专利名称：反应治具和反应方法、以及cDNA的合成方法
技术领域：
本发明涉及反应治具(反応治具reaction jig(反应保持器))和反应方法。更 具体而言，本发明涉及可平行且简便地实施任意包含清洗工序的多个连续反应的反应治具 和反应方法。此外，本发明还涉及使用上述反应治具的cDNA的合成方法。
背景技术：
通常由mRNA起始的cDNA的合成和DNA的扩增等基因相关反应多以小容量平行 进行多个种类。此时，通常例如使用96孔或384孔等微孔列阵(74々α々-Α7Χ microwell array)，准备已将反应液和清洗液加入到各孔中的阵列，一旦反应或清洗结束， 则通过移液管将溶液移动到下一个孔中，供下一步处理使用。当上述处理操作通过程序进 行时也可利用机器人。但是，即使利用机器人，移动溶液所使用的移液管也需要每次清洗或更换后在下 一步处理中使用，操作非常繁杂。为代替使用移液管，也可使用磁珠，用磁石吊起固定于磁珠上的供试品并使之移 动(例如日本特表2007-504835号公报(专利文献1))。但是，当使用上述微孔列阵时，移 动所使用的磁石需要从孔的上方靠近，并根据情况浸渍于孔中的溶液中。浸渍于溶液中的 磁石在下一步骤前需要清洗。另外，在移动至下一步骤后，为了将磁珠从磁石上释放，也需 要磁石可消磁。非专利文献1中刊登了利用磁珠的RT-PCR反应法。在该文献所记载的方法中，室 温下的反应通过相对于100份溶液添加1份油，通过油膜覆盖液滴来进行蒸发等的预防。专利文献1 日本特表2007-504835号公报Juergen Pipperl,Masafumi Inoue2,Lisa F-P Ng3,PaveL NeuziL 1,4, Yi Zhang l，4&Lukas Novak 1,4, NATURE MEDICINE VOLUME 13 NUMBER 10 OCTOBER 2007 第 1259-1263 页
发明内容
发明所要解决的课题如上所述，当使用96孔或384孔等微孔列阵平行进行多种反应和清洗操作时，无 论使用移液管，还是使用磁珠，都需要清洗或更换操作所使用的移液管或磁珠，操作繁杂。此外，如非专利文献1所记载的方法所示，通过油膜覆盖液滴来防止蒸发等，就操 作而言也是繁杂的。特别是当使用大量液滴时，这种繁杂无法忽视。因此，本发明的目的在于提供每次操作不需要清洗或更换移动溶液等所使用的器 具，可平行进行多种反应和清洗操作的装置和方法。此外，本发明的目的还在于提供不通过 油膜覆盖液滴而可以平行进行多种反应和清洗操作的装置和方法。解决课题的手段本发明如下所示。
(1)反应治具，其特征在于基板一侧的表面排列设置有多个突起状围壁，所述突 起状围壁至少具有1个凹口部，且在内部具有可保持液滴的空间，并且所述基板表面的至少保持所述液滴的面对于纯水的接触角为90 150°的范围。(2) (1)中记载的反应治具，其中，所述多个突起状围壁至少部分或全部纵横地排 列设置。(3) (1)或(2)中记载的反应治具，其中，所述突起状围壁的液滴保持用空间可保 持0. 5 μ 1 200 μ 1范围的量的液滴。(4) (1) (3)中任1项记载的反应治具，其中，突起状围壁具有2个或3个凹口 部，所述凹口部开口的间隔为0.5 IOmm的范围。(5)⑴ (4)中任1项记载的反应治具，其中，所述基板表面由石蜡树脂(〃，7 ^ >樹脂)、特氟隆树脂或有机硅树脂构成。(6)⑴ (4)中任1项记载的反应治具，其中，所述基板具有由石蜡树脂、特氟隆 树脂或有机硅树脂构成的涂层。(7)⑴ (6)中任1项记载的反应治具，其中，使用所述反应治具以在各突起状围 壁的液滴保持用空间中，将相同或不同种类溶液的液滴不与置于其它突起状围壁的液滴保 持用空间部分的液滴混合地保持。(8)⑴ (7)中任1项记载的反应治具，其中，使用所述反应治具以在属于同一横 列的突起状围壁的液滴保持用空间中保持同一种类溶液的液滴。(9) (7)或(8)中任1项记载的反应治具，其中，所述溶液为含有表面张力降低试剂 的反应液或清洗液。