含量来描述。酶与纺织品接触酶和多肽文库与纺织品的接触可通过任何方式。尤其可通过在纺织品中加入酶或多肽文库的溶液进行。例如如果酶或多肽文库是由宿主细胞表达和分泌，宿主细胞的上清液可加入到纺织品中，或如果酶或多肽文库是在宿主内如包含体内表达，可以裂解宿主细胞，并可将裂解液或其部分可加到纺织品中。酶或多肽文库在与纺织品接触之前也可纯化。在本文中术语“纯化的”指的是酶/多肽文库从天然环境中分离。如果酶/多肽文库是宿主细胞表达的，则天然环境指的是宿主细胞和与宿主细胞分泌的酶或多肽文库不同的化合物。对于合成制备的酶或多肽文库，纯化指的是去除在合成过程中存在的其他化合物。可通过本领域已知的一系列方法纯化酶或多肽文库，包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲合、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如制备级等电聚焦)、溶解度差异(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、和抽提(见，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson和LarsRyden，编辑，VCH出版社，NewYork，1989)。在一个具体实施方案中，酶或多肽文库与纺织品接触是通过将包含酶或多肽文库的洗涤剂溶液加入到纺织品上。术语“洗涤剂溶液”在本发明的上下文中理解为包含一种或更多种表面活性剂的溶液，所述表面活性剂可以是非离子的包括半极性的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂一般以0.1％-60％重量的水平存在。洗涤剂溶液可包括约1％-40％阴离子表面活性剂如线性苯磺酸烷基酯、α-烯属磺酸酯(olefinsulfonate)、硫酸烷基酯(脂肪醇硫酸酯)、脂肪醇乙氧基硫酸盐(alcoholethoxysulfate)、二级链烷磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。洗涤剂溶液通常包含约0.2％-40％非离子表面活性剂如脂肪醇乙氧基化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇胺、脂肪酸单乙醇胺、多羟基烷基脂肪酰胺、或葡糖胺(“葡萄糖胺”(glucamides))的N-酰基N-烷基衍生物。洗涤剂溶液可进一步包括0-65％的洗涤增效剂(detergentbuilder)或络合剂如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氨三乙酸、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶的硅酸盐或分层的(layered)硅酸盐(例如源自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂溶液可进一步包括一种或更多种聚合物。例子包括但不限于，羧甲基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、马来酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗涤剂溶液可进一步包括漂白系统，所述系统包括H2O2来源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可与过酸形成漂白激活剂(peracid-formingbleachactivator)如四乙酰基乙二胺或壬酰氧苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，漂白系统可包括例如酰胺、二酰亚胺(imide)或砜类型的过氧酸。