经由纳米压印的选择性表面图案化的制作方法
总的来说，本申请涉及纳米图案化工艺和相关的具有微米-或纳米-图案化的表面的衬底的领域。更具体地，本申请涉及具有二元表面化学的包括双官能聚合物层状表面的衬底。还公开通过使用纳米压印光刻工艺制备这些衬底的方法。
背景技术：
纳米压印技术使得能够经济且有效地制造纳米结构体。标准的纳米压凸(压花，embossing)光刻法采用通过具有纳米结构体的印模(印章，stamp)使抗蚀剂材料直接机械变形、继之以蚀刻过程以将纳米结构体从印模转印到衬底。
流动室(flowcell)为容许流体流动通过衬底内的通道(沟道，channel)或孔(井，well)的装置。在核酸分析方法中可用的图案化的流动室包括在惰性间隙区域内的活性表面的离散孔。一般使用以下步骤制作所述流动室的表面：(1)首先将孔蚀刻到均匀的衬底中；(2)将所述孔和间隙区域用硅烷和聚合物或水凝胶官能化；(3)将覆盖所述间隙区域的多余的聚合物或水凝胶经由抛光过程除去；(4)然后将所述孔中的聚合物或水凝胶用单链引物dna接枝以提供用于下游测序应用的流动室表面。在该情形中，所述聚合物或水凝胶的一些在制作流程的抛光步骤中浪费掉。另外，间隙区域的表面能大大地取决于起始衬底。
技术实现要素：
本公开的实施方式提供通过消除对于在图案化的流动室的制作流程内进行抛光的需求而改进的衬底表面制作工艺。在一些情形中，可特异性地选择流动室的图案化的孔内的化学官能团以直接捕获引物dna。这可消除对于将硅烷和官能化的聚合物/水凝胶沉积到所述表面上以捕获dna的需求。另外，可选择间隙区的化学官能团使得最终图案化的表面的总表面能与所提议的应用是相容的。例如，图案化的表面可例如为亲水的以容许与通过使用标准流控技术的合成(sbs)系统的测序一体化；或者例如为疏水的以容许排斥特定的试剂；或者例如为可在疏水和亲水状态之间可逆地转变的以用在电润湿技术中。
本文中描述的一些实施方式涉及具有表面的衬底，其包括：布置在所述表面上以形成第一区域的第一聚合物层，其中第一聚合物层包括第一多个官能团；和布置在所述第一聚合物层的至少一部分上面以形成第二区域的第二聚合物层，其中第一聚合物层包括压印的特征图案；且第一多个官能团提供用于共价键合官能化分子的反应性位点。在一些实施方式中，第二聚合物层包括与第一聚合物层中的第一多个官能团不同的第二多个官能团。
本文中描述的一些实施方式涉及用于制备衬底的方法，其包括：提供具有第一区域和第二区域的衬底；向第一区域和第二区域施加第一光致固化聚合物组合物的层；在第一光致固化聚合物组合物的层之上施加第二光致固化聚合物组合物的层以完全覆盖第一光致固化聚合物组合物的层；使第二光致固化聚合物组合物的层与具有多个微米级或纳米级的图案的模板接触；向所述模板或所述衬底施加压力以将所述微米级或纳米级的图案转印到第一和第二光致固化聚合物组合物的层；照射uv光以使第一和第二光致固化聚合物组合物的层固化，使得第一和第二光致固化聚合物组合物的层分别形成第一聚合物层和第二聚合物层；和将所述模板从衬底分离；其中将第二聚合物层的至少一部分穿孔以使下面的第一聚合物层暴露。
本文中描述的一些实施方式涉及用于制备衬底的方法，其包括：提供在衬底表面上具有第一图案化的聚合物层的衬底；在第一图案化的聚合物层上沉积第一光子晶体材料使得第一光子晶体材料采取(adopt)第一图案化的聚合物层中的图案；和在所述光子晶体材料之上形成第二图案化的聚合物层。在一些实施方式中，所述方法还包括在第二图案化的聚合物层上沉积第二光子晶体材料使得第二光子晶体材料采取第二图案化的聚合物层中的图案。
本文中描述的一些实施方式涉及通过本文中描述的方法制备的衬底。
本文中描述的一些实施方式涉及使用本文中描述的衬底检测分析物的方法。
附图说明
图1说明使用纳米压印光刻法制备双聚合物层衬底的流程工艺的实施方式。
图2说明使用纳米压印光刻法制备包含光子晶体材料的双聚合物层衬底的流程工艺的实施方式。
具体实施方式
用于制备图案化的流动室的标准的纳米压印光刻工艺可涉及若干个步骤，其包括：将聚合物前体制剂(配方，formulation)的层旋涂到经打底的(primed)圆片(晶圆，wafer)上；软烘烤聚合物前体层以将溶剂逐出；压印所述圆片并且将其暴露到uv以引发聚合物前体的固化；和，硬烘烤所述圆片以完成固化过程并且锁定压印的形貌(topography)。在该标准场景中，使用单一聚合物前体制剂，这导致在其整个体积中化学官能团均匀的压印膜。孔和间隙区的表面将在它们的表面处具有相同的化学官能团。
在本申请的一些实施方式中，可接连地使用各自具有特制的(tailored)化学官能团的两种不同的聚合物前体制剂以构建准备用于压印的双层聚合物涂层。第二(上)层可相对于第一(下)层较薄。例如，第二(上)层可具有如下深度：其为第一(下)层的深度的至多约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％或更小，或者由任意两个前述值限定的范围。具有较薄的上层可有利地容许上层聚合物材料原地保留在间隙区中，但是在压印时在孔表面区上面被穿孔。在一些情形中，压印印模的柱状物将有效地刺破通过顶层聚合物材料使得仅印模柱状物上的顶端与下层聚合物材料接触。
在一些实施方式中，将第二聚合物前体制剂沉积在半固化的第一聚合物前体制剂层上以防止第二层的沉积除去第一聚合物前体制剂、或者导致两种聚合物前体制剂的大量混杂。
在一些实施方式中，将设计两种聚合物前体制剂使得它们会键合在一起而形成共价连接的界面，但是保留正交的(互不相关的，orthogonal)官能团。
在有机电子学领域中，jung等人已经证明使用双层纳米压印形成具有不同化学官能团且用于不同下游应用的压印的表面。参见yunbumjung和xingcheng的“dual-layerthermalnanoimprintlithographywithoutdryetching,”2012,j.micromech.microeng.22(8),085011。
以下的详细描述涉及本申请的某些特定实施方式。在本说明书中，参考图，其中为了清楚，同样的部件或步骤可自始至终用同样的数字指代。本说明书中提到的“一个实施方式”、“一种实施方式”、或“在一些实施方式中”意指在本发明的至少一个实施方式中可包括关于所述实施方式描述的具体的特征、结构、或特性。在说明书中的不同位置处出现的措词“一个实施方式”、“一种实施方式”或“在一些实施方式中”不一定全部指代相同的实施方式，也不一定是与其它实施方式互不相交的单独的或替代的实施方式。而且，描述了可被一些实施方式呈现并且不被另一些实施方式呈现的多个特征。类似地，描述了对于一些实施方式可能是必要条件但是对于其它实施方式不是的多个必要条件。
本文中使用的章节标题只是为了组织意图，并且不应解释成限制所描述的主题。
定义
除非另外声明，本文中使用的所有技术和科学术语具有和本领域技术人员通常理解的相同含义。本文中引用的所有专利、申请、已公布的申请和其它出版物通过引用以其整体并入，除非另外声明。正如说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个(一种，a)”、“一个(一种，an)”和“所述(该，the)”包括复数的指代物，除非上下文清楚地另外规定。“或”的使用意指“和/或”，除非另外声明。此外，术语“包括(including)”以及其它形式例如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。如本说明书中使用的，不管在过渡措词中或在权利要求的主体中，术语“包含(comprise)”和“包含(comprising)”应解释成具有开放式含义。即，所述术语应解释成与措词“至少具有”或“至少包括”是同义的。当在方法的情景中使用时，术语“包含”意指所述方法至少包括所述步骤，但是可包括另外的步骤。当在化合物、组合物或装置的情景中使用时，术语“包含”意指所述化合物、组合物或装置至少包括所述特征或组分(组件)，但是还可包括另外的特征或组分(组件)。
如本文中使用的，常见的有机缩写如下定义：
bcn双环[6.1.0]壬-4-炔
nil纳米压印光刻法
ssdna单链dna
sbs通过合成法测序(边合成边测序，sequencingbysynthesis)
pag光酸产生剂(photoacidgenerator)
pazam任意的丙烯酰胺对azapa(n-(5-(2-叠氮基乙酰氨基)戊基)丙烯酰胺)比率的聚(n-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)