(10) (1) (9)中任1项记载的反应治具，所述反应治具进一步具有覆盖具有所述 突起状围壁的表面的覆盖部件，且进一步具有为所述覆盖部件所覆盖的空间提供湿气的保 湿部件。(11)反应方法，所述反应方法包括使用(1) (10)中任1项记载的反应治具，在 与所述基板的具有突起状围壁的表面相反一侧的表面使用磁石，使固定于磁珠上的物质在 上述突起状围壁的液滴保持用空间所保持的含有表面张力降低试剂的溶液的液滴中按顺 序移动，从而进行反应和/或清洗。(12)cDNA的合成方法，所述合成方法包括使用1个纵列中至少设置有2个突起状 围壁的(1) (10)中任1项记载的反应治具，在所述2个突起状围壁的液滴保持用空间中按顺序分别保持含有表面张力降低 试剂的细胞溶解用溶液和cDNA合成用溶液的液滴，在与基板的具有突起状围壁的表面相反一侧的表面使用磁石，使固定于磁珠上的 mRNA在所述2个突起状围壁的液滴保持用空间所保持的溶液中按顺序移动，制得固定于磁珠上的cDNA。(13) (12)中记载的方法，其中，使用在多个纵列中至少设置有2个突起状围壁的 反应治具，各横列的突起状围壁的液滴保持用空间所保持的溶液为同一种类的溶液，固定于纵列移动的磁珠上的mRNA为不同种类的mRNA，作为固定于磁珠上的cDNA，制得多个不同种类的cDNA。(14) (12)或(13)中任1项记载的方法，其中，所述反应治具在1个纵列中至少设置有4个突起状围壁，所述4个突起状围壁的液滴保持用空间按顺序分别保持细胞溶解用溶液、mRNA清 洗用溶液、cDNA合成用溶液和cDNA清洗用溶液的液滴，将固定于磁珠上的mRNA在所述4个突起状围壁的液滴保持用空间所保持的溶液 中按顺序移动。(15) (11) (14)中任1项记载的方法，其中，将具有突起状围壁的表面朝下来使 用所述反应治具。发明的效果根据本发明，可提供在反应和清洗等的每次操作中可不清洗或更换移动溶液等所 使用的器具而平行进行多种反应和清洗操作的装置和方法。实施发明的最佳方式[反应治具]本发明涉及基板一侧的表面排列设置有多个突起状围壁，所述突起状围壁具有至 少1个凹口部，且在内部具有可保持液滴的空间的反应治具。突起状围壁只要具有至少1个凹口部且在内部具有可保持液滴的空间即可。突起 状围壁的形状具体而言如
图1所示，可根据用途从各种形状中选择。例如，如图1中的G所 示，可以是凹口部为1个的突起状围壁。凹口部为1个的突起状围壁适合例如反应开始位 置和反应结束位置或最终位置。如图1中的々、(丄4、!1、1^所示，凹口部为2个的突起状 围壁适合在反应或清洗等工序的中途使用。如图1中的J、K所示凹口部为3个的突起状围 壁以及如图1中的B、L所示凹口部为4个的突起状围壁适合用于例如将反应或清洗后的物 质分配成2份以上的位置。但是，并无限定于上述使用方法的意图。另外，1个反应治具中所设置的突起状围壁并不限定于1种，也可适宜设置多个具 有不同形状的突起状围壁。突起状围壁内部所形成的可保持液滴的空间的容量可根据反应治具的用途和突 起状围壁的功能适宜设定，例如可以是0. 5μ 1 200 μ 1的范围。但是，并无限定于上述范 围的意图，可保持液滴的空间的容量可根据用途适宜决定。作为突起状围壁，以具有〃字形突起的形态为例，根据以下图2对本发明的反应 治具进行进一步说明。!、字形突起虽然在图1中并未示出，但具有存在2个凹口，各凹口所 形成的开口(间隙)的尺寸不同的形状。可将开口的尺寸大的一方例如用作入口，将开口 的尺寸小的一方例如用作出口。如图2所示，本发明的反应治具100在基板10的一侧表面11上朝同一方向排列 设置有多个〃字形突起20。上述多个突起纵横地排列设置。构成〃字形突起的纵列的〃字 形突起数和构成〃字形突起的横列的〃字形突起数可考虑反应治具的用途和同时处理的 反应操作数、以及基板10的大小和形状、〃字形突起20的形状或大小、〃字形突起20之间 的间隔等来适宜决定。构成〃字形突起的纵列的〃字形突起数可以是例如2 10个，构成 〃字形突起的横列的〃字形突起数可以是例如2 100个。但是，并无限定于上述范围的 意图。