用于微流体器件的光学透镜系统和方法
【专利摘要】本发明提供用于微流体器件的光学透镜系统和方法。一种给来自微流体器件（205）的一种或多种选定的荧光指示成像的装置。该装置包括成像通路，该成像通路耦合到至少一个微流体器件（205）中的至少一个反应室。该成像通路可传输从至少一个微流体器件（205）的至少一个反应室中的一个或多个样品那儿获得的一个或多个荧光发射信号。该反应室具有一定的反应室大小，该反应室大小的特征在于其实际空间维度与成像通路正交。
【专利说明】用于微流体器件的光学透镜系统和方法
[0001] 本发明专利申请是国际申请日为2005年6月7日、申请号为200910246173.0、名称为“用于微流体器件的光学透镜系统和方法”的发明专利申请的分案申请，而后者是国际申请日为2005年6月7日、申请号为200580025595.5、名称为“用于微流体器件的光学透镜系统和方法”的发明专利申请的分案申请。
_2] 有关申请的交叉参照
[0003]本申请要求2004年6月7日提交的美国临时申请60/578，106的优先权。
【技术领域】
[0004]本发明一般涉及微流体技术。特别是，本发明提供用于给微流体器件的室内的(例如悬浮在流体体积中的)一个或多个实体成像的方法和系统。更具体地讲，这种成像方法和系统利用了与微流体器件中的一个或多个实体有关的荧光信号指示。仅作为示例，通过使用耦合到微流体器件的荧光、化学发光和生物发光读出器，来应用微流体方法和系统技术，但是将会认识到本发明具有更广的应用范围。
[0005]经共同努力已开发并制造出各种微流体系统，来执行化学和生物化学的各项分析与综合。这些系统已被开发成用于各项制备和分析应用。制造这种微尺寸器件的目标源自常规大尺度分析与综合(这通常很笨重且不太有效)的小型化过程所实现的诸多重要益处。通过使用这些微流体系统，便实现了时间大幅减少、成本更低、空间分配更有效等诸多益处。对于使用这些微流体器件的自动化系统而言，附带的好处可以包括人工操作更少。自动化系统还减少了操作人员的过失以及其它和操作人员有关的局限。已经提出，微流体器件可用于各种应用，其中包括毛细电泳、气体层析和细胞分离。
[0006]适于进行核酸扩增过程的微流体器件有可能有广泛的应用。例如，这种器件作为一种分析工具，可以用于确定在样品中是否存在`特定的靶核酸。利用微流体器件作为分析工具的示例包括:
[0007].鉴定过程(例如，亲子鉴定和法医学应用)；
[0008].检测和表征与特定疾病或遗传病相关联的特定核酸；
[0009]?检测与特定药物行为相关联的基因表达分布型/序列(例如药物遗传学，即选择对特定遗传概况相容的/特别有效的/无害的药物)；以及
[0010].进行基因型分析和基因表达分析(例如，差别基因表达研究)。
[0011]或者，该器件可以按制备方式用于核酸扩增，从而产生足以进行进一步分析的水平的扩增产物。这些分析方法的示例包括扩增产物的测序、细胞分型、DNA指纹鉴定等。扩增产物也可用于各种遗传工程应用。这些遗传工程应用包括(但不限于)生产所需蛋白质产物，这是通过将扩增产物插入载体，然后用该载体转化细胞使其产生所需蛋白质产物完成的。
[0012]尽管有这些潜在的应用，适用于从这种微流体器件中收集并处理成像数据(例如，荧光数据)的成像系统(也被称为读出器)具有各种缺点。一些常规的读出器按扫描模式工作，其中激光束在微流体器件上进行光栅扫描。在其它这样的系统中，器件被平移，或者激光和器件同时平移。这些扫描器按照和激光源/器件的光栅扫描相关联的有序方式，从微流体器件中存在的反应室中收集荧光数据。其它常规的扫描器按缝合模式工作，按顺序地给小区域(例如，尺寸小于Imm2的区域)成像，并且将这些小图像缝合到一起，从而形成测试中的微流体器件的图像。
[0013]扫描和缝合模式都有缺点。例如，两种类型的系统都工作在相对低的系统频率下，而系统频率作为时间的函数正比于成像面积。常规系统的工作频率在每分钟l_20cm2的量级。对于某些感兴趣的试验，比如蛋白质热量测定和核酸扩增，通常需要大于约每分钟l-20cm2的系统频率，以便对微流体器件的反应器皿中发生的荧光过程进行成像。常规的扫描和缝合系统无法满足这些性能目标。除了使系统通量放缓以外，这些扫描和缝合系统还会限制利用某些试验(例如，实时PCR的性能)的可能性。
[0014]因此，本领域需要改进的方法和系统，来对微流体器件的反应室中的流体体积中悬浮的一个或更多的实体进行成像。
【发明内容】
