专利名称：一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法
技术领域：
本发明涉及医学临床上使用的检测方法，确切地说是一种同时检测精子脱氧核糖 核酸碎片及膜完整性的方法。
背景技术：
精子膜完整性与精子代谢、顶体反应、精子获能及精卵融合密切相关，测定精子膜 是否完整可以准确地反映精子功能并预测精子潜在受精能力。自1984年建立精子尾部低 渗肿胀实验测定人精子膜功能以来，精子尾部低渗肿胀实验已成为目前不多的几个评价精 子膜功能的检测方法之一，越来越广泛地运用于男性生殖避孕的基础研究和不育的临床诊 治中。细胞的物质交换和新陈代谢活动依靠细胞膜进行，精子在男、女性生殖道中极易受到 各种化学物质影响，精子膜对这些物质的传递能力直接影响精子的活力和新陈代谢，从而 关系到能否获能，完成受精的全过程。因此，评价精子膜功能在精子功能检测中具有重要意 义。但是，单纯的精子低渗肿胀实验只能确定一个精子膜是否完整，而不能鉴别其DNA是否 完整，而仅单纯检测精子膜的完整性，而不检测精子脱氧核糖核酸碎片的完整性还不能准 确地判断精子的活性，因此，现有的实验方法难以准确判断出同一条精子的膜及DNA是否 有损伤，即难以对精子的质量作出精确的评价。
发明内容
本发明的目的，是提供了一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方 法，它可解决现上述技术存在的问题，它是将精子低渗肿胀实验与精子染色质扩散实验两 个实验有机地结合在一起，其优点是可以同时显示同一条精子其膜是否完整及染色质是否 完整，可辅助人们精确判断精子的质量。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片 及膜完整性的方法，其步聚如下
Φ制备低渗液
低渗液为每IOOml蒸馏水中含0. 735g柠檬酸钠和1. 35g果糖，渗透压是150m0sm的溶
液；
Θ制备伊红-吉姆萨染液
向每IOOml的0. 9%的生理盐水中加入0. 5g伊红和0. Ig吉姆萨，混勻，使其充分溶解， 配成染液，再用双层滤纸过滤，所得滤液即伊红_吉姆萨染液，伊红_吉姆萨染液置于22°C 室温内保存备用；
③单纯精子低渗肿胀实验向每Iml步骤①中所述的低渗液中加入0. Iml精液，混勻，在水温为37°C的水中水浴
30分钟后，得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；
Φ取Iml步骤 中所述的低渗处理后精液，用离心机以1000转/分的转速离心处理5
分钟，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液稀释到10X106/ml ；
S取0. 2ml步骤③中所述的稀释精液与琼脂凝胶按体积比1 :1比例混勻后，放置在离
心管内，在室温37 °C条件下孵育5分钟得配制精液；
吸取50 1步骤G中所述的配制精液置入载玻片上，加盖盖玻片，在环境温度4°C的
条件下放置4分钟；所述载玻片是表面设有干燥的琼脂层的载玻片；
CD将步骤 中所述的载玻片去除盖玻片，在室温22 °C条件下放入摩尔浓度为
0. 081mol/L的HCl溶液内浸泡7分钟；
在22°C室温下向步骤Θ所述的载玻片上加入50 1的0. 4mol/L的三羟甲基氨基甲 烷，50 1的0. 8mol/L的二硫苏糖醇和50 1的1% (重量)的磺化琥珀酸N —月桂基单酰 胺二钠盐，上述三种溶液混合将载玻片浸泡5分钟，浸泡5分钟后的载玻片制成标本片；
将步骤 中所述的标本片用缓冲液冲洗2分钟，所述缓冲液中各物质含量为三羟
甲基氨基甲烷0. 09mol/L和乙二胺四乙酸0. 002mol/L ；
将所述标本片分别放入70%、90%和100%的乙醇中各脱水2分钟；
经步骤③脱水后的标本片在空气中自然干燥后加入染液染色，在显微镜下观察结^ ο为进一步实现本发明的目的，还可以采用以下技术方案实现步骤①中所述的蒸
馏水是双蒸水。步骤Q中所述的染液是4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，加入染色后在日本产 型号Nikon-ElOOO的荧光显微镜下观察结果。步骤2中所述的染液是瑞-吉氏染液，加入