tad1,2,4-三唑啉-3,5-二酮
℃以摄氏度计的温度
μm微米
如本文中使用的，术语“共价附着”或“共价键合”是指以在原子之间共享电子对为特征的化学键的形成。例如，“共价附着的聚合物涂层”当结合衬底表面使用时是指与衬底的官能化的表面形成化学键的聚合物涂层，如与经由其它手段例如粘附或静电相互作用附着到所述表面相比。将认识到，共价附着到表面的聚合物除了共价附着之外还可经由其它手段键合。
如本文中使用的，术语“软烘烤(softbaking)”或“软烘烤(softbake)”是指培育聚合物或水凝胶制剂或者使其脱水以逐出溶剂的过程，其中所述过程的持续时间在约60℃-约130℃范围内的温度下通常持续约5秒至约10分钟。对于软烘烤可使用的装置的非限制性实例包括加热板。
如本文中使用的，术语“硬烘烤(hardbaking)”或“硬烘烤(hardbake)”是指培育聚合物制剂或使其脱水以逐出溶剂，其中该过程的持续时间在约100℃-约300℃范围内的温度下通常持续约5秒至约10分钟。对于硬烘烤可使用的装置的非限制性实例包括加热板。
如本文中使用的，术语“特征(feature)”旨在意指衬底的离散物理元件或离散物理性状(trait)。特征包括衬底上被占据的或可供占据的地点、位置或位点，或者衬底的可区别的物理、结构或化学性状。因此，特征为衬底的提供物理或功能可分性的组件。特征将沉积在第一特征处的生物聚合物与沉积在第二特征处的生物聚合物分开。特征的实例包括载玻片、芯片或其它平面衬底上包含的斑点，图案化的衬底，和可分的化学部分或反应性基团。
图案化的衬底可包括例如蚀刻到载玻片或芯片中的孔。蚀刻的图案和孔的几何形状可呈现多种不同的形状和尺寸，只要这样的特征在物理或功能上彼此可分。
如本文中使用的，术语“抛光”旨在意指用于除去衬底的一部分的衬底或其一部分的机械或化学处理。因此，所述术语包括除去衬底的涂层(包括衬底的层的涂层)。除去可为均匀的或非均匀的。所述术语包括例如，擦拭、磨蚀(chafing)、平滑化或相反通过施加的压力或其它摩擦力的运动来处理表面以及将所述衬底显影、修整或精制以产生改变的衬底表面。所得的表面在本文中称为“抛光的”表面。可使用直接抛光方法使得磨料表面接触待抛光的表面，或者可使用间接抛光使得淤浆或悬浮的聚集体在磨光过程中与所述表面接触。机械抛光的具体实例包括砂磨、研磨或磨光。还可使用化学抛光方法，例如用酸例如氢氟酸或碱例如氢氧化钠进行处理。本领域中公知的可除去衬底的一部分(包括衬底的层的一部分)的其它方法也包括在如本文中使用的术语的含义之内。
如本文中使用的，“官能化分子”是指包括可用于借助化学反应或分子相互作用而附着到一个或多个生物分子或衬底的表面的反应性部分的分子。这样的附着可经由共价键或者通过其它键合或相互作用力。在一些实施方式中，分子相互作用可为配体和受体之间的特异性结合，配体和受体对包括但不限于链霉亲和素和生物素、核酸和其补体、抗体和配体、以及本领域中已知的其它的。例如，官能化分子可为包含能够与感兴趣的生物分子反应或结合到其的一个或多个官能团的水凝胶。非限制性的具体实例为包含可与包含炔基的寡核苷酸反应的一个或多个叠氮官能团的pazam。在一些情形中，官能化分子附着到衬底表面，其中留下反应性位点以进一步与感兴趣的生物分子附着。在一些其它情形中，官能化分子附着到衬底表面而未留下反应性位点。替代性实例包括具有可与包含张力环(strainedring)(例如环烯或环炔基团，例如降冰片烯和bcn官能团)的寡核苷酸反应的四嗪官能团的聚合物/水凝胶、或具有可与包含氨基或受保护的氨基的寡核苷酸反应的环氧或缩水甘油基的聚合物/水凝胶。另外的实例公开于u.s.ser.no.62/073,764中，其通过引用以其整体在此并入。
如本文中使用的，术语“光致固化聚合物”是指当暴露到光化辐射(例如uv辐射)时能够经历聚合反应的聚合物。
如本文中使用的，术语“光子晶体”是指影响光子运动的光学结构体。本文中描述的衬底中的光子晶体材料是出于光操纵的意图使用的。
如本文中使用的，“ca-cb”或“ca-b”(其中的“a”和“b”为整数)是指规定基团中的碳原子的数量。即，该基团可包含“a”至“b”(包括端点)个碳原子。因此，例如，“c1至c4烷基”或“c1-4烷基”基团是指具有1-4个碳的所有烷基基团，即ch3-、ch3ch2-、ch3ch2ch2-、(ch3)2ch-、ch3ch2ch2ch2-、ch3ch2ch(ch3)-和(ch3)3c-。
如本文中使用的，术语“卤素”或“卤”意指元素周期表的第7列的放射性稳定的原子的任一种，例如氟、氯、溴、或碘，其中氟和氯是优选的。
如本文中使用的，“炔基”是指包含一个或多个三键的直链或支链的烃链。炔基可具有2-20个碳原子，尽管此定义还涵盖其中未规定数值范围的术语“炔基”的场景。炔基还可为具有2-9个碳原子的中等尺寸的炔基。炔基还可为具有2-4个碳原子的低级炔基。炔基可规定为“c2-4炔基”或类似的命名。仅举例而言，“c2-4炔基”指明，在炔基链中有二至四个碳原子，即所述炔基链选自乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基、丁炔-1-基、丁炔-3-基、丁炔-4-基和2-丁炔基。典型的炔基包括但无论如何也不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基和己炔基，等。
如本文中使用的，“环烷基”意指完全饱和的碳环的环或环状体系(ringsystem)。实例包括环己基、环庚基、环辛基等。
如本文中使用的，“环亚烷基”意指经由两个连接点连接到分子的其余部分的完全饱和的碳环的环或环状体系。
如本文中使用的，“环烯基”或“环烯烃”意指具有至少一个双键的碳环的环或环状体系，其中环状体系中的环不是芳族的。一种实例为环辛烯。另一种实例为降冰片烯或降冰片烯基。
如本文中使用的，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指具有环状主链中的至少一个杂原子的具有至少一个双键的碳环的环或环状体系，其中环状体系中的环不是芳族的。
如本文中使用的，“环炔基”或“环炔烃”意指具有至少一个三键的碳环的环或环状体系，其中环状体系中的环不是芳族的。一种实例为环辛炔。另一实例为双环壬炔。
如本文中使用的，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指具有环状主链中的至少一个杂原子的具有至少一个三键的碳环的环或环状体系，其中环状体系中的环不是芳族的。
“氨基”是指其中ra和rb各自独立地选自如本文中定义的氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基(carbocyclyl)、c6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元的杂环基的“-nrarb”基团。一种非限制性实例为游离氨基(即-nh2)。
“c-酰氨基”基团是指其中ra和rb各自独立地选自如本文中定义的氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基的“-c(＝o)nrarb”基团。
“n-酰氨基”基团是指其中ra和rb各自独立地选自如本文中定义的氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元的杂芳基和5-10元杂环基的“-n(ra)c(＝o)rb”基团。
如本文中使用的，如本文中使用的术语“羧酸”或“羧基”是指–c(o)oh。
如本文中使用的术语“肼”或“肼基”是指–nhnh2基团。
如本文中使用的，如本文中使用的术语“腙”或“腙基”是指其中ra和rb各自独立地选自如本文中定义的氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基的
如本文中使用的术语“环氧”是指
如本文中使用的术语“缩水甘油基醚”是指
如本文中使用的，术语“四嗪”或“四嗪基”是指包括四个氮原子的六元杂芳基。四嗪可任选地被取代。
如本文中使用的，术语“四唑”或“四唑基”是指包括四个氮原子的五元杂环基团。四唑可任选地被取代。
如本文中使用的“氧化腈”是指其中r选自如本文中定义的氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基、或5-10元杂环基的“rc≡n+o-”基团。制备氧化腈的非限制性实例包括由醛肟通过用氯胺-t(chloramide-t)的处理或者通过碱对偕氯代烃亚胺[rc(cl)＝noh]的作用的原位产生。