[0015]根据本发明，提供了用于微流体系统的技术。特别是，本发明提供了用于给微流体器件的反应室中的流体体积中悬浮的一个或多个实体成像的方法和系统。更具体地讲，本发明的成像方法和系统利用了与微流体器件中的一个或多个实体相关联的荧光信号指示。仅仅作为示例，通过使用和微流体器件相耦合的荧光、化学发光和生物发光读出器，来应用微流体方法和系统技术，但是将会认识到本发明具有更广的应用范围。
[0016]在特定的实施例中，本发明提供了 一种给微流体器件中的一个或多个选出的荧光指示成像的装置。该装置包括成像通道，耦合到至少一个微流体器件中的至少一个反应室。该成像通道用于传输从上述至少一个微流体器件的至少一个反应室中的一个或多个样品那儿获得的一个或多个荧光发射信号。该反应室具有一定的大小，其实际空间维度与成像通道正交。该装置还包括耦合到成像通道的光学透镜系统。该光学透镜系统用于传输与该反应室有关的一个或多个荧光信号。
[0017]在另一个特定的实施例中，提供了一种用于给微流体器件的至少一个反应室中的一个或多个选出的荧光指示成像的方法。该方法包括:沿耦合到至少一个反应室的成像通道，传输从至少一个微流体器件的至少一个反应室内的一个或多个样品那儿获得的一个或多个荧光发射信号。上述至少一个反应室具有一定的大小，其实际空间维度与成像通道正交。该方法还包括:通过耦合到成像通道的光学透镜系统，传输与该反应室相关联的一个或多个荧光发射信号。该光学透镜系统用于将实际空间尺寸的大小减小到确定的水平。
[0018]在本发明的另一个特定实施例中，提供了一种用于给微流体器件的一个或多个反应室内的一个或多个指示成像的系统。该系统包括光学通道，该光学通道能够传输微流体器件的空间区域的一部分的一个或多个图像。在一个实施例中，上述微流体器件的空间区域的那部分具有第一尺寸。该系统还包括第一透镜系统，它耦合到上述光学通道的第一部分。该第一透镜系统具有第一光学特性。该系统还包括第二透镜系统，它耦合到上述光学通道的第二部分。第二透镜系统具有第二光学特性。该系统另外包括检测器，该检测器耦合到上述光学通道的第三部分。该检测器可用于给上述空间区域的那部分拍摄一个或多个图像。此外，该检测器适用于拍摄一个或多个图像。在该检测器处，上述一个或多个图像具有确定的尺寸，约为第一尺寸或更小。
[0019]在可选实施例中，提供了一种给微流体器件的一个或多个反应室的一个或多个指示成像的方法。该方法包括:沿光学通道，传输微流体器件的空间区域的一部分的一个或多个图像。上述微流体器件的空间区域的那部分具有第一尺寸。该方法还包括:将第一透镜系统耦合到光学通道的第一部分。第一透镜系统具有第一光学特性。该方法另外包括:将第二透镜系统耦合到光学通道的第二部分。第二透镜系统具有第二光学特性。此外，该方法包括:用检测器给上述空间区域的那部分拍摄一个或多个图像。该检测器耦合到光学通道的第三部分，并且在检测器处，一个或多个图像具有确定的尺寸，约为第一尺寸或更小。
[0020]在另一个可选实施例中，提供了一种给微流体器件成像的方法。该方法包括:在小于一分钟的时间范围内，通过使用图像检测空间区域，给和至少确定数目的微流体器件反应室相关联的空间区域拍摄图像。在特定的实施例中，上述空间区域的图像拍摄基本上不受缝合和/或扫描过程的影响。
[0021]在另一个可选实施例中，提供了 一种给微流体器件的一个或多个选出的荧光指示成像的装置。该装置包括成像通道，该成像通道耦合到至少一个微流体器件的至少一个反应室。该成像通道用于传输从上述至少一个微流体器件的至少一个反应室内的一个或多个样品那儿获得的一个或多个荧光发射信号。该装置还包括滤光器件，它耦合到成像通道(用于传输一个或多个发射信号)的第一空间部分。滤光器件用于传输一个或多个突光发射信号的选定光谱带宽，还用于将与一个或多个荧光发射信号相关联的一种或多种色差处理到确定的程度。
[0022]在特定的实施例中，提供了一种在弹性微流体器件中分析各种处理的方法。该方法包括:在不到一分钟的时间周期内，拍摄至少96个反应室的图像。在一个实施例中，这至少96个反应室处于彼此之间的流体隔离状态。该方法还包括处理该图像。
[0023]在另一个特定实施例中，提供了一种用于给包括多个处理位置的微流体器件成像的装置。上述多个处理位置包含选自M个样品的至少一个样品以及选自N种试剂的至少一种试剂。该装置包括照明系统，该照明系统耦合到微流体器件并用电磁辐射照亮该微流体器件。该装置还包括成像系统，该成像系统耦合到微流体器件并用于接收从多个处理位置发射过来的电磁辐射。该装置另外包括耦合到成像系统的检测器。