洗涤剂溶液可进一步包括常规的酶稳定剂，例如多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香族硼酸酯，或苯硼酸衍生物如4-甲酰苯硼酸，并且该组合物可以如WO92/19709和WO92/19708中描述那样配制。洗涤剂溶液也可包括其他常规的洗涤剂组分如举个例子，织物调节剂(conditioner)如粘土、促泡剂、抑泡(suds)剂、防蚀剂、污物悬浮剂、防污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂、水溶助长剂(hydrotropes)、晦暗抑制剂、或香料。而且，洗涤剂溶液可包括除本发明的酶或目的酶以外的一种或更多种其他酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、和/或过氧化物酶。洗涤剂中通常采用的酶的例子对于本领域技术人员来说是已知的。在本发明的一个具体的实施方案中，在纺织品或酶或多肽文库与纺织品接触时，可以使用机械应力。特别地，酶/多肽文库与纺织品接触可如WO02/42740中描述的进行，WO02/42740中公开了测试化合物或其组合物洗涤效果的方法。漂洗纺织品在本发明的上下文中，术语“漂洗”理解为织物与以水为基础的溶液接触，随后去除所述的溶液，其中术语“以水为基础的溶液”理解为除水之外最多含20w/v％其他成分的水溶液，如最多含10w/v％或5w/v％或3w/v％或2w/v％或1w/v％或0.5w/v％的除水之外的其他成分。这样其他成分的例子在下面列出。本发明的方法可能用来模拟洗衣过程，漂洗可以特别地用来模拟洗衣过程中的漂洗条件。通常，衣服用水漂洗；然而水的组成依据水源不同而变化，例如，其可以是江水、泉水或地下水。而且，水源的地理位置可影响其组成。给定水源的硬度(总硬度)是由于其碱土金属钙、镁、锶和钡的盐的含量。因为通常水中只存在微量的锶和钡，水的硬度定义为钙离子(Ca2+)和镁离子(Mg2+)的含量。常规的做法是只用钙来表示水的硬度，换句话说镁离子的含量也作为钙的含量来表示。经常采用的硬度实际测量单位是所谓的德国度(Germandegree)，其定义如下1°dH＝10mgCaO/升“硬”水是包含高浓度的碳酸钙和其他矿物质的水。“软”水是包含低浓度的碳酸钙和其他矿物质的水。用于漂洗的以水为基础的溶液中存在的其他组分的例子包括但不限于，缓冲液特别是pH在4-10的缓冲液、盐、软化剂和小量的洗涤剂。如果纺织品已经在洗涤剂存在下与酶/多肽文库进行了接触，例如通过“洗涤”该纺织品，则特别可能存在小量的洗涤剂。合适缓冲液的例子包括但不限于如表1所示的。表1以水为基础的溶液中，除了上述描述的Ca2+和Mg2+以外，还可能存在的盐或离子的例子包括不限于NaCl、KCl、锶和钡。洗涤过程中通常使用软化剂来增强衣物的手感和新鲜度和降低静电的累积(见，例如，LevinsonMI，1999，JournalofSurfactantsandDetergents，2，223-235)。软化剂的一个主要成分是阳离子表面活性剂(tensides)或表面活性剂(surfactants)，例如，二氨基胺(diamidoamine)或双酯季铵盐(diesterquaternary)的或基于三乙醇胺的esterquat，然而，也包括其他的成分如香料、防腐剂、缓冲液、染料、荧光增白剂、酶、染料稳定剂、紫外吸收剂、氯清除剂和/或电解质(见，例如，LevinsonMI，1999，JournalofSurfactantsandDetergents，2，223-235)。测定酶活性的方法存在纺织品上残留的酶/目的酶活性测定可通过任何合适的方法。所选择的方法取决于，例如，具体的酶/目的酶。在本发明的上下文中，术语“残留的酶/目的酶”理解为在根据本发明的方法将所述纺织品与酶或多肽文库接触并接着漂洗后，仍存在纺织品上的酶/目的酶。酶或多肽文库与纺织品的接触和漂洗依据上述描述的进行。在一个具体的实施方案中，酶/目的酶活性的测定，可通过加入荧光化合物标记的所述酶/目的酶的底物，其中的荧光标记在底物与酶/目的酶相互作用时被底物释放。