如本文中使用的“氮碳基”是指其中ra、rb和rc各自独立地选自如本文中定义的氢、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-7碳环基、c6-10芳基、5-10元杂芳基、或5-10元杂环基的“rarbc＝nrc+o-”基团。
如本文中使用的，取代基团由其中已经有一个或多个氢原子被另外的原子或基团交换的未取代的母体基团得到。除非另外声明，当基团被认为是“取代的”时，这意味着该基团被独立地选自如下的一个或多个取代基所取代：c1-c6烷基、c1-c6烯基、c1-c6炔基、c1-c6杂烷基、c3-c7碳环基(其任选地被卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基和c1-c6卤代烷氧基所取代)、c3-c7-碳环基-c1-c6-烷基(其任选地被卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基和c1-c6卤代烷氧基所取代)、5-10元杂环基(其任选地被卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基和c1-c6卤代烷氧基所取代)、5-10元杂环基-c1-c6-烷基(其任选地被卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基和c1-c6卤代烷氧基所取代)、芳基(其任选地被卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基和c1-c6卤代烷氧基所取代)、芳基(c1-c6)烷基(其任选地被卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基和c1-c6卤代烷氧基所取代)、5-10元杂芳基(其任选地被卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基和c1-c6卤代烷氧基所取代)、5-10元杂芳基(c1-c6)烷基(其任选地被卤素、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6卤代烷基和c1-c6卤代烷氧基所取代)、卤素、氰基、羟基、c1-c6烷氧基、c1-c6烷氧基(c1-c6)烷基(即醚)、芳氧基、硫氢基(巯基)、卤素(c1-c6)烷基(例如–cf3)、卤素(c1-c6)烷氧基(例如–ocf3)、c1-c6烷基硫醇,芳基硫醇、氨基、氨基(c1-c6)烷基、硝基、o-氨基甲酰、n-氨基甲酰、o-硫代氨基甲酰、n-硫代氨基甲酰、c-酰氨基、n-酰氨基、s-亚磺酰氨基、n-亚磺酰氨基、c-羧基、o-羧基、酰基、氰氧基、异氰氧基、硫代氰氧基、异硫代氰氧基、亚磺酰基、磺酰基和氧基(oxo)(＝o)。基团无论在何处被描述为“任选地取代的”，该基团都可被以上取代基所取代。
如本文中使用的，“核苷酸”包括含氮的杂环碱、糖和一个或多个磷酸酯基团。它们为核酸序列的单体单元。在rna中，所述糖为为核糖，而在dna中为脱氧核糖即缺少在核糖中的2'位置处存在的羟基的糖。含氮的杂环碱可为嘌呤或嘧啶碱。嘌呤碱包括腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)及其经修饰的(经改性的，modify)衍生物或类似物。嘧啶碱包括胞核嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)及其经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的c-1原子键合到嘧啶的n-1或嘌呤的n-9。
如本文中使用的，“核苷”与核苷酸在结构上相似，但是缺少5'位置处的任何磷酸酯部分。术语“核苷”在本文中按本领域技术人员理解的其普通含义使用。实例包括但不限于包括核糖部分的核糖核苷和包括脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。经修饰的的戊糖部分为其中氧原子已经被碳所取代和/或碳已经被硫或氧原子所取代的戊糖部分。“核苷”为可具有取代的碱和/或糖部分的单体。另外，核苷可掺杂到较大的dna和/或rna聚合物和低聚物中。
如本文中使用的，术语“多核苷酸”是指核酸，其通常包括dna(例如基因组dnacdna)、rna(例如mrna)、合成寡核苷酸和合成核酸类似物。多核苷酸可包括单链dna和双链dna两者。多核苷酸可包括天然或非天然的碱或其组合和天然或非天然的主链键连(linkage)，例如硫代磷酸酯pna或2′-o-甲基-rna或其组合。
如本文中使用的，术语“引物”被定义为具有游离3'oh基团和在5'末端处的修饰以容许偶联反应的单链dna(ssdna)分子。引物长度可为任意数量的碱基长并且可包括多种非天然的核苷酸。在一些实施方式中，“sbs引物”在系统例如来自illumina(sandiego,ca)的
p5和p7引物序列包括以下：
配对端组：
p5：配对端5’→3’
aatgatacggcgaccaccgagauctacac
p7：配对端5’→3’
caagcagaagacggcatacgag*at
单个读取组：
p5：单个读取：5’→3’
aatgatacggcgaccaccga
p7：单个读取5’→3’
caagcagaagacggcatacga
任选地，p5和p7引物之一或两者可包括多t尾(polyttail)。多t尾通常位于以上序列的5’端处，但是在一些情形中可位于3’端处。多t序列可包括任意数量例如2-20个的t核苷酸。
在一些实施方式中，“sbs引物”为“bcn引物”或“bcn修饰的引物”，其是指包括5'末端处的共价附着的双环[6.1.0]壬-4-炔的引物。其它非限制的示例性引物包括四嗪封端的引物、降冰片烯封端的引物、叠氮基封端的引物、炔烃封端的引物、氨基封端的引物、环氧或缩水甘油基封端的引物、硫代磷酸酯封端的引物和三唑啉二酮封端的引物。
如本文中使用的，术语“百分比表面残留”可指的是使用tetqc将p5/p7表面引物着色测量的强度。p5和p7引物在hiseq、miseq、genomeanalyzer和nextseq平台上用于测序的由illuminainc.销售的工业流动室的表面上使用。引物序列描述于美国专利公布no.2011/0059865a1中，其通过引用并入本文中。tet为具有p5/p7引物的互补序列的染料标记的寡核苷酸。tet可杂交到表面上的p5/p7引物；可将过多的tet洗掉，并且附着的染料浓度可通过使用扫描仪器例如typhoon扫描仪(generalelectric)的荧光检测而测量。
本领域技术人员将认识到，本文中描述的一些结构体可为共振形式或可由其它化学结构体一般表示的化合物的互变异构体；技术人员认识到，这样的结构体可只代表这样的化合物的实例的极少一部分。这样的化合物被认为在所描绘的结构体的范围之内，尽管这样的共振形式或互变异构体未在本文中呈现。
衬底表面
本文中描述的一些实施方式涉及包括第一区域和第二区域的衬底表面，其中第一区域包含第一聚合物层，且第一聚合物层具有第一多个官能团，和其中第一多个官能团提供用于与官能化分子共价键合的反应性位点。衬底还可具有包括第一聚合物层和第二聚合物层的第二区域，其中第二聚合物层在第一聚合物层之上、与其直接邻接、或与其邻接。第二聚合物层可完全覆盖下面的第一聚合物层，并且可任选地提供第二多个官能团。还应了解，在一些实施方式中，第二聚合物层可覆盖第一聚合物层的仅一部分。在一些实施方式中，第二聚合物层覆盖第一聚合物层的大部分，其中所述大部分包括第一聚合物层的约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约99％的覆盖率，或者由任意两个前述值限定的范围。在一些实施方式中，第一和第二聚合物层不包含硅或氧化硅。
在一些实施方式中，第一区域为图案化的。
在一些实施方式中，第一区域包括微米级或纳米级的图案。在一些这样的实施方式中，微米级或纳米级的图案包括通道、沟槽(trench)、柱、孔、或其组合。例如，所述图案可包括多个孔或形成阵列的其它特征。高密度阵列特征在于具有相隔小于约15μm的特征。中密度阵列具有相隔约15-约30μm的特征，而低密度阵列具有相隔大于约30μm的位点。本文中可用的阵列可具有例如相隔小于约100μm、约50μm、约10μm、约5μm、约1μm、或约0.5μm、或者由任意两个前述值限定的范围的特征。