[0024]在另一个特定实施例中，提供了一种光学成像系统。该光学成像系统包括计算机和光学照明系统，该光学照明系统用于照射弹性微流体阵列器件，这种器件至少包括1536个处于流体隔离状态中的反应室。该弹性微流体阵列器件包括由多个层构成的弹性块。在这多个层中，至少一层具有形成于其中的至少一个凹陷。该凹陷具有至少一个可弯曲的膜，该膜被整合到凹陷的层上。光学成像系统还包括光学检测系统。
[0025]在另一个可选的特定实施例中，提供了一种给微流体器件的多个反应室内的一个或多个选出的荧光指示成像的方法。该方法包括:沿成像通道，传输一个或多个荧光发射信号，所述一个或多个荧光发射信号是从微流体器件的多个反应室中的至少一个反应室内的一个或多个样品那儿获得的。该方法还包括:通过使用滤光器件，沿成像通道，选择性地传输上述一个或多个荧光发射信号的子集，该滤光器件用于使预定光谱带宽内的荧光发射信号通过，并且将与上述一个或多个荧光发射信号相关联的一种或多种色差处理到预定的程度。[0026]在特定的实施例中，该方法还包括:在检测器处，读取上述一个或多个荧光发射信号的子集的一部分；拍摄上述一个或多个荧光发射信号，这些信号是从微流体器件的多个反应室中的至少一个反应室内的一个或多个样品那儿获得的；照亮上述至少一个微流体器件中的至少96个反应室，其中在多于48个反应室构成的一组中的每一个反应室与多于48个反应室构成的另一组中的每一个反应室都处于流体隔离状态，并且使上述至少一个微流体器件在确定的时间维持预定的温度，其中预定时间处的预定温度是多步热循环分布中的一部分。在另一个特定的实施例中，处理与上述一个或多个荧光发射信号相关联的一种或多种色差的过程包括:使上述一种或多种色差减小到预定的程度。该预定的程度以预定的焦点移动为特征，而该预定的焦点移动又与具有第一颜色的第一光线和具有第二颜色的第二光线相关联。在另一个特定的实施例中，滤光器件包括多个零屈光度双透镜和多个光谱滤光片。
[0027]在本发明的一个实施例中，使用光学成像系统来收集和微流体器件有关的信息。在特定的实施例中，成像系统的使用包括一种由不止63个反应室构成的微流体器件。在另一个特定的实施例中，成像系统的使用包括一种具有弹性微流体器件的微流体器件。在可选的实施例中，成像系统的使用包括由不止95个反应室构成的微流体器件。在另一个可选的实施例中，成像系统的使用包括一种由不止383个反应室构成的微流体器件。在另一个可选实施例中，成像系统的使用包括一种由不止511个反应室构成的微流体器件。在另外的实施例中，成像系统的使用包括一种由2304个或更多个反应室构成的微流体器件。在另一个附加实施例中，成像系统的使用包括一种由9216个或更多个反应室构成的微流体器件。在另一个附加实施例中，成像系统的使用包括一种由100000个或更多个反应室构成的微流体器件。
[0028]根据本发明的另一个实施例，使用光学成像系统来收集和微流体器件有关的信息。光学系统的使用包括一种弹性微流体器件，这种弹性微流体器件适合于在特定的实施例中执行蛋白质结晶化处理。在另一个实施例中，成像系统的使用包括一种弹性微流体器件，这种弹性微流体器件适合于执行有关处理。在另一个实施例中，成像系统的使用包括一种弹性微流体器件，这种弹性微流体器件适合于在选定的温度或温度范围中进行各种反应。在另一个特定的实施例中，光学成像系统被用于收集和PCR反应有关的信息。在另一个特定的实施例中，成像系统的使用包括一种微流体器件，这种微流体器件包括处于微流体隔离状态中的封闭式反应室。在其它实施例中，成像系统的使用包括耦合到该微流体器件的热控制器。
[0029]在可选的实施例中，使用光学成像系统来给微流体器件成像。在这种可选实施例中，光学成像系统具有多个双透镜，适合于将色差的值减小到预定的程度。在一个实施例中，光学成像系统具有大于0.23的NA。在另一个实施例中，光学成像系统具有大于或等于0.36的NA。在另一个实施例中，光学成像系统具有大于0.2的NA。在特定的实施例中，光学成像系统包括:第一光谱滤光片，稱合到第一双透镜；以及第二光谱滤光片，稱合到第二双透镜。此外，在另外的实施例中，第一双透镜使第一光谱滤光片所透射的第一波长处的色差值减小到第一预定程度，而第二双透镜使第二光谱滤光片所透射的第二波长处的色差值减小到第二预定程度。在某些实施例中，第一双透镜和第二双透镜是零屈光度双透镜。在其它实施例中，第一光谱滤光片、第一双透镜、第二光谱滤光片和第二双透镜是作为滤光轮来排列的。