染色后在自然光显微镜下观察精子。步骤 中所述的载玻片按以下方法制作先用琼脂浇 制于载玻片表面，再在80°C的环境下将其表面的琼脂干燥。步骤Φ中所述的低渗液的离子 强度为0. 15。步骤 中所述的离心管是1. 5ml的离心管。本发明的有益效果在于它将精子低渗肿胀实验与精子染色质扩散实验结合起来 进行，共测定42例正常生育男性得出与单独应用精子低渗肿胀实验不同的结论，即精子在 低渗溶液里进行肿胀实验后，接着进行精子染色质扩散实验，得到的精子形态变化及DNA改变共有4种类型(A-D)，其中A型精子是精子膜与染色质均完整的，精子是具有活动能力 或是活的，B型精子是具有大光晕或中光晕而尾部未肿胀的精子，即精子尾部膜损伤，我们 观察到这种精子是有活动能力的精子；如果单纯用精子低渗肿胀实验判断，结果这种B型 精子就是死的或没有活动能力的精子；而C型精子是尾部肿胀而具有小光晕或无光晕的精 子，这种精子在单纯精子低渗肿胀实验里就判断为活动的精子，因为精子尾膜是肿胀的，即 完整的。我们的实验结果证实了单纯精子低渗肿胀实验对于判断精子活动能力和膜的完 整性是不完全的，对于A型精子和D型精子，单纯精子低渗肿胀实验和精子低渗肿胀实验/ 精子染色质扩散实验结合实验判断结果是一致的，即A型精子是活动的和头膜_尾膜完整 的精子，D型精子是DNA和膜均损伤的精子，是死亡的精子，但对B型精子，单纯精子低渗肿 胀实验只能判断其为死精子，实际上这种精子是活精子，而对C型精子的判断，单纯精子低 渗肿胀实验则判断为活精子，实际上这种精子是死精子，应用精子低渗肿胀实验/精子染 色质扩散实验结合实验，就能对这些精子做出正确判断。精子低渗肿胀实验/精子染色质 扩散实验结合实验即H0S/SCD结合实验，精子低渗肿胀实验即H0S，精子染色质扩散实验即 SCD。
* P<0. 01及** P<0. 001，与单纯HOS实验比较。
图1是单纯S⑶显示大光晕及中光晕的精子的图橡，标注为(S⑶+)；图2是进 行H0S/SCD结合实验后的图像，其中1号精子为小光晕而尾部不肿胀的精子，即D型精 子，2号精子是无光晕的精子，3、4和5号精子是具有大光晕且尾部肿胀的精子，标注为 (SCD+)-(HOS+)；图3是精子具有大光晕且尾部肿胀的精子的图像；图4是具有大光晕而 尾部未肿胀的精子的图像；图5是具有中光晕且尾部肿胀的精子的图像；图6是精子具有 中光晕且尾部未肿胀的精子的图像；图7是具有小光晕且尾部肿胀的精子的图像；图8是 具有小光晕且尾部未肿胀的精子的图像；图9是无光晕而尾部肿胀的精子的图像；图10是 无光晕尾部也未肿胀的精子的图像；图11是双头精子且尾部为肿胀的图像；图12是针尖 头样精子且尾部未肿胀的图像；图13是无光晕而尾部肿胀的退化的精子的图像；图14是 无光晕尾部也不肿胀的精子的图像。上述图像都是在显微镜下放大1000倍所观察到的。
具体实施例方式本发明所述一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其特征在于其步聚如下 +Φ制备低渗液
低渗液为每IOOml蒸馏水中含0. 735g柠檬酸钠和1. 35g果糖，渗透压是150m0sm的溶
液；
S)制备伊红-吉姆萨染液
向每IOOml的0. 9%的生理盐水中加入0. 5g伊红和0. Ig吉姆萨，混勻，使其充分溶解， 配成染液，再用双层滤纸过滤，所得滤液即伊红_吉姆萨染液，伊红_吉姆萨染液置于22°C 室温内保存备用；
单纯精子低渗肿胀实验
向每Iml步骤Φ中所述的低渗液中加入0. Iml精液，混勻，在水温为37°C的水中水浴
30分钟后，得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；
Φ取Iml步骤③中所述的低渗处理后精液，用离心机以1000转/分的转速离心处理5
分钟，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液稀释到10X106/ml ；
取0. 2ml步骤Φ中所述的稀释精液与琼脂凝胶按体积比1 :1比例混勻后，放置在离
心管内，在室温37 °C条件下孵育5分钟得配制精液；
吸取50 1步骤 中所述的配制精液置入载玻片上，加盖盖玻片，在环境温度4°C的
条件下放置4分钟；所述载玻片是表面设有干燥的琼脂层的载玻片；
①将步骤 中所述的载玻片去除盖玻片，在室温22 °C条件下放入摩尔浓度为