在具体的实施方式中，衬底上的特征可各自具有大于约100nm2、约250nm2、约500nm2、约1μm2、约2.5μm2、约5μm2、约10μm2、约100μm2、或约500μm2、或者由任意两个前述值限定的范围的面积。替代地或另外地，特征可各自具有小于约1mm2、约500μm2、约100μm2、约25μm2、约10μm2、约5μm2、约1μm2、约500nm2、或约100nm2、或者由任意两个前述值限定的范围的面积。
衬底可包括、或者通过本文中阐述的方法可使其包括多个孔或其它特征，其至少包括约10、约100、约1x103、约1x104、约1x105、约1x106、约1x107、约1x108、约1x109或更多个特征的、或者由任意两个前述值限定的范围。替代地或另外地，衬底可至多包括约1x109、约1x108、约1x107、约1x106、约1x105、约1x104、约1x103、约100、约10或更少个特征、或者由任意两个前述值限定的范围。
特征的图案可以平均间距进行表征。可使图案有序化，使得围绕(around)平均间距的差异系数小，或者图案可为随机的(在该情形中，差异系数可相对较大)。无论在哪种情形中，平均间距可为例如至少约10nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大，或由任意两个前述值限定的范围。替代地或另外地，平均间距可为例如，至多约100μm、约10μm、约5μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小，或由任意两个前述值限定的范围。
在一些实施方式中，第二区域是未图案化的。在一些实施方式中，第二区域为第一区域的间隙空间。
在一些实施方式中，第一区域为亲水的。在一些另外的实施方式中，第一区域为疏水的。第二区域进而可为亲水的或疏水的。在具体的情形中，第一和第二区域关于疏水性和亲水性具有相反的特性。
在一些实施方式中，第一聚合物层的第一多个官能团选自c8-14环烯烃、8-14元杂环烯烃、c8-14环炔烃、8-14元杂环炔烃、炔基、乙烯基、卤素、叠氮基、氨基、酰氨基、环氧基、缩水甘油基、羧基、腙基、肼基、羟基、四唑基、四嗪基、氧化腈、氮宾、氮碳基、或硫醇、或其任选地被取代的变体和组合。在一些这样的实施方式中，第一多个官能团选自c8-14环烯烃、c8-14环炔烃、炔基、乙烯基、卤素、叠氮基、氨基、酰氨基、环氧、缩水甘油基、羧基、腙基、肼基、羟基、四唑基、四嗪基、氧化腈、氮宾、氮碳基、或硫醇、或其任选地被取代的变体和组合。在一些这样的实施方式中，第一多个官能团选自卤素、叠氮基、炔基、羧基、环氧、缩水甘油基、降冰片烯、或氨基、或其任选地被取代的变体和组合。
在一些实施方式中，第二聚合物层包含与第一聚合物层中的第一多个官能团不同的第二多个官能团。
在一些实施方式中，第一聚合物层的厚度大于第二聚合物层的厚度。
在一些实施方式中，衬底表面还包括官能化分子，其中官能化分子包括通过与第一多个官能团的反应共价附着到表面的聚合物、水凝胶、氨基酸、肽、核苷、核苷酸、多核苷酸、糖、蛋白质、或其组合。可在本文中阐述的方法和组合物中使用的示例性水凝胶包括但不限于，具有胶质结构的那些，例如琼脂糖；聚合物网状结构，例如明胶；或交联聚合物结构，例如聚丙烯酰胺，sfa(参见例如美国专利申请公布no.2011/0059865a1，其通过引用并入本文中)或聚(n-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam，参见例如美国专利申请公布no.2014/0079923a1或2015/0005447a1，其各自通过引用并入本文中)。
在一些实施方式中，官能化分子包括pazam。在一些这样的实施方式中，官能化分子还包括共价键合到pazam的寡核苷酸。
pazam
pazam由以下结构表示：
其中n为1-20,000范围内的整数，且m为1-100,000范围内的整数。在一些实施方式中，pazam为线型聚合物。在一些另外的实施方式中，pazam为轻微交联的聚合物。
可将pazam官能化或修饰以在本文中阐述的组合物或方法中使用。例如，可通过附着到衬底表面而使用的官能化的聚合物的非限制性实例公开于美国专利no.9,012,022中，该专利通过引用以其整体由此并入。
在一些实施方式中，衬底还包括沉积在第一和第二聚合物层之间的光子晶体的层。在一些这样的实施方式中，光子晶体包括具有高折射率和低吸附特性的材料。在一个实施方式中，光子晶体材料包括ta2o5。
制造方法
本文中描述的一些实施方式涉及用于制备衬底的方法，且包括：提供具有第一区域和第二区域的衬底；将第一光致固化聚合物组合物的层施加或沉积到第一区域和第二区域；在第一光致固化聚合物组合物的层之上施加或沉积第二光致固化聚合物组合物以完全覆盖第一光致固化聚合物组合物的层；使第二光致固化聚合物组合物的层与具有多个微米级或纳米级的图案的模板接触；向模板或衬底施加压力以将所述微米级或纳米级的图案转移到第一和第二光致固化聚合物组合物的层；用uv光进行照射以使第一和第二光致固化聚合物组合物的层固化，使得第一和第二光致固化聚合物组合物的层分别形成第一聚合物层和第二聚合物层；和将模板从衬底分离；其中将第二聚合物层的至少一部分穿孔或穿透(penetrate)以使下面的第一聚合物层暴露。还应该了解，在一些实施方式中，第二光致固化聚合物组合物可仅覆盖第一光致固化聚合物组合物的一部分，导致在uv固化之后第二聚合物层覆盖第一聚合物层的大部分，其中所述大部分包括第一聚合物层的大于约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或约99％的覆盖率，或者由任意两个前述值限定的范围。在一些另外的实施方式中，可使用可热致固化的聚合物组合物代替光致固化聚合物组合物。
在一些实施方式中，第一光致固化聚合物组合物的层的厚度大于第二光致固化聚合物组合物的层的厚度。
在一些实施方式中，将第二聚合物层完全穿孔或穿透以使下面的第一聚合物层暴露。
在一些实施方式中，所述方法还包括在施加第二光致固化聚合物组合物的层之前将第一光致固化聚合物组合物的层半固化。如本文中使用的术语“半固化”是指使光致固化聚合物组合物暴露到uv和/或热有限的时间段以产生不完全聚合的层。在一些实施方式中，百分比的聚合完成度为大于约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％，或者由任意两个前述值限定的范围。半固化步骤的意图包括但不限于，当第二光致固化聚合物组合物的层在上面沉积时，防止第一光致固化聚合物组合物和第二光致固化聚合物组合物之间的物理混合，并且防止第一光致固化聚合物组合物的层的除去。
在一些实施方式中，所述方法还包括在与模板接触之前干燥第一和第二光致固化聚合物组合物的层。
在一些实施方式中，所述方法还包括在用uv光照射之后干燥第一聚合物和第二聚合物层。
在一些实施方式中，所述微米级或纳米级的图案包括通道、沟槽、柱、孔、或其组合。
在一些实施方式中，第一聚合物层包括第一多个官能团。在一些实施方式中，第二聚合物层包括与第一多个官能团不同的第二多个官能团。
在一些实施方式中，第一聚合物层的第一多个官能团选自c8-14环烯烃、8-14元杂环烯烃、c8-14环炔烃、8-14元杂环炔烃、炔基、乙烯基、卤素、叠氮基、氨基、酰氨基、环氧、缩水甘油基、羧基、腙基、肼基、羟基、四唑基、四嗪基、氧化腈、氮宾、氮碳基、或硫醇、或者其任选地被取代的变体和组合。在一些这样的实施方式中，第一多个官能团选自卤素、叠氮基、炔基、羧基、环氧基、缩水甘油基、降冰片烯、或氨基、或者其任选地被取代的变体和组合。
在一些实施方式中，衬底表面还具有官能化分子，其包括共价附着到表面的聚合物、水凝胶、氨基酸、肽、核苷、核苷酸、多核苷酸、糖、蛋白质、或其组合。在一些实施方式中，官能化分子通过与第一多个官能团的反应共价附着到衬底表面。在一些进一步的实施方式中，官能化分子包括聚(n-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam)或其衍生物。