图2的反应治具为纵横地排列设置有横16列、纵8列的〃字形突起的反应治具。如图2所示，〃字形突起经由因凹口形成的间隙21而设置的2个突起22、23构成。 此外，〃字形突起的内部具有可保持液滴40的空间30，该空间可保持的液滴的量可以是例如0.5μ1 200μ1的范围。但是，并无限定于上述范围的意图。突起22、23的形状只要 可在空间30中保持上述量的液滴则无特殊限制。但是，从节省空间地保持空间30所保持 的液滴的观点出发，优选部分圆形或部分椭圆形。但是，也可以是一根直线形或由多条直线 构成的形状(例如 字形)。突起22、23的高度只要可在空间30中保持上述量的液滴则无 特殊限制。突起22、23的高度可以是例如0. 1 5mm的范围。如下所述，间隙21是在将固定在完成处理操作的磁珠上的反应物从〃字形突起 内部的空间30所保持的液滴移动至下一个〃字形突起内部的空间30所保持的液滴时，使 磁珠与经固定的反应物一同移动的移动通路。因此，间隙21的最短间隔可根据以下观点决 定磁珠可容易地向下一个〃字形突起的空间30移动，并且〃字形突起可作为移动防御提 发挥作用，以妨碍〃字形突起的空间30所保持的液滴与磁珠一同向下一个〃字形突起的 空间30移动。根据上述观点，间隙21的最短间隔可以是例如1 IOmm的范围。另一方面，从使磁珠的移动容易且形成用于保持液滴的空间的观点出发，与间隙 21相反一侧的突起22、23的末端优选为开口状态。从基板容易制备的观点出发，本发明反应治具的基板表面的至少保持液滴的面优 选与其它基板表面无高低差，并且平坦。但是，本发明反应治具的基板表面的至少保持液滴 的面也可低于其它基板表面，形成凹陷。与平坦的情况相比，通过形成凹陷使液滴的保持变 得容易。但是，具有如下程度的凹陷深度和构成凹陷的面的形状是合适的，所述程度为不妨 碍磁珠从被保持的液滴的移动。在构成凹陷的面中，如下曲面是合适的，所述曲面的至少通 向突起开口的、存在磁珠移动可能性的面无高低差。另 外，凹陷的深度为例如突起开口尺寸 的1/2以下，构成凹陷的面的最大倾斜为45°以下是合适的。从空间对液滴的保持、防止各空间所保持的液滴接触的观点出发，本发明反应治 具的基板表面的至少保持液滴的面对于纯水的接触角为90 150°的范围是合适的。液 滴因突起状围壁被保持在突起状围壁的内部，但仅就突起状围壁而言，在下述使用磁珠的 反应操作中，存在无法良好保持液滴的情况。因此，在本发明中为了使液滴良好地保持在突 起状围壁的内部，至少使突起状围壁的内部面为对于纯水的接触角为90 150°范围的表 面。对于纯水的接触角因形成表面的材料(材质)和表面状态(例如表面糙度或表面形状 等)而变化。即使材质相同，若表面状态(例如表面糙度或表面形状等)不同，则对于纯水 的接触角也发生变化。在本发明中，按照对于纯水的接触角为90 150°的范围选择形成 表面的材料(材质)和表面状态(例如表面糙度或表面形状等)。作为形成表面的材料(材质)，可使用属于防水性较高的材料的石蜡树脂、特氟隆 树脂或有机硅树脂等。可由上述材料构成的物质也可形成基板本身，基板为其它材料(例 如玻璃基板)，也可在表面上设置上述石蜡树脂、特氟隆树脂或有机硅树脂等的涂层。就 上述树脂而言，只要材料本身的防水性高，并且是平滑的表面，就可显示出上述范围的接触 角。但是，也可根据需要通过使表面糙度化来调整接触角。例如当使用石蜡树脂时，在图2的反应治具中，在基板10的表面可设置有在与〃 字形突起的〃的纵向平行的方向上取向的微波形凹凸(表面糙度)。上述微波形凹凸由于 在与〃字形突起的〃的纵向平行的方向上取向，所以具有使磁珠容易移动的功能。微波形凹凸只要可发挥上述功能则无特殊限制，可以是例如高度为Iym Imm范 围且波长为Iym Imm范围的微波形凹凸。此外，对具有微波形凹凸的表面调整凹凸形状，以使对于纯水的接触角为90 150°的范围。在各〃字形突起20的空间30中，相同或不同种类溶液的液滴可不与置于其它〃 字形突起的〃的空间部分的液滴混合地保持而使用。空间30中作为液滴所保持的溶液无 特殊限制，可以是例如反应液或清洗液。