[0030]在本发明的另一个实施例中，使用荧光成像系统从微流体器件那儿获取多个图像，其中包括一个或多个荧光发射信号。荧光成像系统的使用包括一种具有不止63个反应室的微流体器件，这些反应室都处于流体隔离状态中。在一个实施例中，荧光成像系统的使用包括一种具有图像微流体器件的微流体器件。在另一个实施例中，荧光成像系统的使用包括多个其体积小于IOnl的反应室。在另一个实施例中，荧光成像系统的使用包括一种弹性微流体器件，这种弹性微流体器件具有每平方厘米大于或等于100个反应室的阵列密度。在可选的实施例中，荧光成像系统包括一种滤光器件，该滤光器件适合于使上述一个或多个荧光发射信号中选定的光谱带宽透射，并且还适合于将与上述一个或多个荧光发射信号相关联的一种或多种色差处理到确定的程度。
[0031]在本发明的一个实施例中，提供了一种对微流体系统中的样品进行询问的光学系统。在本实施例所提供的光学系统中，检测器由一个阵列(例如，CCD阵列)构成，其尺寸等于或大于要被成像到其上的微流体系统。在另一个实施例中，检测器通过使用至少一个透镜，以光学方式耦合到微流体器件。在另一个实施例中，检测器并不与微流体器件保形接触。在特定的实施例中，检测器与微流体器件保形接触。在另一个特定的实施例中，在光学系统中使用了在整个说明书中都讨论到的色差校正系统。
[0032]在另一个实施例中，提供了一种对微流体器件进行询问的光学系统。光学系统具有放大率M≤NAyNAdet，其中NA。是物方/样品那一侧的NA，而NAdet是在因检测器表面反射所造成的损耗超过阈值之前可允许到达该检测器的最大的NA。在特定的实施例中，检测器是CCD,并且NAdet=0.36。在另一个实施例中，检测器是CCD,并且0.23 ( NAdet ( 0.5。
[0033]在附加 的实施例中，提供了一种对微流体系统中的样品进行询问的光学系统。检测器包括一种阵列(例如，CCD阵列)，其大小等于包含多个反应室的微流体器件的面积的M倍。在一个实施例中，微流体器件的面积包括多个要被询问的样品室。在该实施例中，M=NAyNAdet+/-10%，其中NA。是由焦深等种种考虑所确定的可接受的最大NA，而焦深等种种考虑则涉及反应室之间可接受的串扰、它们的XY间隔和尺寸以及它们沿Z轴的宽度，并且NAdet使得≤40%的入射光因反射、晕映等原因而在检测器表面处损失了。在另一个特定的实施例中，NAdet使得≤20%的入射光因反射、晕映等原因而在检测器表面处损失了。在另一个特定的实施例中，NAdet使得≤10%的入射光因反射、晕映等原因而在检测器表面处损失了。在可选的实施例中，M > I。在另一个可选的实施例中，M=l。
[0034]和常规技术相比，通过使用本发明，实现了大量的益处。一些实施例提供了光学成像系统，以产生并检测来自微流体器件的荧光。另外，本发明的各实施例提供了一些光学系统，这些光学系统通过使用耦合到光谱滤光片的零屈光度消色差双透镜来减小色差。
[0035]本发明的各实施例能够在单个平台上执行许多应用。例如，通过使用本发明的各实施例，来执行各种基因组应用，其中包括基因表达和基因型鉴定。此外，数字隔离与检测(DID)应用是可行的。作为一个示例，提供了许多涉及癌症检测、单细胞大分子检测和量化等应用。此外，通过本发明的各实施例，提供了许多蛋白质组学的应用，其中包括蛋白质配体结合以及免疫测定处理。
[0036]另外，根据本发明的各实施例，可以实现某些益处和/或优点，以克服其它技术的某些局限。下面的内容都是基于计算而确定的:[0037]一些扫描系统具有期望的分辨率10微米。在这些系统中，总共有3000x3000 (=约IO67)个“点”，期望针对这些“点”来使荧光量化。例如，为了在10秒内实现上述这一点，每一个点处的停留时间是?I微秒。相应地，在3毫秒内将完成线扫描(3000个点)。为了获得和使用本发明各实施例而实现的信噪比等价的信噪比，该“点”处的光强应该比本发明的成像系统通过在I秒周期内获得一个信号从而实现的光强要亮?IO6倍。为了在3毫秒内越过3厘米扫描一个点，1000次/秒在机械方面常常是很有挑战性的。另外，期望高效地收集发射信号。这通常需要很大的场光学镜片或NA很高的浮动头(例如，以>=10m/s的速度移动)。在这种情况下，和器件左上角处收集的数据相比，器件右下角处收集的数据将晚10秒，这在某些应用中是不期望出现的。