图1说明使用本文中描述的纳米压印光刻法制备双层衬底的流程的实施方式。系统100包括衬底101、打底层(primelayer)102、第一光致固化聚合物组合物的层103、第二光致固化聚合物组合物的层104和印模105。第二光致固化聚合物组合物的层104在上面并且与第一光致固化聚合物组合物的层103直接接触。另外，在该实施方式中，层104的厚度比层103的厚度薄。在软烘烤光致固化聚合物前体层以除去过多的溶剂之后，将印模105压接第二光致固化聚合物组合物的层104以在第二光致固化聚合物组合物104和第一光致固化聚合物组合物的层103上形成压印，使得层104被印模105的齿部(tooth)穿孔。在uv固化之后，将印模105剥离。
来自印模105的图案106由此被转印到衬底，导致具有两个聚合物层的图案化的衬底：聚合物层109由第一光致固化聚合物组合物103形成并且包括化学官能团108。聚合物层110由第二光致固化聚合物组合物104形成并且包括化学官能团107。衬底可经历进一步的热固化以完成uv固化并且锁住压印的形貌。在一些实施方式中，所述热固化可在约60℃-约300℃范围内的温度下进行。
在一些实施方式中，聚合物层109中的官能团(x)在流动室的孔表面内并且可对于进一步的官能化是可用的，以在必要时捕获单链dna(ssdna)用于dna测序工序(程序)。该官能化过程可包括或可不包括将聚合物载体(例如pazam)选择性地捕获到流动室的孔表面。聚合物层110中的官能团(y)在与流动室通道腔接触的间隙区内。官能团y还可充当用于进一步修饰的锚定点，所述修饰使用与聚合物层109中使用的化学正交的化学。例如，聚合物层110或其修饰物将充当对于间隙区域内的聚合物层109中存在的官能团的阻挡物或钝化层。
光致固化聚合物组合物
在本申请中可使用多种光致固化聚合物组合物。
在一些实施方式中，可使用包含硅倍半氧烷笼(也称为“poss”单元，如以下化学结构中所示的)的光致固化聚合物前体组合物：
这些单体单元典型地具有八个臂官能团r1至r8。在一些实施方式中，r1―r8包括选自叠氮基、环氧基、缩水甘油基、缩水甘油基醚、氨基甲酸酯、降冰片烯、丙烯酸、马来酸、丙烯酸酯、乙烯基、乙炔基、或其组合的部分。
在一些实施方式中，官能团r1―r8是相同的。在一些另外的实施方式中，r1―r8是不相同的。在一个实施方式中，r1―r8各自以环氧基团封端，所述环氧基团容许聚合物前体在使用紫外(uv)光照射时聚合成交联基体。
在一些实施方式中，向光致固化聚合物组合物加入包含环氧基团和至少一个其它正交的官能团(x或y)的分子。环氧基团使添加剂共价地交联到聚合物基体中。x或y基团为修饰固化的聚合物层的性质的感兴趣的官能团。聚合物化学的一般图式在以下方案1中示出：
方案1：用于得到包含感兴趣的官能团(x或y)的交联的聚合物膜的光致固化聚合物组合物的聚合。
在一些情形中，硅烷仅对于需要粘附层的衬底是必须的。最终聚合物内的单体比率(p：q：n：m)取决于初始聚合物制剂混合物中单体的化学计量。
硅烷分子包含可共价地结合到接触衬底的第一和下面的聚合物层中的环氧单元。对于在半固化的第一层上沉积的第二和上面的聚合物层，不需要这样的硅烷分子。第一聚合物层将自然地将聚合传播到第二聚合物层的单体单元中，共价地将它们连接在一起。
在本文中描述的方法的一些实施方式中，将经打底的衬底用包含结构
衬底孔壁中的溴化亚烷基基团充当用于进一步的空间选择性官能化的锚定点。例如，溴化亚烷基基团可与叠氮化钠进行反应以形成叠氮化物涂布的孔表面。然后，该叠氮化物表面可使用如方案2中所概述的铜催化的点击化学(clickchemistry)直接用于捕获炔封端的低聚物、或者使用张力促进的(strain-promoted)无催化剂的点击化学捕获双环[6.1.0]壬-4-炔(bcn)封端的低聚物。关于用于sbs应用的张力促进的无催化剂的开环反应的详细公开内容在美国专利公布2015/0005447a1中公开，该专利通过引用以其整体由此并入。
方案2：包含溴化亚烷基的固化的聚合物表面转化为叠氮化物以及随后使用炔/低聚物点击化学的低聚物偶联。
在方案2中，“r”表示如方案1中所示的poss和硅烷单元。叠氮化物的转化和接枝将在沉积第二光致固化聚合物组合物的层之后进行且将为确保化学修饰而完成的双层压印过程与衬底的孔表面隔离开。
替代地，叠氮化钠可用降冰片烯官能化的胺或二苯并环辛炔(dibo)官能化的胺替代以向聚合物提供张力环部分，其可随后与四嗪官能化的低聚物经历无催化剂的环张力促进的点击反应以将引物接枝到表面。关于感兴趣的生物分子的化学官能化的详细公开内容由sapsford等人的chem.rev.2003,113,1904-2074进行综述。
制备将成为间隙聚合物层的第二光致固化聚合物组合物的一个实例在方案3中概述。
方案3：
将缩水甘油加入到第二光致固化聚合物组合物会产生具有大量羟基的聚合物表面(r表示如方案1中所示的poss和硅烷单元)。
在本文中描述的方法的另一实施方式中，溴化亚烷基基团可与5-降冰片烯-2-甲胺进行反应，以形成降冰片烯涂布的孔表面。然后，包含叠氮化物的聚合物pazam可选择性地偶联到位于所述孔中的该降冰片烯表面，且进一步用炔封端的低聚物进行接枝，如方案4中所例示的。还可经由无催化剂的张力促进的环加成反应使用bcn封端的低聚物代替炔封端的低聚物。
方案4：溴化亚烷基孔表面转化为准备用于pazam捕获的降冰片烯表面和随后的接枝。
用惰性第二聚合物层覆盖衬底的间隙区域，pazam偶联和接枝被定位(局部化)到衬底的孔(r表示如方案1中所示的poss和硅烷单元)。另外，因为在间隙区中不存在降冰片烯部分，所以多余的pazam可通过温和的溶剂洗涤而不是侵蚀性的抛光除去。两种途径均导致孔的图案化的表面，其中孔表面选择性地修饰成准备用于测序的状态而间隙区保持惰性。
替代地，通过与降冰片烯部分进行反应四嗪封端的低聚物可直接接枝到聚合物，由此省去pazam偶联步骤。
在各光致固化聚合物组合物内的官能团的选择取决于所使用的添加剂的选择。有很多可用于实现该目的的小分子、聚合物和硅倍半氧烷。另外，这些添加剂可在单层纳米压印光刻法中使用以将新的化学官能团赋予到固化的聚合物层中，或者改变聚合物层的性质例如表面能，尽管将它们与双层nil过程结合使用将大大地简化流程。
可在本申请的光致固化聚合物组合物中使用的添加剂的非限制性实例包括：表溴醇、缩水甘油、缩水甘油基炔丙基醚、甲基-5-降冰片烯-2,3-二羧酸酐、3-叠氮基-1-丙醇、叔丁基n-(2-环氧乙基甲基)氨基甲酸酯、丙炔酸、11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺、顺式-环氧琥珀酸、5-降冰片烯-2-甲基胺、4-(2-环氧乙基甲基)吗啉、氯化缩水甘油基三甲基铵、磷霉素(phosphomycin)二钠盐、聚甲基丙烯酸缩水甘油基酯、聚(丙二醇)二缩水甘油基醚、聚(乙二醇)二缩水甘油基醚、聚[二甲基硅氧烷-共-(2-(3,4-环氧环己基)乙基)甲基硅氧烷]、聚[(丙基甲基丙烯酰基-七异丁基-pss)-共-羟基乙基甲基丙烯酸酯]、聚[(丙基甲基丙烯酰基-七异丁基-pss)-共-(叔丁基甲基丙烯酸酯)]、[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷、反式-环己烷二醇异丁基poss、氨基丙基异丁基poss、八四甲基铵poss、聚乙二醇poss、八二甲基硅烷poss、八铵poss、八马来酰胺酸poss、三降冰片烯基异丁基poss、热解的二氧化硅、表面活性剂、或其组合和衍生物。
制造包含光子晶体的衬底的方法
本文中描述的一些实施方式涉及用于制备衬底的方法，其包括：提供在衬底表面上具有第一图案化的聚合物层的衬底；在第一图案化的聚合物层上沉积第一光子晶体材料使得第一光子晶体材料采取第一图案化的聚合物层中的图案；和在光子晶体材料之上形成第二图案化的聚合物层。
在一些实施方式中，所述方法还包括在第二图案化的聚合物层上沉积第二光子晶体材料使得第二光子晶体材料采取第二图案化的聚合物层中的图案。
第一和第二图案化的聚合物层可独立地通过对于本领域技术人员已知的多种技术制备。在一些实施方式中，第一和第二图案化的聚合物层通过机械压凸、纳米压印光刻法、或无抗蚀剂的纳米压印光刻法制备。在一个具体的实施方式中，图案化的聚合物层通过无抗蚀剂的纳米压印光刻法制备。在一些实施方式中，第一聚合物层中的图案与第二聚合物层中的图案是基本相同的。在一些另外的实施方式中，第一聚合物层中的图案与第二聚合物层中的图案是不同的；例如，它们对于第二聚合物层中的图案是互补的。