0. 081mol/L的HCl溶液内浸泡7分钟；
在22°C室温下向步骤Θ所述的载玻片上加入50 1的0. 4mol/L的三羟甲基氨基甲 烷，50 1的0. 8mol/L的二硫苏糖醇和50 1的1% (重量)的磺化琥珀酸N —月桂基单酰 胺二钠盐，上述三种溶液混合将载玻片浸泡5分钟，浸泡5分钟后的载玻片制成标本片；
③将步骤 中所述的标本片用缓冲液冲洗2分钟，所述缓冲液中各物质含量为三羟
甲基氨基甲烷0. 09mol/L和乙二胺四乙酸0. 002mol/L ；
将所述标本片分别放入70%、90%和100%的乙醇中各脱水2分钟；
Q经步骤Θ脱水后的标本片在空气中自然干燥后加入染液染色，在显微镜下观察结^ O 结果判断标准计数500个精子，观察精子光晕大小及尾部肿胀情况。分为大、中、 小和无光晕4个等级(A-D)。
A型尾肿胀(H0S+)而具有大光晕或中光晕(SCD+)的精子，判断为尾膜及DNA均 完整的精子，(SCD+) — (H0S+)。B型尾不肿胀(H0S-)而具有大光晕或中光晕(SCD+)的精子，判断为尾膜损伤而 DNA均完整的精子，(SCD+) — (H0S-)。C型尾肿胀(H0S+)而具有小光晕或无光晕的精子，判断为尾膜完整而DNA损伤 的精子，(SCD-)-(HOS+)。D型尾不肿胀(H0S-)而具有小光晕或无光晕的精子，判断为尾膜及DNA均损伤 的精子，判断为尾膜一头膜均损伤的精子，(SCD -)-(H0S -)。小光晕以<精子头直径四分之一为判断标准；中光晕>精子头直长四分之一，而 <精子头直径三分之二 ；大光晕>精子头直径三分之二。步骤 中所述的蒸馏水是双蒸水。若步骤《3中所述的染液是4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，则加入染色后，在日本产型 号Nikon-ElOOO的荧光显微镜下观察结果，其观察效果较好。若步骤Q中所述的染液是瑞-吉氏染液，则加入染色后在自然光显微镜下观察精 子，其观察效果较好。步骤 中所述的载玻片按以下方法制作先用琼脂浇制于载玻片表面，再在80°C 的环境下将其表面的琼脂干燥。步骤 中所述的低渗液的离子强度为0. 15。
步骤 中所述的离心管是1. 5ml的离心管。 所述的0. 9%的生理盐水是，称取0. 9克氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，再用蒸馏水 稀释到100毫升。 本发明未详尽描述的技术内容均为公知技术。
8
权利要求
一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其特征在于其步聚如下制备低渗液低渗液为每100ml蒸馏水中含0.735g柠檬酸钠和1.35g果糖，渗透压是150mOsm的溶液；制备伊红 吉姆萨染液向每100ml的0.9%的生理盐水中加入0.5g伊红和0.1g吉姆萨，混匀，使其充分溶解，配成染液，再用双层滤纸过滤，所得滤液即伊红 吉姆萨染液，伊红 吉姆萨染液置于22℃室温内保存备用；单纯精子低渗肿胀实验向每1ml步骤中所述的低渗液中加入0.1ml精液，混匀，在水温为37℃的水中水浴30分钟后，得低渗处理后精液，观察200个精子，计算尾部肿胀的精子比率；取1ml步骤中所述的低渗处理后精液，用离心机以1000转/分的转速离心处理5 分钟，静置分层后，弃上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸盐缓冲液稀释到10×106/ml；取0.2ml步骤中所述的稀释精液与琼脂凝胶按体积比11比例混匀后，放置在离心管内，在室温37℃条件下孵育5分钟得配制精液；吸取50 l步骤中所述的配制精液置入载玻片上，加盖盖玻片，在环境温度4℃的条件下放置4分钟；所述载玻片是表面设有干燥的琼脂层的载玻片；将步骤中所述的载玻片去除盖玻片，在室温22℃条件下放入摩尔浓度为0.081mol/L的HCl溶液内浸泡7分钟；在22℃室温下向步骤所述的载玻片上加入50 l 的0.4mol/L的三羟甲基氨基甲烷，50 l的 0.8mol/L的二硫苏糖醇和50 l的1%(重量)的磺化琥珀酸N－月桂基单酰胺二钠盐，上述三种溶液混合将载玻片浸泡5分钟，浸泡5分钟后的载玻片制成标本片；将步骤中所述的标本片用缓冲液冲洗2分钟，所述缓冲液中各物质含量为三羟甲基氨基甲烷0.09mol/L和乙二胺四乙酸0.002mol/L；将所述标本片分别放入70%、90%和100%的乙醇中各脱水2分钟； 经步骤脱水后的标本片在空气中自然干燥后加入染液染色，在显微镜下观察结果。