[0038]一些缝合系统获取多个图像，并且将它们缝合到一起从而形成复合图像。在一个系统中，为了用多个3mmX3mm的图像缝合出一个图像，利用了 100个图像。获取这些单张图像所用的总时间将是100毫秒。假设大约一半的时间用在移动上面，另一半时间用在获取图像上面，则图像时间将大约是50毫秒。该系统通常需要比本发明各实施例在I秒周期内获取I个信号的过程中所用的光强要强20倍的光强，和/或还需要NA更高的物镜。另外，这些系统通常需要快速的镜台-能够移动3毫米并且能够在50毫秒内完全结束。另外，这些系统通常需要对移动和光强进行仔细的校准，以消除缝合过程中的伪像。和左上角处收集的数据相比，右下角处收集的数据将晚10秒，这在某些应用中是不期望出现的。
[0039]本发明的一些实施例提供了能够使微流体器件所在区域一次全部成像的成像系统。在每个图像可以有10秒的一个实施例中，可以有若干秒的整合时间。同步化问题减小了或消除了，因为数据是同时从所有的像素中收集的。此外，本发明的各实施例通常同时照亮整个微流体器件(?31mm x31mm的区域)，并且使用具有高NA和大视场的透镜系统。如本说明书中所描述的，本发明的各实施例提供了比常规系统简单且更有用的方法和系统。根据各实施例，本发明各实施例的方法和系统可以克服上述这些局限中的一种或多种。在本说明书中，尤其是在下文中，可以找到本发明的细节。根据各实施例，可能存在这些益处中的一种或多种。在本说明书中，尤其是在下文中，会描述这些和其它益处。
[0040]参照下面的详细描述和附图，可以更全面地理解本发明的各种其它的目的、特征和优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1A是示出了本发明一实施例的光学成像系统的简化示意图；
[0042]图1B描绘了本发明一可选实施例的典型成像系统的概观；
[0043]图1C是示出了本发明一实施例的热控制器件的简化示意图；
[0044]图2A-2C是示出了本发明一实施例的透镜组件的简化示意图；
[0045]图3是根据本发明一实施例在微流体器件的许多反应室中通过反应而产生的以第一波长为中心的荧光发射的照片；
[0046]图4是根据本发明一实施例在微流体器件的许多反应室中通过反应而产生的以第二波长为中心的荧光发射的照片；
[0047]图5-7是使用本发明一实施例而产生的选定波长的光点图；
[0048]图8是使用本发明一实施例而产生的照明图，该照明图示出了相对均匀性和位置的函数关系图；
[0049]图9-11是本发明若干实施例的正方块块内能量图；
[0050]图12是示出了本发明一实施例所提供的光学系统的场曲和畸变的图；
[0051]图13是示出了本发明一实施例的系统所产生的“双波长对焦点”的图；
[0052]图14-16是使用本发明一实施例而产生的选定波长的光点图；
[0053]图17-19是使用本发明一实施例而产生的选定波长的光点图；
[0054]图20-22是使用本发明一实施例而产生的选定波长的光点图；
[0055]图23-25是使用本发明一实施例而产生的选定波长的光点图；
[0056]图26-28是本发明若干实施例的正方块块内能量图。
【具体实施方式】
[0057]根据本发明，提供了用于微流体系统的多种技术。特别是，本发明提供了一种给微流体器件的反应室内的流体体积中悬浮的一个或多个实体成像的方法和系统。更具体地讲，这种成像方法和系统利用了与微流体器件中的一个或多个实体相关联的荧光信号的指示。仅仅作为示例，通过使用和微流体器件相耦合的荧光、化学发光和生物发光读出器，来应用微流体方法和系统技术，但是将会认识到本发明具有更广的应用范围。
[0058]在本申请中，提到了微流体器件中的某些类型的“反应”室。通常，这些“反应室”包括处理位置、处理室、和/或反应位置、它们的任意组合等等。这些室室可以是闭合的、部分闭合的、打开的、部分打开的、密封的、或它们的组合等等，其中包括涉及这些状态中的任何状态的任何暂时或瞬时条件。在一些实施例中，这些室室是密封的、能够密封的、可闭合的、隔离的、能够隔离的、和它们的组合、以及涉及这些状态中的任何状态的任何暂时或瞬时条件中的任何组合或单个条件。因此，术语“反应室”的使用并不旨在限制本发明，而是包括这些其它结构。另外，术语“室”并不旨在限制本发明，而是应该按其普通的意思来使用，除非已经引用和该室相关联的特定特征。当然，可以有其它变化、修改和替换。