在一些实施方式中，通过溅射沉积将第一光子晶体材料沉积到第一聚合物层上。如本文中使用的，“溅射沉积”是指通过溅射的薄膜/涂层沉积的物理气相沉积(pvd)方法。该方法包括将材料从来源喷出到衬底上。具体地，在本文中描述的方法中使用的溅射沉积在衬底表面上形成光子晶体涂层的薄层。在一些实施方式中，在溅射沉积中使用的光子晶体材料包括具有高折射率和低吸附特性的金属和金属氧化物。在一个具体的实施方式中，光子晶体材料包括五氧化二钽(也称为氧化钽，ta2o5)。当将下面的表面图案化时，光子晶体层/涂层也将采取下面的表面(例如第一和第二聚合物层)中的图案，因此在衬底表面上形成光学特征。基于所述图案的设计，这使得能够在下游的测序成像过程期间在衬底表面上操纵光。
在一些实施方式中，第一和第二光子晶体材料均包含ta2o5。在一些实施方式中，第一图案化的聚合物层和第二图案化的聚合物层中的图案包括微米级或纳米级通道、沟槽、柱、孔、或其组合。
图2说明使用纳米压印光刻法制备包含光子晶体材料的衬底的流程工艺的一种实施方式。首先，在衬底202表面上沉积第一光致固化聚合物组合物的层203，和将印模201压印在光致固化聚合物组合物203上。在uv固化之后，形成具有纳米图案204的聚合物层。然后，在所述聚合物层的表面上溅射光子晶体材料205的薄涂层。随后，在光子晶体205之上沉积第二光致固化聚合物组合物的层206，并且使其经历如上所述的相同的纳米压印过程以形成具有纳米图案207的第二聚合物层。
本文中描述的一些实施方式涉及通过本文中描述的任意方法制备的衬底。
衬底材料
在一些实施方式中，本申请中使用的衬底包括基于二氧化硅的衬底，例如玻璃、热解的二氧化硅和其它包含二氧化硅的材料。在一些实施方式中，基于二氧化硅的衬底还可为硅、二氧化硅、氮化硅、氢化有机硅(硅烷，siliconehydride)。在一些实施方式中，本申请中使用的衬底包括塑料材料，例如聚乙烯、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚丙烯、尼龙、聚酯、聚碳酸酯和聚(甲基丙烯酸甲酯)。优选的塑料材料为聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚苯乙烯和环状烯烃聚合物衬底。在一些实施方式中，衬底为基于二氧化硅的材料或塑料材料。在一个实施方式中，所述衬底具有包含玻璃的至少一个表面。
在一些另外的实施方式中，所述衬底可为金属。在一些这样的实施方式中，所述金属可为金。在一些实施方式中，所述衬底具有包含金属氧化物的至少一个表面。在一个实施方式中，所述表面包含氧化钽或氧化钛。
还可采用丙烯酰胺、烯酮或丙烯酸酯作为衬底材料。其它衬底材料可包括但不限于砷化镓(galliumarsenide)、磷化铟、铝、陶瓷、聚酰亚胺、石英、树脂、芳基叠氮化物、聚合物和共聚物。在前的列表旨在说明而非限制本申请。
在一些实施方式中，衬底和/或衬底表面可为石英。在一些另外的实施方式中，衬底和/或衬底表面可为半导体即gaas或ito。
衬底可包含单一材料或多种不同的材料。衬底可为复合物或层叠体。衬底可为平的、圆的、织构化的(textured)和图案化的。例如通过在非金属表面形成特征的金属垫可形成图案，例如，如在美国专利申请序列号13/661,524中描述的，该专利申请其通过引用并入本文中。另一种可用的图案化的表面为具有在表面上形成的孔特征的表面，例如，如在美国序列号13/787,396、美国专利申请公布no.2011/0172118a1或美国专利no.7,622,294中描述的，其各自通过引用并入本文中。对于使用图案化的衬底的实施方式，可将凝胶选择性地附着到图案特征(例如可将凝胶附着到金属垫，或可将凝胶附着到孔的内部)，或者替代地，可将凝胶均匀地附着在图案特征和间隙区域两者上。
在分子阵列的制备和使用中使用基于塑料的衬底的优势包括成本：通过例如注射成型制备适当的基于塑料的衬底通常比基于二氧化硅的衬底的例如通过蚀刻和结合的制备是较不昂贵的。另一优势为近乎无限的塑料种类，容许细调载体的光学性质以符合旨在将它用于其的或可将它投入到其的应用。
当使用金属作为衬底或作为衬底上的特征时，由于期望的应用，如下是可能的：金属的导电性可容许调制基于dna的传感器中的电场。通过该方式，可增强dna失配辨别、可影响固定的寡核苷酸分子的取向、或者可加快dna杂交动力学。
所述衬底可为基于二氧化硅的。另外，所采用的衬底的形式和形状按照实践本申请的应用而变。然而，通常，载体材料例如二氧化硅例如热解的二氧化硅的载玻片在分子的制备和随后的一体化(整合，integration)中是尤其有用的。在本申请的实践中尤其有用的是以商品名spectrasiltm销售的热解的二氧化硅载玻片。尽管如此，对于本领域技术人员显然的是，本申请同样适用于衬底(包括基于二氧化硅的载体)的其它表现形式(presentation)，例如珠、棒等。
在一些实施方式中，衬底表面包括涂布官能分子的区域和不具有涂层的惰性区域两者。在一些这样的实施方式中，官能化分子涂层为水凝胶或聚合物涂层。涂布官能分子的区域可包括反应性位点，且因此可用于通过化学键或其它分子相互作用附着分子。在一些实施方式中，涂布官能分子的区域(例如反应性特征、垫、珠或孔)和惰性区域(例如间隙区域)可交替以形成图案或网格。这样的图案可为一维或二维的。在一些实施方式中，惰性区域可选自玻璃区域、金属区域、遮掩区域或间隙区域。替代地，这些材料可形成反应性区域。惰性或反应性将取决于在衬底上使用的化学物质和工艺。在一个实施方式中，所述表面包括玻璃区域。在另一实施方式中，所述表面包括金属区域。在又一实施方式中，所述表面包括遮掩区域。在本文中描述的组合物的一些实施方式中，所述衬底可为珠。可用本公开的聚合物涂布或可在本文中阐述的组合物或方法中以其它方式使用的非限制的示例性衬底材料描述在美国序列号13/492,661和13/661,524中，其各自通过引用并入本文中。
在一些实施方式中，本文中描述的衬底形成流动室的至少部分或位于流动室中。在一些这样的实施方式中，所述流动室还包括经由官能分子涂层例如聚合物涂层附着到衬底表面的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸以多核苷酸簇存在于流动室中，其中多核苷酸簇的多核苷酸经由聚合物涂层附着到流动室的表面。在这样的实施方式中，流动室主体的附着多核苷酸的表面被认为是所述衬底。在其它实施方式中，将具有涂布聚合物的表面的单独衬底插入到流动室的主体中。在优选的实施方式中，流动室为分成多个流道(lane)或多个扇区的流动腔室，其中多个或多个扇区的一个或多个包括涂布有本文中描述的共价附着的聚合物涂层的表面。在本文中描述的流动室的一些实施方式中，单一的多核苷酸簇内附着的多核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列。在本文中描述的流动室的一些实施方式中，不同的多核苷酸簇的附着的多核苷酸具有不同或不相似的核苷酸序列。本文中阐述的方法或组合物中可使用的示例性流动室和用于制造流动室的衬底包括但不限于，可从illumina,inc.(sandiego,ca)购买获得或在美国公布no.2010/0111768a1、2011/0059865a1、2012/0270305、2014/0079923a1、或2015/0005447a1中描述的那些，所述美国公布各自通过引用并入本文中。
在一些实施方式中，在本申请中使用的衬底为基于二氧化硅的衬底。通常，基于二氧化硅的衬底表面以某种方式进行化学修饰以共价地附着能够与官能化分子例如水凝胶、聚合物或部分形成的水凝胶(例如预聚物(prp))进行反应的化学反应基团。表面活化剂典型地为有机硅烷化合物。在一个实施方式中，表面活化剂为称为“结合硅烷”或“交联硅烷”且可从pharmacia购买获得的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷，尽管还知晓其它基于硅的表面活化剂，例如单乙氧基二甲基甲硅烷基丁醛、3-巯基丙基-三甲氧基硅烷和3-氨基丙基三甲氧基硅烷(全部可获自aldrich)。通过该方式，侧链(悬挂的，pendant)官能团例如氨基、醛基或能聚合的基团(例如烯烃)可附着到二氧化硅。
在本文中描述的任何实施方式中，所述衬底可选自玻璃衬底、二氧化硅衬底、石英衬底、塑料衬底、金属衬底、金属氧化物衬底、或其组合。在一些实施方式中，所述衬底为玻璃衬底。在一个实施方式中，所述衬底为流动室的部分。
分析应用
一些实施方式涉及使用本文中描述的衬底检测分析物的方法。在一些实施方式中，所述分析物选自核酸、多核苷酸、蛋白质、抗体、对于抗体的表位、酶、或小分子药物。在一个实施方式中，所述分析物为多核苷酸。在一个实施方式中。所述检测包括测定多核苷酸的核苷酸序列。