反应液和清洗液的种类可根据本发明的反应治具 的使用目的适宜选择。在所使用的反应液和清洗液中添加表面张力降低试剂是合适的。表面张力降低试 剂具有使溶液的表面张力减少、在疏水性基板上稳定保持液滴的效果。另外，表面张力降低 试剂还具有降低在磁珠组(集団)向液滴外移动时构成阻碍的液滴的表面张力的效果。在 本发明中，如上所述，至少使形成液滴保持空间的表面对于纯水的接触角为90 150°的 范围，使之具有较高的防水性，通过向此处所保持的液滴中添加表面张力降低试剂，抑制液 滴向液滴保持空间表面外扩展，并且赋予液滴对液滴保持空间表面的附着性，增大保持力， 由此当磁珠向液滴搬入或搬出时，可维持液滴向液滴保持空间表面的保持。另外，邻接的突 起状围壁和突起状围壁之间的表面也同样可使对于纯水的接触角为90 150°的范围，考 虑到磁珠移动的容易性等，邻接的突起状围壁和突起状围壁之间的表面也可具有不同的性 质。另外，通过添加表面张力降低试剂，存在即使在使用磁珠，特别是粒径较小的磁珠 时，也可使向液滴的搬出(侵入)容易的优点。当例如在纯水中制成0. 浓度的情况下，表面张力降低试剂为可使玻璃板上的 纯水的接触角(下述表1所示的测定结果为42° )下降至30°以下的试剂是合适的。作 为具有这样的表面张力降低作用的试剂，可列举出表面活性剂和肺表面活化剂蛋白质等脂 蛋白、富含血清白蛋白或脂蛋白的血清等。表面活性剂包括各种表面活性剂，与种类无关，均可用作表面张力降低试剂。以下 进行了例示，但其仅仅是例示，并不限定于这些例示的表面活性剂。(1)阴离子系表面活性剂脂肪酸钠、单烷基硫酸盐(2)阳离子系表面活性剂烷基聚氧乙烯硫酸盐、烷基苯磺酸盐、单烷基磷酸盐(3)两性表面活性剂烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、烷基苄基二甲基铵 盐、烷基二甲胺氧化物、烷基羧基甜菜碱(4)非离子型表面活性剂聚氧乙烯烷基醚、脂肪酸脱水山梨糖醇酯、烷基多聚葡 萄糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、氨基单甘油醚作为阴离子表面活性剂的代表例，可列举出十二 烷基硫酸锂；作为非离子型表面活性剂的代表例，可列举出Triton X 100。斟酌上述观点，也考虑到表面张力降低试剂的种类和液滴保持空间表面对于纯水 的接触角，表面张力降低试剂的添加量为例如0. 001 的范围，优选0.01 的范 围。但是，并不受上述范围限制。本发明的反应治具当对不同种类的样品进行同一反应操作处理时，属于同一横列 的〃字形突起的空间可用于保持同种溶液的液滴。本发明的反应治具可进一步具有覆盖具有突起状围壁的表面的覆盖部件，且进一 步具有为所述覆盖部件所覆盖的空间提供湿气的保湿部件。例如，如图2所示，在箱型塑料 箱50的底部开口部设置薄层玻璃板10，其上贴有具有突起状围壁的树脂膜11，使突起朝向 塑料箱的内部。此外，还可设置覆盖塑料箱上部开口的覆盖部件(盖)60。覆盖部件(盖)60的内部可设置有为覆盖部件所覆盖的空间提供湿气的保湿部件(例如湿式滤纸)61。通过 制成上述的结构，即使在操作少量液滴时，也可抑制水分从液滴中的挥发，良好地进行反应 和清洗操作等。可在与基板10的具有突起状围壁20的表面相反一侧的表面(图2的上 面)使用磁石(例如小型钕磁石)70，使磁珠按顺序移动，进行反应和清洗等操作。[反应方法]本发明包含使用上述本发明的反应治具的反应方法。本发明的反应方法包括在与 基板的具有突起状围壁的表面相反一侧的表面使用磁石，将固定于磁珠上的物质在突起状 围壁(例如上述〃字形突起)的空间所保持的含有表面张力低下试剂的溶液液滴中按顺序 移动，进行反应和清洗。进行反应和清洗的温度可考虑适合反应和清洗的的温度来适宜决 定，也可在每道工序中上下调整温度。此时，也可根据需要在例如上述覆盖部件50和/或 60的外侧或内部、和/或薄层玻璃板(10)与树脂膜(11)之间或与基板具有突起状围壁的 表面相反一侧的表面设置加热和/或冷却装置。在上述本发明的反应方法中，上述反应治具优选将具有突起状围壁的表面朝下使 用。