快速三维显微成像系统的制作方法

本发明涉及计算摄像学技术领域，特别涉及一种快速三维显微成像系统。

背景技术：

生命科学和材料科学研究对三维显微成像提出了更高要求。目前，大多显微三维成像利用共聚焦显微镜或双光子、多光子显微镜，逐点扫描采集荧光样本，形成不同深度下的图像。但这些方法存在两方面缺点。第一，所需激发光较强，容易造成荧光漂白，而且强光照射可能损伤样本细胞或组织结构；第二，对荧光样本特定深度成像需要逐点扫描，时间效率低。因此，上述方法不适用于光敏荧光样本和生物样本，而且成像速度慢，不能记录动态场景。

宽视场显微镜则不同，其光通量大，在较弱激发光下即能成像，而且每个深度可以直接成像，相比前述方法成像速度快。但利用宽场显微镜获得荧光图像存在如下问题：激发光不但激发了样本位于物镜焦平面处荧光信号，也激发了非焦平面的荧光信号，因此，成像传感器每个像素点光强是焦平面上荧光强度和非焦平面荧光强度以及噪声叠加，每个深度获得图像分辨率比前述方法分辨率低。三维显微成像就需要逐层扫描整个样本得到一组不同深度下的图像序列，然后通过计算方法消除噪声和模糊重建样本三维结构。

光场显微成像虽然不需要逐层扫描，单次拍摄即能计算重建样本三维结构。但该方法牺牲了空间分辨率，导致计算重建的样本三维分辨率较低，而且对于较厚的样本，重构质量差。基于多焦光栅的多平面同时成像方法在傅立叶面同时加入分束和相位调制，但为解决色散问题使系统结构复杂。

技术实现要素：

本发明旨在至少解决上述技术问题之一。

为此，本发明的目的在于提出一种快速三维显微成像系统，该系统能够以普通宽场显微镜单张成像速度实现多深度同时成像，成像速度快，图像分辨率高，可用于活体样本，且系统结构简单，成像深度间隔便于调整。

为了实现上述目的，本发明的实施例提出了一种快速三维显微成像系统，包括：显微镜，用于将显微样本放大并成像到像面引出口；视场光阑，位于所述显微镜的输出像面上，用于约束后级成像视场范围；窄带滤光片，位于视场光阑后的第一级4f系统中间，用于对来自样本的信息进行窄带滤光；分束光栅，用于将经过所述第一级4f系统后的显微输出图像在二维空间分束；多焦距透镜阵列，位于第二级4f系统的傅立叶面上，用于对各光束加入不同相位调制，以在后级透镜后焦面得到不同深度图像；微透镜阵列，位于所述第二级4f系统的像面，用于将经过分束光栅和多焦距透镜阵列的不同角度光线调制到微透镜后不同空间位置；像感器，位于第三级4f系统或成像镜头像面上，用于记录经前级调制的样本图像。

另外，根据本发明上述实施例的快速三维显微成像系统还可以具有如下附加的技术特征：

在一些示例中，所述显微镜为宽视场荧光显微镜。

在一些示例中，所述分束光栅与所述窄带滤光片通过所述第一级4f系统继接，用于进行光束信息复制和波段截取。

在一些示例中，所述多焦距透镜阵列的分布和第二级4f系统的傅立叶面空间位置相对应。

在一些示例中，对所述显微镜输出的荧光图像以衍射极限分辨率通过所述微透镜阵列进行调制。

在一些示例中，还包括：重构模块，所述重构模块通过抽取所述像感器得到图像的像素点，得到显微样本的一组不同深度的成像堆栈，并利用所述成像堆栈重建显微样本的三维结构。

在一些示例中，所述第一级4f系统、第二级4f系统及第三级4f系统为透镜或成像镜头。

在一些示例中，所述像感器为SCMOS单色传感器或其他类型成像传感器。

在一些示例中，所述分束光栅的分束数量可调。

在一些示例中，所述多焦距透镜阵列与所述分束光栅的分束数量相匹配。

根据本发明实施例的快速三维显微成像系统，结构简单，成本低廉；同时，对荧光样本成像时所需的激发光功率较低，可以最大限度减少激光对光敏样本、生物样本的破坏；另外，该系统在成像过程不需要逐点扫描，成像速度快，图像分辨率高。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1根据本发明实施例的快速三维显微成像系统的结构框图；

图2是根据本发明一个实施例的快速三维显微成像系统的成像光路示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

以下结合附图描述根据本发明实施例的快速三维显微成像系统。

图1是根据本发明一个实施例的快速三维显微成像系统的结构框图。如图1所示，该快速三维显微成像系统包括：显微镜100、视场光阑200、窄带滤光片300、分束光栅400、多焦距透镜阵列500、微透镜阵列600及像感器700。