本公开的包含核酸阵列的衬底可用于任意的多个意图。用于核酸的特别期望的用途为充当杂交到具有互补序列的目标核酸的捕获探针。例如经由恢复为所述捕获探针的标记(标签)可检测曾经杂交到所述捕获探针的目标核酸。用于经由杂交到捕获探针检测目标核酸的方法在本领域中是已知的，并且包括例如，美国专利no.7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或美国专利公布no.2005/0053980a1；2009/0186349a1或2005/0181440a1中描述的那些，其各自通过引用并入本文中。例如，借助将捕获探针杂交到承载标记的目标探针可使标记恢复为捕获探针。在另一实例中，通过将目标探针杂交到捕获探针使得捕获探针通过连接到标记的寡核苷酸(例如经由连接酶活性)或通过标记的核苷酸的加入(例如经由聚合酶活性)可延长，可使标记恢复为捕获探针。
使用核酸的一些实施方式可包括在所述衬底上扩增核酸的步骤。很多不同的dna扩增技术可与本文中描述的衬底结合使用。可使用的示例性技术包括但不限于，聚合酶链反应(pcr)、滚环扩增(rca)、多重置换扩增(mda),或随机引物扩增(rpa)。在具体的实施方式中，可将用于扩增的一种或多种引物附着到衬底(例如经由聚合物涂布)。在pcr实施方式中，可将用于扩增的引物的一种或两种附着到衬底。采用两种附着的引物的形式(手段，format)通常被称为桥接扩增(bridgeamplification)，因为双链扩增子在已经复制的模板序列两侧的两个附着的引物之间形成桥状结构。可用于桥接扩增的示例性的试剂和条件描述在例如美国专利no.5,641,658；美国专利公布no.2002/0055100；美国专利no.7,115,400；美国专利公布no.2004/0096853；美国专利公布no.2004/0002090；美国专利公布no.2007/0128624；和美国专利公布no.2008/0009420中，其各自通过引用并入本文中。
pcr扩增还可通过附着到衬底的扩增引物之一和溶液中的第二引物进行。使用一个附着的引物和可溶性引物的组合的示例性形式为乳液pcr，如描述例如在dressman等人的proc.natl.acad.sci.usa100：8817-8822(2003)、wo05/010145、或者美国专利公布no.2005/0130173或2005/0064460，其各自通过引用并入本文中。乳液pcr对于所述形式是说明性的，并且将理解，为了本文中阐述的方法的意图，乳液的使用是任选的并且实际上对于若干种实施方式，不使用乳液。此外，引物不需要直接附着到衬底或固体载体，如epcr参考文献中阐述的，而是可附着到聚合物涂层，如本文中阐述的。
可改造rca技术以在本公开的方法中使用。rca反应中可使用的示例性组分和rca通过其产生扩增子的原理描述在例如lizardi等人的nat.genet.19：225-232(1998)和us2007/0099208a1中，其各自通过引用并入本文中。用于rca的引物可在溶液中或附着到聚合物涂层。
可改造mda技术以在本公开的方法中使用。用于mda的一些基本原理和可用条件描述在例如dean等人的procnatl.acad.sci.usa99：5261-66(2002)；lage等人的genomeresearch13：294-307(2003)；walker等人的molecularmethodsforvirusdetection,academicpress,inc.,1995；walker等人的nucl.acidsres.20：1691-96(1992)；us5,455,166；us5,130,238；和us6,214,587，其各自通过引用并入本文中。对于mda使用的引物可在溶液中或附着到聚合物涂层。
在具体的实施方式中，可使用以上示例性的扩增技术的组合。例如，可以组合使用rca和mda，其中rca用于在溶液中(例如使用溶液相引物)产生连环扩增子。然后，该扩增子可用作使用(例如经由聚合物涂层)附着到衬底的引物的mda的模板。在该实例中，在rca和mda的组合步骤之后产生的扩增子将附着到所述衬底。
在一些实施方式中，本文中描述的衬底可用于测定多核苷酸的核苷酸序列。在这样的实施方式中，所述方法可包括如下步骤(a)使多核苷酸聚合酶与(例如经由本文中描述的聚合物或水凝胶涂层的任一种)附着到衬底表面的多核苷酸簇接触；(b)向衬底表面提供核苷酸使得当一个或多个核苷酸被多核苷酸聚合酶利用时产生能检测的信号；(c)在一个或多个附着的多核苷酸(或者由附着的多核苷酸产生的一个或多个簇)处检测信号；和(d)重复步骤(b)和(c)，从而测定附着衬底的多核苷酸的核苷酸序列。
通过本领域中已知的多种方法可使用核酸测序测定多核苷酸的核苷酸序列。在优选的方法中，可采用通过合成法测序(sbs)测定(例如经由本文中描述的聚合物涂层的任一种)附着到衬底表面的多核苷酸的核苷酸序列。在这样的方法中，向与多核苷酸聚合酶相关的模板多核苷酸提供一个或多个核苷酸。多核苷酸聚合酶将一个或多个核苷酸掺入到与多核苷酸模板互补的新合成的核酸链中。所述合成引发自与模板多核苷酸的一部分或者在模板多核苷酸的一端处共价键合的通用或非可变的核酸的一部分互补的寡核苷酸引物。由于对于模板多核苷酸掺入核苷酸，产生容许测定哪种核苷酸在测序过程的各步骤期间已经掺入的能检测的信号。通过该方式，可产生核酸的与模板多核苷酸的至少一部分互补的序列，从而允许测定模板多核苷酸的至少一部分的核苷酸序列。流动室提供用于容纳通过本公开的方法制造并且进行通过合成法测序(sbs)或包括重复地循环输送试剂的其它检测技术的阵列的方便形式。例如，为了引发第一次sbs循环，一个或多个标记的核苷酸、dna聚合酶等可流入/通过容纳由本文中阐述的方法制成的核酸阵列的流动室。可检测阵列的引物延长致使在其处掺入标记的核苷酸的那些位点。任选地，核苷酸可还包括一旦核苷酸已经加入到引物就终止进一步的引物延长的可逆的终止性。例如，具有可逆的终止子部分的核苷酸类似物可加入到引物，使得随后的延长直到输送去封闭剂(解封剂，deblockingagent)以除去所述部分才能发生。因此，对于使用可逆的终止的实施方式，可将去封闭试剂输送到流动室(在检测发生之前或之后)。可在多个输送步骤之间进行洗涤。然后，可重复所述循环n次以通过n个核苷酸延长引物，从而检测长度n的序列。为了与通过本公开的方法制造的阵列一起使用而可容易地改装的示例性sbs工序、流体系统和检测平台描述在例如bentley等人的nature456：53-59(2008)、wo04/018497；us7,057,026；wo91/06678；wo07/123744；us7,329,492；us7,211,414；us7,315,019；us7,405,281和us2008/0108082中，其各自通过引用以其整体并入本文中。
可使用采用循环反应的其它测序工序，例如焦磷酸测序(pyrosequencing)。焦磷酸测序当特定的核苷酸掺入到初生核酸链中时检测无机焦磷酸盐(ppi)的释放(ronaghi,等人的analyticalbiochemistry242(1),84-9(1996)；ronaghi的genomeres.11(1),3-11(2001)；ronaghi等人的science281(5375),363(1998)；us6,210,891；us6,258,568和us6,274,320，其各自通过引用以其整体并入本文中)。在焦磷酸测序中，释放的ppi可通过经由atp硫酸化酶直接转化为三磷酸腺苷(atp)检测，并且所产生的atp的水平可经由荧光素酶产生的光子检测。因此，测序反应可经由发光检测系统监测。对于基于荧光的检测系统使用的激发辐射源对于焦磷酸测序工序不是必须的。对于将焦磷酸测序应用到本公开的阵列的可用的流体系统、检测器和工序描述在例如wo12/058096a1、us2005/0191698a1、us7,595,883和us7,244,559中，其各自通过引用以其整体并入本文中。