[0059]此外，在本申请中，提到了来自微流体器件的荧光指示。本发明的范围内不仅包括荧光指示，还包括发光指示，其中包括化学发光、电致发光、电化学发光、磷发光、生物发光和其它发光过程、或包括可用检测器件检测的任何其它类型的指示的任何其它过程。对于本领域的技术人员，很明显，可用于检测并分析这些荧光和发光指示的方法和系统可以从一种指示转移到另一种指示。另外，尽管本发明的一些实施例利用光谱滤光片作为光学元件，但是本发明并没有要求这一点。一些荧光和发光应用并不在光激发通道、光发射通道或二者中使用光谱滤光片。如本文所述，其它实施方式采用光谱滤光片。本领域的技术人员会理解与特定应用相关联的诸多差异。
[0060]在一些实施方式中，使用了用于进行微流体分析的各种器件和方法，其中包括可用于进行热循环反应如核酸扩增反应的器件。这些器件和常规微流体器件相比不同之处在于:它们包括了弹性组件；在某些情况下，该器件大部分或全部都是由弹性材料构成的。例如，扩增反应可以是线性扩增(用一种引物扩增)以及指数扩增(即用正向和反向组进行扩增)。
[0061]本发明的一些实施方式所提供的方法和系统在执行核酸扩增反应的过程中利用了盲端通道类型的器件。在这些器件中，通常沉积在反应位点内的试剂是进行所需类型的扩增反应所必需的那些试剂。通常，这意味着沉积以下某些或全部试剂:引物、聚合酶、核苷酸、金属离子、缓冲液和辅因子。在这种情况下，引入反应位点的样品是核酸模板。然而，可沉积该模板，并且使扩增试剂流入反应位点。如本发明中详细讨论的那样，当使用矩阵器件进行扩增反应时，含核酸模板的样品流过垂直的流动通道，而扩增试剂则流过水平的流动通道，反之亦然。
[0062]PCR或许是已知最好的扩增技术。本发明各实施例所使用的器件并不限于进行PCR扩增。可以进行的其它类型的扩增反应包括但不限于:(i)连接酶链反应(LCR)(参照Wu和Wallace, Genomics4:560 (1989)以及 Landegren 等人，Science241:1077 (1988)) ； (ii)转录扩增(参照 Kwoh 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173 (1989)) ； (iii)自动维持序列复制(参照 Guatelli 等人,Proc.Nat.Acad.Sc1.USA, 87:1874 (1990))；以及(iv)基于核酸的序列扩增(NASBA)(参照 Sooknanan, R.和 Malek, L., BioTechnologyl3:563-65 (1995))。上述各种参考文献以其全部内容引用在此。
[0063]此外，设计某些器件，以采用包括一个或多个弹性阀的器件进行热循环反应(如PCR)，所述弹性阀用来调控流过该器件的溶液。因此，也提供了用这种设计的器件来进行扩增反应的方法。
[0064]不管是被隔离在反应室内还是在随后的任何时刻，都可以用检测核酸的常规方法来检测并区分扩增产物(扩增子)。使用嵌入染料如SYBR?、Pico Green(俄勒R州Eugene市Molecular Probes 有限公司)、溴化乙淀等(参照 Zhu 等人，1994, Anal.Chem.66:1941-48)和/或凝胶电泳，可以检测包含双链DNA的扩增子。更常见的是，使用序列特异性检测方法(即基于核苷酸序列检测扩增子)。检测方法的示例包括:固定的寡核苷酸或多核苷酸的阵列杂交；以及使用基于差别标记分子信标的检测系统，或者其它“荧光共振能量转移”(FRET)检测系统。根据本发明的一些实施方式，FRET检测是较佳的检测方法。在FRET试验中，检测供体/受体荧光团对中供体(报道物)和/或受体(淬光剂)荧光团的荧光变化。选择供体和受体荧光团，使得供体的发射光谱与受体的激发光谱交迭。因此，当使这对荧光团彼此靠得足够近时，会发生从供体到受体的能量转移，并且可以检测到这种能量转移。已知各种试验，包括但不限于:模板延伸反应、定量RT-PCR、分子信标(MolecularBeacons)和侵入检测(Invader assay),下面对它们进行简述。
[0065]FRET和模板延伸反应使用:用供体/受体对中的一个成员标记的引物，以及用此供体/受体对中的另一成员标记的核苷酸。在模板依赖性延伸反应期间将标记核苷酸掺入引物中之前，先将供体和受体分隔得足够远，以使能量转移无法发生。然而，如果标记核苷酸掺入引物并且间隔足够近，则会发生能量转移并且可以检测到这种能量转移。这些方法在检测单核苷酸多态性的单碱基对延伸反应中特别有用，参见美国专利5，945，283和PCT公开W097/22719。通过使用本说明书中所述的温度控制方法和装置，可以任选地对这些反应进行热循环，以增大信号。