2010102497415100001dest_path_image002.jpg,2010102497415100001dest_path_image004.jpg,dest_path_image006.jpg,496291dest_path_image002.jpg,dest_path_image008.jpg,773558dest_path_image006.jpg,dest_path_image010.jpg,892824dest_path_image008.jpg,2010102497415100001dest_path_image012.jpg,459328dest_path_image010.jpg,2010102497415100001dest_path_image014.jpg,546101dest_path_image012.jpg,2010102497415100001dest_path_image016.jpg,2010102497415100001dest_path_image018.jpg,2010102497415100001dest_path_image020.jpg,2010102497415100001dest_path_image022.jpg,2010102497415100001dest_path_image024.jpg,2010102497415100001dest_path_image026.jpg,417937dest_path_image024.jpg
2.根据权利要求1所述的一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步骤S中所述的蒸馏水是双蒸水。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步骤S中所述的染液是4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，加入染色 后在日本产型号 Nikon-ElOOO的荧光显微镜下观察结果。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步骤Θ中所述的染液是瑞-吉氏染液，加入染色后在自然光显微镜下观察精子。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其特征在于步骤 中所述的载玻片按以下方法制作先用琼脂浇制于载玻片表面，再在 80°C的环境下将其表面的琼脂干燥。
6.根据权利要求1所述的一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步骤Φ中所述的低渗液的离子强度为0. 15。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其 特征在于步骤③中所述的离心管是1. 5ml的离心管。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测精子脱氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其步聚如下①制备低渗液；②制备伊红-吉姆萨染液；③单纯精子低渗肿胀实验；④离心处理步骤③中所述的低渗处理后精液，弃上清液，并稀释；⑤将步骤④中所述的稀释精液与琼脂凝胶按比例混匀后，进行孵育5分钟得配制精液；⑥将步骤⑤中所述的配制精液置入载玻片上；⑦将所述的载玻片在HCl溶液内浸泡；⑧向所述的载玻片上加入三羟甲基氨基甲烷、二硫苏糖醇和磺化琥珀酸N－月桂基单酰胺二钠盐浸泡成标本片；⑨将步骤⑧中所述的标本片用缓冲液冲洗；⑩将所述标本片脱水； 经步骤⑩脱水后的标本片干燥后加入染液染色。
文档编号G02B21/34GK101907620SQ20101024974
公开日2010年12月8日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者张丽红, 王磊光, 邱毅 申请人:山东省计划生育科学技术研究所