若将具有突起状围壁的表面朝下使用，则突起状围壁所收纳的液滴呈悬滴状。若在此状 态下进行反应，则由于蒸气轻，所以在上部进行蒸发，因此若液滴为悬滴状，则可抑制蒸发。 其结果即使在开放体系下进行，室温下也可相当程度地抑制蒸发。此外，通过将反应治具中 具有突起状围壁的表面收纳于覆盖部件之中，或将反应治具中具有突起状围壁的表面设置 于收纳有保湿部件的覆盖部件之中，可进一步防止水从液滴的蒸发。通过采取上述方法，可 以不像非专利文献1中记载的那样使用油，而抑制水分从液滴的蒸发。若不使用油，则即 使是数微升的微量反应液，由于油不附着于移液管，所以具有可随时、容易地进行溶液的添 加·回收的优点。若在室温下不吹风的条件下，则即使不使用保湿剂，不是封闭体系(不放 入覆盖部件(容器))的情况下，可维持数微升的悬滴在数小时内不干燥。但是，进行酶反 应的温度高于室温时，例如在50°C附近进行酶反应时，无法忽视蒸发。此时，优选放入装有 保湿剂的容器(覆盖部件)内进行反应等操作。当将反应治具中具有突起状围壁的表面收纳于覆盖部件中时，在进行反应等操作 之前和操作中，优选在不影响反应等的范围内将由反应治具和覆盖部件形成的内部加热至 例如30 40°C。因加热而产生的水蒸气在基板表面上凝结形成微小的液滴，具有使磁珠从 液滴中的移动流畅的作用。特别是当使用表面张力降低能力较低的试剂(具体而言使用表 面活性剂以外的试剂)时，具有通过上述加热使磁珠的移动更流畅的优点。另外，从促进基 板表面上的水蒸气凝结的观点出发，也可冷却被覆盖部件所覆盖的反应治具，例如在较低 温的室内进行操作。另外，作为使液滴呈悬滴状的另1个优点，可列举出促进液滴中磁珠的搅拌的优 点。若使磁石脱离基板，则被磁石所吸引的液滴中的磁珠因重力落至悬滴状液滴底部，通过 再次使磁石接触基板，磁珠从液滴底部聚集于基板表面。通过上述操作，可提高磁珠的清洗 和酶反应等的效率。通过磁石进行的悬滴状液滴中磁珠的吸引和落下即使是1次，也可多 次反复进行。磁珠可使用市售的磁珠。磁珠的粒径可以为例如0. 01 μ m 2mm的范围，优选 0. Ιμπι 0. Imm的范围。但是，若磁珠的粒径小至纳米级，则存在向液滴的侵入(搬入)变 难的情况。此时，通过合用具有更大粒径的磁珠作为载体，可使向液滴的侵入(搬入)容易。
9在作为载体合用的珠上未固定有物质，但也可合用固定有物质的载体珠。此外，在磁珠的表面对作为通过本发明的反应方法进行反应处理的对象物的物质 进行固定。物质的固定可根据常规方法进行。作为反应处理的对象物的物质无特殊限制，可 列举出核酸(DNA、RNA等)、肽、蛋白质、糖类、脂质、复合糖脂(複合糖脂質)、天然低分子、 合成低分子、高分子化合物、金属等。本法可应用于核酸、蛋白、脂质、糖质、复合糖质、化学 物质的大规模·微量连续反应，也可用于固定细胞(1至十几个)的免疫染色。作为反应处理对象物的物质对磁珠的固定量可考虑物质的种类和反应的种类等 来适宜决定。作为本发明的反应方法的一个实例，可列举出cDNA的合成方法。本发明的cDNA的合成方法使用1个纵列上至少设置有2个突起状围壁的上述本 发明的反应治具。上述合成方法包括上述2个突起状围壁的液滴保持用空间中按顺序分 别保持含有表面张力降低试剂的细胞溶解用溶液和含有表面张力降低试剂的cDNA合成用 溶液的液滴，在与基板的具有突起状围壁的表面相反一侧的表面使用磁石，使固定于磁珠 上的mRNA在上述2个突起状围壁的液滴保持用空间所保持的溶液中按顺序移动，制得固定 于磁珠上的cDNA。在上述本发明的cDNA合成方法中，如上所述，反应治具优选将具有突起状围壁的 表面朝下使用。若将具有突起状围壁的表面朝下使用，则突起状围壁所收纳的液滴呈悬滴 状，可获得抑制水分蒸发和促进磁珠搅拌的效果。上述本发明的cDNA的合成方法优选使用1个纵列上至少设置有4个突起状围壁 的反应治具。上述4个突起状围壁(例如〃字形突起)的空间中按顺序分别保持有细胞溶 解用溶液、mRNA清洗用溶液、cDNA合成用溶液和cDNA清洗用溶液的液滴(参照图3)，在与 基板的设置有突起的相反一侧的表面使用磁石，使固定于磁珠上的mRNA在上述4个突起状 围壁的空间所保持的溶液中按顺序移动。