[0066]也可以使用各种所谓的“实时扩增”方法或“实时定量PCR”方法，通过测量扩增过程期间或之后所形成的扩增产物的量，来确定样品中存在的靶核酸量。发荧光的核酸酶试验是实时定量方法的一个特定示例，实时定量方法可以和本文所述器件一起成功地使用。这种监控扩增产物的形成的方法包括:用双标记的荧光寡核苷酸探针连续测量PCR产物累积，此方法在文献中常被称为“TaqMan”法。参见例如，美国专利5，723，591。[0067]在使用分子信标的情况下，当它杂交到扩增产物的互补区域时探针构象的变化产生了可检测的信号。探针自身包括两部分:5’端的一部分，以及3’端的另一部分。这些部分侧接于退火到探针结合位点的探针部分，并且彼此互补。一端部分通常连接于报道染料，而另一端部分通常连接到淬光染料。在溶液中，这两个端部分可以彼此杂交形成发夹环。在这种构象中，报道物和淬光剂靠得足够近，使得报道物的荧光被淬光染料有效地淬灭。相反，杂交探针产生线性化构象，其中淬灭程度降低。由此，通过监测这两种染料的发射光变化，有可能间接地监测扩增产物的形成。这种类型的探针及其使用方法在下面的文献中有进一步的描述:如Piatek等人，1998年，Nat.Biotechnol.16:359-63 ；Tyagi 和 Kramer, 1996 年，Nat.Biotechnologyl4:303-308 ；以及 Tyagi 等人，1998 年，Nat.Biotechnol.16:49-53(1998)。
[0068]下列文献中描述了 Scorpion检测法:Thelwell等人,2000年，NucleicAcidsResearch, 28:3752-3761 ；以及 Solinas 等人，2001 年，“SNP 分析和 FRET 应用中的双链体 Scorpion 引物”(Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRETapplications), Nucleic Acids Research29:20。Scorpion 引物是突光 PCR 引物，其中探针元件通过PCR终止物连接到5’端。它们用于均一溶液中PCR产物的实时扩增子特异性检测。可能有两种不同的形式，即“茎-环”形式和“双链体”形式。在这两种情况下，探测机制都是作用于分子内。所有形式的Scorpion基本元件是:(i)PCR引物；(ii)PCR终止物，用于防止探针元件的PCR通读(read-through) ； (iii)特定探针序列；以及(iv)突光检测系统，该系统包含至少一个荧光团和淬光剂。在Scorpion引物的PCR延伸之后，所得扩增子包含与探针互补的序列，在各PCR循环的变性阶段将其分解成单链。在冷却时，该探针可自由地结合该互补序列，从而增加荧光，因为淬光剂不再位于荧光团附近了。PCR终止物防止Taq DNA聚合酶进行不期望的探针通读。
[0069]侵入检测(Third Wave Technologies公司，Madison市,威斯康星州)被特别地用于SNP基因型分析，它利用与靶核酸(DNA或RNA)或多态性位点互补的寡核苷酸，称为信号探针。第二寡核苷酸(称为侵入寡核苷酸)包含相同的5’核苷酸序列，但3’核苷酸序列包含核苷酸多态性(位点)。侵入核苷酸干扰信号探针与靶核酸的结合，使得信号探针的5’端在包含多态性(位点)的核苷酸处形成“下垂物”。该复合物被一种称为Cleavase酶的结构特异性内切核酸酶识别。Cleavase酶切下核苷酸的5’下垂物。所释放的下垂物与携带FRET标签的第三探针结合，由此形成另一种由Cleavase酶识别的双链体结构。此时，Cleavase酶从淬光剂中切下荧光团，产生荧光信号。对于SNP基因型分析，设计信号探针，使其与参比(野生型)等位基因或变异(突变)的等位基因杂交。不像PCR，有一种线性的信号扩增，其中没有核酸扩增。足以指导本领域普通技术人员的诸多细节参见:Neri，B.P.等人，Advances in Nucleic Acid and Protein Analysis3826:117-125，2000 年；以及美国专利 6，706，471。