通过连接测序的反应也是可用的，其包括例如shendure等人的science309：1728-1732(2005)；us5,599,675；和us5,750,341中描述的那些，其各自通过引用以其整体并入本文中。一些实施方式可包括通过杂交测序的工序，如描述在例如bains等人的journaloftheoreticalbiology135(3),303-7(1988)；drmanac等人的naturebiotechnology16,54-58(1998)；fodor等人的science251(4995),767-773(1995)；和wo1989/10977中，其各自通过引用以其整体并入本文中。在通过连接测序和通过杂交测序两者的工序中，阵列位点处存在的核酸经历寡核苷酸的输送和检测的重复循环。可容易地改装本文中或本文所引用的参考文献中阐述的用于sbs方法的流体系统以输送用于通过连接测序或通过杂交测序的工序的试剂。典型地，所述寡核苷酸是荧光标记的，并且可使用与本文中或本文所引用的参考文献中关于sbs工序描述的那些类似的荧光检测器进行检测。
一些实施方式可采用涉及dna聚合酶活性的实时监测的方法。例如，核苷酸的掺入可通过承载荧光团的聚合酶和γ-磷酸盐-标记的核苷酸之间的荧光能量共振转移(fret)相互作用或通过零模波导(zeromodewaveguide，zmw)进行检测。基于fret的测序的技术和试剂描述在例如levene等人的science299,682–686(2003)；lundquist等人的opt.lett.33,1026–1028(2008)；korlach等人的proc.natl.acad.sci.usa105,1176–1181(2008)中，其公开内容通过引用以其整体并入本文中。
一些sbs实施方式包括在核苷酸掺入到延长产物中时释放的质子的检测。例如，基于释放质子的检测的测序可使用从iontorrent(guilford，ct，lifetechnologies的子公司)可购买获得的电检测器和相关的技术、或us2009/0026082a1；us2009/0127589a1；us2010/0137143a1；或us2010/0282617a1中描述的测序方法和系统，其各自通过引用以其整体并入本文中。
对于本公开的装置的另一种可用的应用为例如，基因表达分析的部分。基因表达可使用rna测序技术、例如称为数字rna测序的那些进行检测或定量。rna测序技术可使用本领域中已知的测序方法学、例如以上阐述的那些进行。基因表达还可使用通过直接杂交到衬底进行的杂交技术或使用在衬底上检测其产物的多路(多重)分析进行检测或定量。本公开的例如已经通过本文中阐述的方法制造的衬底还可用于测定来自一个或多个个体的基因组dna样品的基因型。可对本公开的阵列进行的用于基于基因阵列的表达和基因型分析的示例性方法描述在美国专利no.7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或者美国专利公布no.2005/0053980a1；2009/0186349a1或us2005/0181440a1中，其各自通过引用以其整体并入本文中。
在采用流动室的上述方法的一些实施方式中，仅单一类型的核苷酸在单个流动步骤期间存在于流动室中。在这样的实施方式中，所述核苷酸可选自datp、dctp、dgtp、dttp及其类似物。在采用流动室的上述方法的其它实施方式中，多种不同类型的核苷酸在单个流动步骤期间存在于流动室中。在这样的方法中，所述核苷酸可选自datp、dctp、dgtp、dttp及其类似物。
在各流动步骤期间掺入的用于附着到流动室中存在的衬底表面上的聚合物涂层的多核苷酸的一种或多种的一种核苷酸或多种核苷酸的测定通过检测在多核苷酸模板处或附近产生的信号实现。在上述方法的一些实施方式中，能检测的信号包括光学信号。在其它的实施方式中，能检测的信号包括非光学信号。在这样的实施方式中，非光学信号包括多核苷酸模板的一种或多种处或附近的ph变化。
本公开的衬底的应用和用途已经在本文中对于核酸进行例举。然而，将理解，其它分析物可附着到本文中阐述的衬底并且进行分析。一种或多种分析物可存在于本公开的衬底中或其上。本公开的衬底对于检测分析物或实施与分析物的合成反应是尤其有用的。因此，待检测、表征、修饰、合成等的多种分析物的任一种可存在于本文中阐述的衬底中或其上。示例性分析物包括但不限于，核酸(例如dna、rna或其类似物)、蛋白质、多糖、细胞、抗体、表位、受体、配体、酶(例如激酶、磷酸酶或聚合酶)、小分子药物候选者等。衬底可包括来自分析物文库的多种不同物种。例如，所述物种可为来自抗体文库的不同抗体、来自核酸文库的具有不同序列的核酸、来自蛋白质文库的具有不同结构和/或功能的蛋白质、来自小分子组合文库的药物候选者等。
在一些实施方式中，分析物可分配到衬底上的特征，使得它们可单独地辨别。例如，各分析物的单个分子可存在于各特征处。替代地，分析物可作为群落或种群存在，使得不必辨别个体分子。群落或种群相对于仅包含单种分析物的情况是均匀的(即使在多个拷贝中)。以核酸为例，衬底上的各特征可包括核酸的群落或种群，并且群落或种群中的每个核酸可具有相同的核苷酸序列(单链的或双链的)。这样的群落可通过如本文中之前阐述的簇扩增或桥接扩增形成。目标序列的多个重复可存在于单一核酸分子例如使用滚环扩增工序形成的多连体中。因此，衬底上的特征可包含单种分析物的多个拷贝。替代地，特征处的分析物的群落或种群可包括两种或更多种不同物种。例如，衬底上的一个或多个孔可各自包含具有两种或更多种不同核酸物种(即具有不同序列的核酸分子)的混合群落。混合群落中的两种或更多种核酸物种可以不可忽视的、例如容许在混合群落中检测不止一种核酸的量存在。
多核苷酸阵列和测序应用
本文中描述的方法的其它实施方式涉及使用本文中描述的衬底制备多核苷酸的阵列。在这样的实施方式中，所述方法可包括如下步骤：通过与附着到第一聚合物层的中间(物)涂层的反应直接或间接地将多个寡核苷酸共价附着到衬底表面上的第一聚合物层中存在的反应性位点(即第一多个官能团)；使附着到衬底的多个寡核苷酸与待扩增的模板接触，各模板包括能够杂交到所述寡核苷酸的序列；和，使用所述寡核苷酸将模板进行扩增，从而产生多核苷酸的成簇阵列。例如，四嗪封端的引物可与衬底表面的降冰片烯部分进行反应而形成共价键合，bcn-封端的引物可与衬底表面的叠氮基部分进行反应，和三唑啉二酮封端的引物可与衬底表面的二烯或吲哚部分进行反应。参见例如，billiet等人的naturechemistry6,815–821(2014)。
在一些实施方式中，可使用两种引物，其一种或两种可附着到所述聚合物涂层。例如，所述方法可包括如下步骤：使第一多个寡核苷酸与如本文中描述的衬底的表面上的第一聚合物层反应；使附着到衬底的第一多个寡核苷酸与待扩增的模板接触，各模板包括在3′端处的能够杂交到第一寡核苷酸的序列和在5′端处的其互补部分能够杂交到第二寡核苷酸的序列；和，使用第一寡核苷酸和第二寡核苷酸对模板进行扩增，其中第二寡核苷酸任选地附着到衬底，从而产生多核苷酸的成簇阵列。
本文中描述的组合物的一些实施方式涉及包括本文中描述的衬底的流动室。一些这样的实施方式还包括附着到衬底表面的多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸以多核苷酸簇存在。在一些这样的实施方式中，单个多核苷酸簇内的多核苷酸具有相同的核苷酸序列。簇中的个体多核苷酸可在一端处或两端处附着到衬底。所述附着可经由多核苷酸链的5’和/或3’端进行。不同多核苷酸簇的多核苷酸通常具有不同的核苷酸序列，但是中在所有实施方式中不是必须的。
本文中描述的方法的一些实施方式涉及多核苷酸的核苷酸序列的测定。一些这样的实施方式包括如下步骤：(a)使多核苷酸聚合酶与附着到如本文中描述的衬底的表面的多核苷酸簇接触；(b)向衬底表面提供核苷酸，使得当一个或多个核苷酸被多核苷酸聚合酶利用时产生能检测的信号；(c)在一个或多个多核苷酸簇处检测信号；和，(d)重复步骤(b)和(c)，从而测定在一个或多个多核苷酸簇处存在的多核苷酸的核苷酸序列。在一些这样的实施方式中，衬底表面存在于流动室内。在一些这样的实施方式中，仅单一类型的核苷酸在单个流动步骤期间存在于流动室中。在这样的实施方式中，所述核苷酸可选自datp、dctp、dgtp、dttp及其类似物。在测定多核苷酸的核苷酸序列的方法的其它实施方式中，多种不同类型的核苷酸在单个流动步骤期间存在于流动室中。在这样的实施方式中，所述核苷酸可选自datp、dctp、dgtp、dttp及其类似物。在测定多核苷酸的核苷酸序列的方法的另外实施方式中，能检测的信号包括光学信号。在其它实施方式中，能检测的信号包括非光学信号。在这样的实施方式中，非光学信号可为ph变化或焦磷酸盐浓度的变化。
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