其中，显微镜100用于将显微样本放大并成像到像面引出口。

在本发明的一个实施例中，显微镜100为宽视场荧光显微镜，以实现荧光样本一级放大，将样本像面从引出口导出便于后级处理。

视场光阑200位于显微镜100的输出像面上，用于约束后级成像视场范围。

窄带滤光片300位于视场光阑200后的第一级4f系统中间，用于对来自样本的信息进行窄带滤光。也就是说，通过窄带滤光片300后，来自样本的信息仅窄带通过，从而解决后级分束光栅带来的色散问题。需要说明的是，在实际成像光路中，窄带滤光片300的并不严格限定，即位置可调。

其中，4f系统例如为两个不同焦距的透镜或镜头，前级透镜后焦面和后级透镜前焦面重合。如果成像光路像面位于前级透镜前焦面上，在后级透镜后焦面处将得到被放大或缩小的像面。像面放大缩小比例由后级透镜和前级透镜焦距比例决定。

分束光栅400用于将经过第一级4f系统后的显微输出图像在二维空间分束。

在本发明的一个实施例中，分束光栅400与窄带滤光片300通过第一级4f系统继接，用于进行光束信息复制和波段截取。分束光栅400例如位于第一级4f系统的像面上。

多焦距透镜阵列500位于第二级4f系统的傅立叶面上，用于对各光束加入不同相位调制，以在后级透镜后焦面得到不同深度图像。具体地，即在复制的各光束傅立叶面上利用多焦距透镜阵列加入不同相位调制。

在本发明的一个实施例中，为了实现对各光束加入不同相位调制，多焦距透镜阵列500的分布和第二级4f系统的傅立叶面空间位置严格对应。

微透镜阵列600位于第二级4f系统的像面，用于将经过分束光栅400和多焦距透镜阵列500的不同角度光线调制到微透镜后不同空间位置。具体地说，由于不同深度成像光束角度不同，因此通过微透镜阵列600将这些不同深度的信息调制到传感器不同空间位置，从而实现不同深度同时成像。

在本发明的一个实施例中，对显微镜100输出的荧光图像以衍射极限分辨率通过微透镜阵列600或其他强度或相位进行调制。

像感器700位于第三级4f系统或成像镜头像面上，用于记录经前级调制的样本图像。也就是说，像感器700和微透镜阵列600间通过第三级4f系统或成像镜头继接，对经前级调制后的各光束同时成像。具体地，像感器700例如为SCMOS单色传感器或其他类型成像传感器。

在本发明的一个实施例中，上述的第一级4f系统、第二级4f系统及第三级4f系统例如为透镜或成像镜头。也即是说，各级继接的4f系统既可以用透镜实现，也可以用成像镜头实现。

在本发明的一个实施例中，为保证像面以衍射极限分辨率采样，各级4f系统的放大倍数、各光学器件的数值孔径需要匹配。本发明的实施例主要针对窄带成像，需要在成像光路加入窄带滤光片，解决分束光栅带来的色散问题。

在本发明的一个实施例中，分束光栅400的分束数量可调。基于此，多焦距透镜阵列500与分束光栅400的分束数量相匹配。例如，分束光栅400将入射光分为5*5维的光束，实际应用可以根据需要调整分束光栅400的设计，增加或减少分束数量或空间分布。基于此，多焦透镜阵列500为和分束光栅400匹配，也采用5*5的多焦透镜阵列。

进一步地，在本发明的一个实施例中，该系统例如还包括重构模块(图中未示出)。利用单次拍摄的图片，每个微透镜后相同位置的像素对应样本同一深度成像结果。重构模块通过抽取像感器700得到图像的像素点，得到显微样本的一组不同深度的成像堆栈，并利用成像堆栈重建显微样本的三维结构，从而消除非焦面信号影响，实现显微样本三维结构的重建。在具体实施例中，重构模块计算重建过程在普通PC机或工作站等硬件系统上即可实现。

在具体实施例中，由于采用了窄带滤光片，因此，本发明实施例的快速三维显微成像系统既能应用于荧光样本成像，也可用于明场显微成像。

也就是说，本发明实施例的快速三维显微成像系统主要包括图像采集和计算重构两部分。其中图像采集部分由荧光显微镜，窄带滤光片，分束光栅，多焦距透镜阵列，微透镜阵列和像感器组成。分束光栅通过像面调制实现光束信息复制。多焦距透镜阵列在复制的光束傅立叶面上加入不同相位调制，实现样本不同深度信息从不同角度同时成像到后级的微透镜阵列。微透镜阵列将像面上不同角度光线调制到微透镜后对应像感器不同像素点。计算重构部分利用获取的不同深度图像信息，计算重构样本三维图像。相比其他成像方法，本发明的优势在于单次拍摄实现样本不同深度同时成像，成像速度快，可用于活体样本；相比多焦光栅方法，系统结构简单，成像深度间隔便于调整。