[0070]各种多重扩增系统可与本发明联用。在一种类型中，可使用多个标记不同的探针(每一个探针被设计成只杂交到特定的目标)同时检测若干个不同的靶标。因为各探针具有不同的标记，所以根据荧光信号检测与各靶标的结合。通过明智地选择所使用的不同标记，可进行在单次反应中以不同波长激发和/或检测不同标记的各种分析。例如，可以参照:《突光光谱学》(Fluorescence Spectroscopy) (Pesce等人著)Marcel Dekker, New York, (1971) ;White 等人著，《突光分析:实践方法》(FluorescenceAnalysis: A Practical Approach), Marcel Dekker, New York, (1970) ;Berlman 著，《芳方矣分子的突光光谱手册》(Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules),第二版，Academic Press, New York, (1971) !Griffiths著，《有机分子的颜色和构造》(Colour and Constitution of Organic Molecules), Academic Press, New York, (1976)；《指不物》(Indicators) (Bishop 编)，Pergamon Press, Oxford, 19723 ;以及 Haugland 著，《突光探针和研究用化学物质手册》(Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals), Molecular Probes, Eugene 市(1992)。
[0071]许多与基因组修饰有关的疾病，无论是宿主有机体的抑或感染有机体的疾病，是少量核苷酸发生变化(常常包括单个核苷酸改变)的结果。这种单核苷酸变化称为单核苷酸多态性(简称为SNP)，并且发生SNP的位点通常称为多态性位点。本文所述的器件可用于确定这种多态性位点处存在的核苷酸的身份。作为这种能力的扩展，这些器件可用于基因型分析。基因型分析包括:确定二倍体生物体(即各基因有两个拷贝的生物体)是否包含两个拷贝的参比等位基因(参比型纯合子)，或者包含参比和变异等位基因各一个拷贝(即杂合子)，抑或包含两个拷贝的变异等位基因(即变异型纯合子)。当进行基因型分析时，可用本发明方法询问单个变异位点。然而，如下文关于多道传输那部分所进一步描述的，这些方法也可用于确定许多不同的DNA位置(loci)(相同基因上的DNA位置、不同基因上的DNA位置或二者的组合)中单个(基因)的基因型。
[0072]用于进行基因型分析的器件被设计成采用大小合适的反应位点，以在统计学上确保该反应位点中存在可行DNA浓度的二倍体的两种等位基因各一拷贝。否则，分析可能产生表明杂合子就是纯合子的结果，仅仅因为该反应位点处不存在第二种等位基因的拷贝。下表1指出本文所述器件可利用的各种示范性DNA浓度下I纳升反应体积中存在的基因组的拷贝数。
[0073]表格1:在所示DNA浓度下I纳升体积中存在的基因组拷贝数。
[0074]`
【权利要求】
1.一种光学成像系统，所述系统包括: 计算机； 光学照明系统，适用于照射弹性微流体阵列设备，所述弹性微流体阵列设备包括处于流体隔离中的至少1536个反应室，所述弹性微流体阵列设备包括由多层构成的弹性模块，其中至少一层具有形成于其中的至少一个凹陷，所述凹陷具有至少一个可弯曲的膜，所述膜与具有所述凹陷的层构成一体；以及 光学检测系统。
2.如权利要求1所述的光学成像系统，其特征在于，所述至少1536个反应室都以小于100纳升的体积为特征。
3.如权利要求1所述的光学成像系统，其特征在于，所述至少1536个反应室按照每平方厘米大于或等于250个室的阵列密度来进行空间排列。
4.如权利要求1所述的光学成像系统，其特征在于，M种样品和N种试剂分布在所述至少1536个反应室中。
5.如权利要求1所述的光学成像系统，其特征在于，所述光学照明系统从所述至少1536个反应室的子集中激发出一个或多个荧光信号的发射。
6.如权利要求1所述的光学成像系统，其特征在于，所述光学检测系统适用于提供与所述至少1536个反应室的子集相关的蛋白质结晶过程的一个或多个图像。
【文档编号】G02B21/16GK103884698SQ201410085361
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2005年6月7日 优先权日:2004年6月7日
【发明者】M·A·厄金, G·R·费瑟, B·克拉克森, C·G·西泽, N·斯威兹 申请人:先锋生物科技股份有限公司