由此，制得固定于磁珠上的cDNA。本发明cDNA合成方法所使用的反应治具的〃字形突起空间容量例如为0. 5 100 μ 1的范围是合适的。第1个〃字形突起的空间所保持的细胞溶解用溶液可以是例如含有IOOmM Tris HCl (pH7. 5)、500mM LiCl、1 %十二烷基硫酸锂、5mM 二硫苏糖醇的总量为3 μ 1的溶液。第2个〃字形突起的空间所保持的mRNA清洗用溶液可以是含有IOmM Tris HCl (ρΗ7. 5)、0· 15Μ LiCl、0. 1 %十二烷基硫酸锂的总量为3 μ 1的溶液。第3个〃字形突起的空间所保持的逆转录反应用清洗液可以是含有50mM Tris HCl (pH8. 3)、75mM KCl、3mM MgCl2、0. 1% TritonX-100,0. 5mM dNTP、5mM DTT、2 单位 RNA 酶 抑制剂的总量为3μ1的溶液。第4个〃字形突起的空间所保持的逆转录反应溶液可以是含有50mM Tris HCl (pH8. 3)、75mM KCl、3mM MgCl2、0. 1% Triton X_100、0. 5mM dNTP、5mM DTT、2 单位 RNA 酶 抑制剂、8单位superscript III逆转录酶的总量为3μ 1的溶液。但是，这些均为例示，并无限定于这些溶液的意图。准备固定于磁珠上的mRNA。mRNA的种类和长度等无特殊限制。可使用各种源自生 物的mRNA。作为磁珠，可使用例如粒子系统2. 8 μ m、表面共价结合有oligo dT25的磁珠。 mRNA向磁珠的固定可如下实施。
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将磁珠在细胞溶解用溶液中混悬成浓度为10mg/ml，向其中加入1至100个细胞。 通过上述操作，细胞内的mRNA经由其polyA尾结合于固定在磁珠上的oligo dT25。在与基板的设置有突起的表面相反一侧的表面使用磁石，使固定于磁珠上的mRNA 在上述4个〃字形突起的空间所保持的溶液(液滴)中按顺序移动。作为磁石，可使用例 如小型钕磁石。使其在各液滴中滞留反应或清洗所必需的时间。反应或清洗所需要的时间 因反应条件、清洗条件而不同，可以是例如1秒 1小时的范围。上述反应和清洗可在常温(室温)下进行，但根据需要也可进行温度调节。此外， 当液滴的量为少量时，由于溶液中的溶剂可能会蒸发，所以优选将反应治具放入密闭容器， 通过使容器中的湿度保持恒定，防止溶剂的蒸发。为使容器中的湿度保持恒定，可使含有水 或适当的水溶液的容器共存于上述密闭容器中。使固定于磁珠上的mRNA按顺序滞留和通过上述4个〃字形突起的空间所保持的 溶液(液滴)，由此可制得固定于磁珠上的cDNA。制得的cDNA可不从磁珠上取下而用于以 后的工序。在上述cDNA的合成方法中，使用在多个(例如2 50个)的纵列上至少设置有 4个〃字形突起的反应治具，各横列的〃字形突起所保持的溶液相同，固定于纵列移动的磁 珠上的mRNA为不同种类的mRNA ；作为固定于磁珠上的cDNA，可制得多个不同种类的cDNA。使用抗体结合磁珠的反应例如图4所示。图4是从下部观察反应治具时的图，液 滴呈悬滴状。在该反应中，利用结合有与目的抗原相对应的特异性抗体的磁珠。事先在第1列点加抗体磁珠(0. 1 % Triton X-100、150mM NaClUOmM磷酸钠-钾 缓冲液，PH7. 0，粒子系2.8μπι LOym的抗体结合磁珠25 μ g/3 μ 1)，在第2列点加分析 物样品，在第3列点加清洗液(0. 1% Triton X_100、150mM NaCl、IOmM磷酸钠-钾缓冲液， PH7. 0)，在第4列点加标记抗体(其为对目的抗原具有特异性，与固定于磁珠的抗体识别不 同的抗原表位的抗体。是进行碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光色素标记或金粒子等 标记的抗体)，在第5列点加清洗液，在第6列点加发色液。