通过测定荧光或荧光的变化来测定酶/目的酶催化底物到产物的转化。这种方法的原理是通用的，并不依赖于具体的酶。测定荧光的方法对于本领域技术人员来说是已知的。采用的其他方法包括对具体的酶/目的酶的更特异性的方法。可以标记底物的合适荧光分子的例子包括，不限于试卤灵(Resorufin)或甲基伞形酮(Methylumbelliferon)。例如，如果酶/目的酶是脂肪分解酶，底物可以是脂肪酸，如丁酸、戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸(behinicacid)、木蜡酸、蜡酸、棕榈油酸、油酸、亚麻酸、或花生四烯酸。因而在本发明的一个具体的实施方案中，酶/目的酶是脂肪分解酶，底物是试卤灵-丁酸盐、甲基伞形酮-丁酸盐或甲基伞形酮-棕榈酸盐。用于测定脂肪分解酶的其他荧光的例子包括采用三酰甘油，其中的一个烷基被荧光基团如芘基取代。例如荧光性的(fluorogenic)和异构体纯(isomericallypure)的I-(3)-o-烷基-2，3-(3，2)-二酰基甘油已被描述为对于测定脂肪酶活性有用的底物(GuptaR等的综述，Biotechnol.Appl.Biochem(2003)，37，63-71)。其他合适的底物包括那些描述在例如GuptaR等，Biotechnol.Appl.Biochem(2003)，37，63-71，如三油精(Triolein)、三丁精(tributyrin)、醋精(三乙酰基甘油)、或三丙酸甘油酯(tripropionin)(三丙酰基甘油)。另外的例子是采用脂肪酸的对硝基苯基酯，例如，上述提到的脂肪酸中的一种，例如，对硝基苯基棕榈酸可用于测定脂肪酶活性。如果酶/目的酶是蛋白酶(E.C.3.4.)，酪蛋白或其衍生物可用作底物。特别地，底物可以是荧光化合物标记的酪蛋白或其衍生物，使得蛋白酶与酪蛋白之间的相互作用可通过测量荧光测定。这样荧光化合物的例子包括荧光素硫代氨甲酰(thiocarbamoyl)(FTC)、BODIPY_FL和BODIPY_TR-X，其中后两者是可获自MolecularProbes的两种化合物，例如作为EnzCheck_蛋白酶分析试剂盒的一部分从MolecularProbes获得。如果蛋白酶是对氨基酸序列Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)具有底物特异性的胱天蛋白酶(Caspase)，则可用7-氨基-4-甲基香豆素衍生的底物Z-DEVD-AMC(其中Z代表苄氧羰基)作为底物，如MolecularProbes的EnzChek_Caspase-3分析试剂盒所描述的。如果酶/目的酶是α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，底物可以是淀粉或淀粉衍生物。在一个具体的实施方案中，底物可以是源自玉米的、用BODIPY_FL染料标记的淀粉，该染料是MolecularProbes的EnzChek_淀粉酶分析试剂盒的一部分。如果酶/目的酶是纤维素酶(E.C.3.2.1.4)，底物可以是天然纤维素，尤其是标记5-(4，6-二氯三嗪基)氨基荧光素(DTAF)的天然纤维素，如HelbertW等(2003)，Biomacromolecules，4，481-487中描述的。其他合适底物的例子包括纤维六糖(cellhexaose)衍生物，其还原性末端包含萘部分，非还原性末端是4-(4’二甲基氨基苯偶氮)-苯(4-(4’dimethylaminobenzeneazo)-benzene)，如BoyerV等，(2002)，Chemistry-aEuropeanJournal，8(6)，1389-1394中描述的。如果酶/目的酶是过氧化物酶(E.C.1.11.1)，酶活性的测定是通过测定作为时间的函数的过氧化氢转化，采用基于作为发色团的ABTS_(2，2’-连氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸盐))的分析。