作为具体的示例，本发明实施例的系统的原理可概述为：利用宽场显微镜高倍物镜，在输出的样本荧光图像面上加入分束光栅，然后在傅立叶面上加入相位调制，再以极限分辨率通过微透镜阵列，经微透镜阵列调制后，实现不同角度光线对应到样本不同深度，再调整每个微透镜对应传感器上像素范围，使传感器能够同时获得的不同深度图像，然后利用计算方法消除非焦面信息影响，重建样本三维结构。该系统的优点在于激发光源功率低，可应用于光敏样本和生物样本成像，减少荧光漂白和对样本的损伤；成像速度快，可以普通宽场显微镜单张成像速度实现多深度同时成像，图像分辨率高。

综上，根据本发明实施例的快速三维显微成像系统，结构简单，成本低廉；同时，对荧光样本成像时所需的激发光功率较低，可以最大限度减少激光对光敏样本、生物样本的破坏；另外，该系统在成像过程不需要逐点扫描，成像速度快，图像分辨率高。

为了便于更好地理解本发明，以下结合图2，以具体的实施例对本发明上述实施例的快速三维显微成像系统做进一步详细描述。

在本实施例中，结合图2，该系统例如包括：显微镜100、视场光阑200、窄带滤光片300、分束光栅400、多焦距透镜阵列500、微透镜阵列600及像感器700。

具体地，结合图2所示，显微样本107位于显微镜100的显微物镜106的焦面上。激光光源104发出的激发光通过二向色镜105反射后经物镜106聚焦后激发样本107的荧光信号。荧光信号经物镜106后，透过二向色镜105，再经反射镜103和管镜102后成像到像面引出口101。在像面位置放置视场光阑200，限制视场大小，便于系统调节。进一步通过第一级4f系统201继接像至分束光栅400。为解决分束光栅的色散问题，在第一级4f系统201中间加入窄带滤光片300。经分束光栅后，原光束被分为5*5份，其傅立叶面在空间上完全分开。多光束经第二级4f系统501调整后送微透镜阵列600。为实现不同深度同时成像到第二级4f系统501后焦面，在第二级4f系统501中间的傅立叶面上针对不同光束加入不同相位调制。本实施例采用5*5多焦距透镜阵列500。由于各光束对应的透镜焦距不同，加入了不同相位调制，在第二级4f系统501后焦面会得到不同深度成像。由于不同深度成像来自不同方向的光束，这些光束经位于像面上的微透镜阵列600调制后，将不同深度光束对应到空间不同角度，再经过第三级4f系统601调整放大倍数后，在像感器上，每个微透镜对应5*5个像素，不同角度光束对应到像感器不同空间位置，实现不同深度同时采集成像。像感器700位于第三级4f系统601像面后一个微透镜焦距处，实现不同深度信息与微透镜后特定像素准确对应。

在本实施例中，上述的显微镜100既可以是传统的商业显微镜，也可以根据不同应用选择倒置显微镜，也可以是正置显微镜，并不局限于示意图2中所示的倒置显微镜形式，其构成以及作用对于本领域的技术人员而言都是已知的，此处不再详细赘述。

进一步，在本实施例中，通过对上述系统采集到的不同深度同时成像图片的处理，恢复显微样本三维结构的计算过程。首先对采集到的图像进行抽取，由于每个微透镜后对应5*5个不同深度的信息，首先需要抽取相同深度信息组成该深度成像。由于经第二级4f系统501的放大，单个微透镜以衍射极限分辨率对成像采样，不会造成空间分辨率损失。对25个深度信息抽取完毕，依据深度次序可以得到一组样本不同深度成像堆栈。进一步可以利用传统三维解卷积方法计算重构高分辨三维图像。

在本发明实施例的系统中，需要注意的是，各级系统的数值孔径的匹配。物镜本身提供的数值孔径，在通过分束光栅以及微透镜阵列时，都会在各自维度上发生数值孔径的扩展，两者的扩展程度需要保持一致才能使得最终成像面不出现混叠或者采样不足的情况。

在本发明实施例的系统中，需要注意的是，各级4f系统放大倍数的确定。为保证空间分辨率不损失，同时充分利用像感器像素，必须确保各级放大倍数准确，实现微透镜以衍射极限分辨率对不同深度成像采样，保证不同深度信息准确对应到微透镜对应的像感器指定位置像素。如果4f系统放大倍数不匹配，可能造成成像空间分辨率下降或不同深度信息混叠。

综上，本发明实施例的快速三维显微成像系统，能够实现单相机下单次曝光采集高分辨率和高精度的样本三维数据。该系统首次实现的单相机的多深度同时采集系统，具有很广阔的应用前景。与传统扫描方法相比，该系统将光学设计和计算重构相结合，减少了采样时间，避免了荧光样本漂白。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同限定。