需说明的是，形成点的各溶液的 组成只是例示，并无限定于上述组成的意图。使用小型磁石，使第1列液滴内的抗体磁珠移动至第2列的分析物样品液滴中，进 行例如室温下10分钟至60分钟的抗原-抗体反应。在此期间，将板翻转或用磁石使落至 液滴底部的磁珠移动至板上部，对磁珠进行搅拌。使磁珠移动至第3列的清洗液中后，对磁珠进行例如5分钟的搅拌·清洗。使磁珠移动至第4列的标记抗体液滴中后，进行例如室温下10分钟至60分钟的 抗原-抗体反应。在此期间，将板翻转或用磁石使落至液滴底部的磁珠移动至板上部，对磁 珠进行搅拌。使磁珠移动至第5列的清洗液中后，对磁珠进行例如5分钟的搅拌·清洗。使磁珠向第6列的发色液滴移动后，进行对应于标记化合物的发色或化学发光反 应。当磁珠妨碍检测时，停止反应时，也可使磁珠向第7列移动，测定第6列液滴的发色或 化学发光。如此可使用抗体结合磁珠进行反应。在图5中示出了在1种样品中检测出多个抗原的方法的实例。其中，示出了从1 种分析物同时检测出3种抗原的实例。
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在第1列的液滴保持用突起1、2、3中点加对抗原A、B、C具有特异性的抗体磁珠。事先在第2列点加分析物样品，在第3列点加清洗液(0. 1% Triton X_100、150mM NaCl、IOmM磷酸钠-钾缓冲液，pH7. 0)，在第4列点加标记抗体(其为对目的抗原具有特异 性，与固定于磁珠的抗体识别不同的抗原表位的抗体。是进行碱性磷酸酶标记、过氧化物酶 标记、荧光色素标记或金粒子等标记的抗体)，在第5列点加清洗液，在第6列点加发色液。 需说明的是，形成点的各溶液的组成只是例示，并无限定于上述组成的意图。使第1列的液滴保持用突起1的抗体磁珠移动至第2列的分析物样品液滴。进行 例如室温下10分钟至60分钟的反应使抗原A结合于磁珠1后，使磁珠移动至第3列的清 洗液滴1。使第1列的液滴保持用突起2的抗体磁珠移动至第2列的分析物样品液滴。进行 例如室温下10分钟至60分钟的反应使抗原B结合于磁珠2后，使磁珠移动至第3列的清 洗滴2。使第1列的液滴保持用突起3的抗体磁珠移动至第2列的分析物样品液滴。进行 例如室温下10分钟至60分钟的反应使抗原C结合于磁珠3后，使磁珠移动至第3列的清 洗滴3。使磁珠1、2、3分别移动至第4列的标记抗体液滴1、2、3后，进行例如室温下10分 钟至60分钟的抗原-抗体反应。使磁珠1、2、3分别移动至第5列的清洗液滴1、2、3。使磁珠1、2、3分别移动至第6列的发色液滴1、2、3，进行一定时间的发色或化学发 光反应，用检测器测定得到的发色或发光。这样可实施检测多个抗原的方法。
实施例以下通过实施例对本发明进行更详细的说明。如图2所示，切下塑料板(127mmX86mmX15mm)50的底面，在此嵌入薄层玻璃板 (厚度0. 15mm) 10或塑料板(厚度0. 15mm)。由于小型钕磁石的磁力不足，所以将板底面换
成薄板。在上述薄层玻璃板上压合石蜡树脂膜(商品名parafilm(4 > ^ ))11。对 于石蜡树脂膜而言，在与伸缩方向垂直的方向形成有细微的沟，此沟在磁珠移动时发挥导 向作用。石蜡树脂膜使得郁金香形突起等的制备容易。在上述石蜡树脂膜上预先使用治具形成所需要数量的郁金香形突起。石蜡树脂膜 上所形成的本突起(本突起)是使磁珠的清洗、酶反应等所使用的溶液稳定保持于膜上的 〃字形突起。参照图2。具有1 16列、A行 H行的郁金香形突起。石蜡树脂膜对于纯 水的接触角为112°。需说明的是，石蜡树脂、特氟隆树脂、有机硅树脂、玻璃板、丙烯酸酯板和铜板对于 纯水的接触角和对于0. 1% Triton X 100 (表面活性剂)水溶液的接触角如下表1所示。测定如下进行。通过显微镜对将3μ 1纯水在各种材料表面静置5分后的液滴状 态进行观察。测定液滴的高度A和与材料表面接触的边的长度B，通过以下计算式求出水的 接触角θ。
[数1]
权利要求