氧化的ABTS的稍带绿色的蓝颜色(greenish-blue)可通过光度计在418nm测定。本发明的方法本发明的发明人发现纺织品上残留酶量的测定可通过测定所述酶活性实现。因而，本发明在一个具体实施方案中涉及测定纺织品上残留酶量的方法，所述方法包括测定所述酶的活性，其中的纺织品在测定酶活性之前，已经与酶接触并随后漂洗过。在本发明的另外一个具体的实施方案中，涉及从多肽文库中筛选目的酶的方法，包括采用上述方法测定纺织品上残留酶的量，然后选择酶。在本发明的上下文中，术语“残留的”指的是仍旧留在纺织品上的酶，其中所述的纺织品已经根据本发明的方法与酶接触后并漂洗过。对于这两种方法，首先将纺织品与酶接触，随后漂洗纺织品，并测定纺织品上酶的活性。因而，简要表述所述的方法，包括下述步骤a)将纺织品与酶或多肽文库接触b)漂洗纺织品c)测定存在纺织品上酶的活性，其中筛选方法进一步包括选择目的酶的步骤。因为绝大多数酶在5到95℃之间的温度时具有最佳的功能性，本发明的方法具体在5-95℃下进行，例如10-80℃、20-70℃、20-60℃、20-50℃。本发明的方法可在任何合适的容器中进行，如微量滴定板，其带有例如24孔/平板、96孔/平板、384孔/平板、1536孔/平板、或每个平板具有更多数目的孔，或纳升(nanoliter)无孔的室。采用微量滴定板的好处是通常可容易的自动进行检测步骤，其中在筛选多肽文库时特别有用。如果本发明的方法是在微量滴定板上进行，则纺织品为小片的形式，其尺寸刚好适于放置在平板上孔的底部。纺织品上酶/目的酶活性可以与对照作比较。例如，在从多肽文库筛选某种目的酶时，纺织品上酶的活性可与一种已知酶的活性作比较，举例来说，在筛选变体文库时，可与亲本酶作比较。当人们希望找到具有与亲本酶相似的降解衣服上污渍的能力，但更容易在漂洗中从衣服上去除的变体时，这可能具有显著的意义。因而在这种情况下，人们可以选择纺织品上的残留酶量较亲本酶为少的变体。例如在实施例中描述的，在筛选脂肪酶时，已知的脂肪酶如Lipolase_和Lipex_可以作为对照。另外一个实施例中采用的对照是所谓的内标物，其能够校正试验-试验(assay-assay)变差。典型地，可以使用在试验中显示低活性的已知酶和在实验中显示高活性的已知酶作为内标物，并将它们包含在每个化验中；这表明酶活性变化可用作试验-试验变差的指示。通常优选的是，在衣服用包含酶的洗涤剂洗涤后，衣服上不存在酶。因此，如果可以检测有多少酶仍旧留在衣服上，可能是有益的。例如，如果洗涤中使用了脂肪分解酶，测定残留酶的量可能是有益的，因为某些脂肪分解酶可能与衣服上的底物反应而释放难闻的脂肪酸。材料和方法酶Lipolase_是源自Humicolalanuginosa的脂肪酶，如EP258068和EP305216中描述的。Lipex_是Lipolase_的变体，如WO0060063中描述的。纺织品样品wfk20LS是聚酯/棉65/35的纺织品样品，沾有口红，所述的纺织品源自wfkTestgewebeGmbH，Christenfeld10，D-41379Brüggen，德国。方法微量洗涤(micro-laundry)沾有猪油或黄油的纺织品样品压入96孔微量滴定板的孔中。每孔加入150μl洗涤剂(100mML-精氨酸)。每孔中加入10μl表达要检测的酶的酵母细胞上清液(在微量滴定板上于SC培养基中生长3-4天)，并将微量滴定板在30℃、500rpm下保温20分钟。通过平板洗涤器去除洗涤的水，样品随后按照下述方法漂洗。漂洗在进行不同酶浓度的微量洗涤化验(下面描述)后，微孔中的纺织品样品采用人工制备的水洗涤，所述水的硬度是15°dH(参见材料和方法)。进行漂洗过程是通过加入180微升硬度为15°dH的水，将平板放置在定轨振荡器上300rpm、5分钟，然后去除漂洗的水。漂洗的过程总共重复3次。在最后一次去除漂洗水后所述的孔加入脂肪酶底物，以测定存在每个纺织品上的脂肪酶活性。