反应治具，其特征在于基板一侧的表面排列设置有多个突起状围壁，所述突起状围壁至少具有1个凹口部，且在内部具有可保持液滴的空间，并且所述基板表面的至少保持所述液滴的面对于纯水的接触角为90～150°的范围。
2.权利要求1的反应治具，其中，所述多个突起状围壁至少部分或全部纵横地排列设置。
3.权利要求1或2的反应治具，其中，所述突起状围壁的液滴保持用空间可保持 0. 5 μ L 200 μ L范围的量的液滴。
4.权利要求1 3中任1项的反应治具，其中，突起状围壁具有2个或3个凹口部，所 述凹口部开口的间隔为0.5 IOmm的范围。
5.权利要求1 4中任1项的反应治具，其中，所述基板表面由石蜡树脂、特氟隆树脂 或有机硅树脂构成。
6.权利要求1 4中任1项的反应治具，其中，所述基板具有由石蜡树脂、特氟隆树脂 或有机硅树脂构成的涂层。
7.权利要求1 6中任1项的反应治具，其中，使用所述反应治具以在各突起状围壁的 液滴保持用空间中，将相同或不同种类溶液的液滴不与置于其它突起状围壁的液滴保持用 空间部分的液滴混合地保持。
8.权利要求1 7中任1项的反应治具，其中，使用所述反应治具以在属于同一横列的 突起状围壁的液滴保持用空间中保持同一种类溶液的液滴。
9.权利要求7或8的反应治具，其中，所述溶液为含有表面张力降低试剂的反应液或清 洗液。
10.权利要求1 9中任1项的反应治具，所述反应治具进一步具有覆盖具有突起状围 壁的表面的覆盖部件，且进一步具有为所述覆盖部件所覆盖的空间提供湿气的保湿部件。
11.反应方法，所述反应方法包括通过使用权利要求1 10中任1项的反应治具，在与所述基板的具有突起状围壁的表面相反一侧的表面使用磁石，使固定于磁珠上的 物质在上述突起状围壁的液滴保持用空间所保持的含有表面张力降低试剂的溶液的液滴 中按顺序移动，从而进行反应和/或清洗。
12.cDNA的合成方法，所述合成方法包括使用1个纵列至少设置有2个突起状围壁的权 利要求1 10中任1项的反应治具，在所述2个突起状围壁的液滴保持用空间中按顺序分别保持含有表面张力降低试剂 的细胞溶解用溶液和cDNA合成用溶液的液滴， 在与基板的具有突起状围壁的表面相反一侧的表面使用磁石，使固定于磁珠上的mRNA 在所述2个突起状围壁的液滴保持用空间所保持的溶液中按顺序移动， 制得固定于磁珠上的cDNA。
13.权利要求12的方法，其中，使用多个纵列中至少设置有2个突起状围壁的反应治具，各横列的突起状围壁的液滴保持用空间所保持的溶液为同一种类的溶液， 固定于纵列移动的磁珠上的mRNA为不同种类的mRNA， 作为固定于磁珠上的cDNA，制得多个不同种类的cDNA。
14.权利要求12或13的方法，其中，所述反应治具在1个纵列中至少设置有4个突起状围壁，所述4个突起状围壁的液滴保持用空间按顺序分别保持细胞溶解用溶液、mRNA清洗用 溶液、cDNA合成用溶液和cDNA清洗用溶液的液滴，将固定于磁珠上的mRNA在所述4个突起状围壁的液滴保持用空间所保持的溶液中按 顺序移动。
15.权利要求11 14中任1项的方法，其中，将具有突起状围壁的表面朝下来使用所 述反应治具。
全文摘要
本发明提供每次操作不需要清洗或更换移动溶液等所使用的器具，可平行进行多种反应和清洗操作的装置和方法。本发明提供如下反应治具，其中基板一侧的表面排列设置有多个突起状围壁，所述突起状围壁至少具有1个凹口部，且在内部具有可保持液滴的空间，并且所述基板表面的至少保持所述液滴的面对于纯水的接触角为90～150°的范围。本发明还提供如下反应方法，所述方法包括使用所述反应治具，在与所述基板的具有突起状围壁的表面相反一侧的表面使用磁石，使固定于磁珠上的物质在所述突起状围壁的液滴保持用空间所保持的含有表面张力降低试剂的溶液的液滴中按顺序移动，从而进行反应和/或清洗。
文档编号B08B3/04GK101939427SQ200980102879
公开日2011年1月5日 申请日期2009年1月16日 优先权日2008年1月18日
发明者矶部正治, 黑泽信幸 申请人:国立大学法人富山大学