实施例实施例1测定沾有口红的棉/聚酯纺织品上残留的脂肪酶35％棉和65％聚酯制成的、沾有口红的纺织品样品(wfk20LS)根据上述微量洗涤方法洗涤，其中所述洗涤剂包含不同浓度的Var1、Var2、Var3、Var4、Var5或Var6(都是Lipolase_的变体)、Lipolase_或Lipex_。Lipolase_和Lipex_用于与所述的变体比较。甲基伞形酮-丁酸盐(Fluka#19362)溶解在硬度为15°dH、含0.4％TritonX-100(SigmaT9284)的水中，直到甲基伞形酮-丁酸盐的浓度为200μM。将100微升这样的底物加入到包含纺织品样品的每个孔中，在室温保温一个小时。一个小时后在荧光计SpectraFluorPlus(Tecan，奥地利)上测定荧光，其中激发波长设置为360nm，发射波长设置为465nm。465nm荧光下每个浓度的脂肪酶/脂肪酶变体的结果如表2所示表2结果所示Var1和Var6，后者仅在某些浓度下发射比Lipex_少的荧光，表明在纺织品洗涤后存在纺织品上的那些变体的量要比Lipex_少。在其他试验中发现相似量的残留脂肪酶。实施例2测定沾有黄油和苏丹红(Sudanred)的棉/聚酯纺织品上残留的脂肪酶沾有口红的35％棉和65％聚酯制成的纺织品样品(wfk20LS)根据上述微量洗涤方法洗涤，其中洗涤剂包含不同浓度的Var1、Var3、Var5、Lipolase_或Lipex_。试卤灵-丁酸盐(Fluka#83637)溶解在硬度为15°dH、含0.4％TritonX-100(SigmaT9284)的水中，直到试卤灵-丁酸盐的浓度为200μM。将100微升这样的底物加入到包含纺织品样品的每个孔中，在室温保温一个小时。一个小时后在荧光计Polarstar(来自BMGLabtechnologiesGmbH，德国)上测定荧光，其中激发波长设置为530nm，发射波长设置为590nm。590nm荧光下每个浓度的脂肪酶/脂肪酶变体的结果如表3所示表3结果表明Var5发射的荧光比Lipex_少，表明在纺织品洗涤后，残留在纺织品上的该变体比Lipex_要少。在其他试验中发现相似量的残留脂肪酶。权利要求1.测定纺织品上残留酶量的方法，包括测定该酶的活性，其中在测定酶活性之前，所述纺织品已经与所述酶接触并随后漂洗过。2.根据权利要求1的方法，包括下述步骤a)将纺织品与酶接触；b)漂洗纺织品；c)测定纺织品上酶的活性。3.从多肽文库筛选目的酶的方法，包括a)测定纺织品上残留酶的量，包括测定所述酶的活性，其中在测定所述活性之前所述纺织品已经与所述多肽文库接触并随后漂洗过；b)选择目的酶。4.根据权利要求3的方法，其中步骤a)包括下述步骤i)将多肽文库与纺织品接触；ii)漂洗纺织品；iii)测定纺织品上目的酶的活性。5.根据前述任一项权利要求的方法，其中酶或目的酶选自氧化还原酶(EC1.-.-.-)、转移酶(EC2.-.-.-)、水解酶(EC3.-.-.-)、裂合酶(EC4.-.-.-)、异构酶(EC5.-.-.-)和连接酶(EC6.-.-.-)组成的组。6.根据权利要求5的方法，其中酶或目的酶是脂肪分解酶，例如脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。7.根据前述任一项权利要求的方法，其中残留酶或目的酶的量比对照要少。8.根据前述任一项权利要求的方法，其中的纺织品是由棉、聚酯、毛或上述任意的混合物制成的。9.根据前述任一项权利要求的方法，其中的纺织品还包括其他物质，如脂类、蛋白质、糖类或它们中两个或更多个的组合。10.根据前述任一项权利要求的方法，其中酶或目的酶活性的测定是通过添加荧光底物到包含酶或多肽文库的纺织品上，并测定荧光的量。全文摘要本发明涉及测定纺织品上残留酶量的方法，包括测定酶活性，其中在测定酶活性之前所述纺织品已经与酶接触过，并随后漂洗过，本发明还涉及从多肽文库筛选目的酶的方法包括在所述方法中测试所述文库。文档编号C11D11/00GK1965087SQ200580018633公开日2007年5月16日申请日期2005年6月7日优先权日2004年6月7日发明者马兹·E·比约恩瓦德,格诺特·阿贝尔申请人:诺维信公司