一种基于LED阵列照明的显微镜光学装置及其校准方法与流程

本发明涉及光电成像检测技术领域，具体地，涉及一种基于led阵列照明的显微镜光学装置及其校准方法。

背景技术：

细胞作为生物体的基本结构和功能单位，形态结构复杂多样，功能多种多样，能准确而及时地反映生物体的各项基能情况。现代医学关于疾病的发病机制和诊断疾病都依赖于对生物细胞的检测和研究。在研究活体细胞的动态过程和各种结构的生理活动时，显微镜是一种非常重要的探测手段。

传统显微成像技术是基于光透过观测物体时发生振幅和波长变化来实现的，生物细胞的无色透明特性致使传统显微成像技术无法对其进行成像。荧光染色可用于标记细胞成分或过程，揭示群体中的特定细胞表型并量化每个细胞的特定状态，例如，定量细胞周期每个阶段包括有丝分裂阶段的细胞比例。但是染色常常步骤繁杂，且与活细胞不兼容，染色也可能对细胞产生混淆的影响。细胞的内部结构与细胞质折射率的不同会调制探测光的相位，细胞的这种相移信息能准确反演出细胞的形态特征。

相衬显微成像技术作为最早的相位成像技术，其原理是将相位的区别转变为振幅的区别，最终使得相位变化以强度变化形式呈现出来。其中数字全息显微技术，可通过复杂的去卷积算法在对细胞无损的前提下完成细胞结构的三维重构，最终成像结果分辨率超越衍射极限。在部分相干光照明情况下，照明光源不用严格相干，对于抑制散斑噪声、提高成像分辨率具有巨大优势。一种典型的微分干涉相位技术借助于一个led阵列照明源，为样品提供各种入射角度的照明光线，获取定量相位图像，通过傅里叶域中的数字图像处理获得高分辨率大视场的相位信息图和振幅重构图像。一种基于led阵列照明的显微镜光学装置可以有效的利用生物细胞的相位信息，通过反演相位的变化达到恢复其表型等特征，进而实现细胞的空间成像，可实现细胞无损检测。因此led照明阵列在光路中的校准尤为重要。至今尚未提出一套准确的校准方案与流程。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提出了一种基于led阵列照明的显微镜光学装置及其校准方法，利用位移台进行led阵列六维方向的校准，实现了高精度相位成像，提高了led照明阵列在显微镜成像系统的照明精度。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种基于led阵列照明的显微镜光学装置，所述装置包括：

显微镜、led照明阵列、第二凸透镜、第一相机和第二相机；

led照明阵列位于置物台上方，并用于向显微镜提供光源；led照明阵列产生的入射光穿过显微镜中的第一凸透镜后照射在显微镜中的第一分光镜上生成两束光束：分别为第一光束和第二光束，第一光束射向第二凸透镜，第一光束从第二凸透镜射出并入射到第一相机中；第二光束穿过显微镜中的第三凸透镜后照射在显微镜中的第二分光镜上生成两束光束：分别为第三光束和第四光束，第三光束穿过显微镜中的第四凸透镜后入射至显微镜中的目镜，第四光束入射至第二相机。

优选的，第一相机用于收集侧边光路图像信息，第二相机用于采集显微镜成像图像。

优选的，第二相机置于显微镜前端。

优选的，第一相机为mer-200-20uc相机，第二相机为pco.edge5.55.5cmos相机。

优选的，所述装置还包括三维位移平台，三维位移平台用于对led照明阵列进行x轴、y轴和z轴方向上的调整。

优选的，所述装置还包括固定座，第二凸透镜通过固定座进行固定。

优选的，第一相机和第二凸透镜固定安装在显微镜同侧，第二凸透镜用于将入射光线转为平行光，第一相机将凸透镜射出的平行光进行采集。

优选的，所述装置还包括计算机，所述计算机具有图像采集卡，所述计算机与第二相机连接，用于对第二相机中的图像进行采集与分析。

另一方面，本发明还提供了一种基于所述的基于led阵列照明的显微镜光学装置的校准方法，基于led阵列照明的显微镜光学装置可以有效的利用生物细胞的相位信息，通过反演相位的变化达到恢复其表型等特征，进而实现细胞的空间成像。采用基于人眼判别的光场校准方式，有ph标记的物镜送入光路，在进行观测前，校正(对准)物镜里的相差板及led照明源的照明中心。

所述方法包括：

将led照明阵列对应的三维位移平台的刻度归零，调整led照明阵列中的led灯板高度；

采用明场照明，将ph物镜转入光路，将显微镜右侧的光路转换盘转到<eye100>位置，将样品放置载物台中，通过目镜观察，转动粗微调调焦旋钮对样品进行对焦，取走样品；

将目镜筒转盘设到<b>位置，转动勃氏镜聚焦螺钉，通过目镜观测，前/后/左/右调整位移平台，使其位于物镜相差板中心，完成水平面视场中心校准；

将显微镜右侧的光路转换盘转到<side100>位置，打开第一相机，配合灯板的x-y平面，调节z方向的俯仰角旋度，使led的边缘与图像边缘平行，完成水平面旋度校准，关闭第一相机；

将显微镜右侧的光路转换盘转到<front80eye20>位置，转动物镜转换器，在物镜下采集图片，调节位移平台，实现上下左右对称位置的灯板单颗led图样呈上下左右对称分布。

本申请提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

本发明出了利用位移台进行led阵列六维方向的校准方法，其位移台的操纵精度远高于单纯的目测调整。通过利用透镜的傅里叶特性，将光源led阵列置于傅里叶平面处，利用明场照明、显微镜目镜、显微镜ph物镜与位移平台进行调校，利用两台cmos相机采集图像至计算机中，以供操作人员进行校准判断，从而达到led明场照明中心与显微镜视场中心重合。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定；

图1是显微镜内部结构示意图；

图2是3×3正方形分布的led目镜校准图；

图3是3×3正方形分布的led旋度校准图；

图4是4个对称位置单颗led图样呈对称分布图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在相互不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述范围内的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

本领域技术人员应理解的是，在本发明的揭露中，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系是基于附图所示的方位或位置关系，其仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此上述术语不能理解为对本发明的限制。

可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。

请参考图1-图4，本发明实施例提供了一种基于led阵列照明的显微镜光学装置及校准方法，该测试装置包括：显微镜1、led照明阵列及三维位移平台2、凸透镜及固定座3、mer-200-20uc相机4、pco.edge5.5cmos相机5、具有图像采集卡的计算机6。其中，使用led照明阵列2代替传统光源置于载物台上侧，凸透镜及固定座3、mer-200-20uc相机4置于显微镜1左侧，pco.edge5.5cmos相机5置于显微镜1前端。

所述的显微镜光学校准装置由显微镜1、led照明阵列及三维位移平台2、凸透镜及固定座3(至于侧边的凸透镜可以将入射光线转为平行光，以便左侧的相机进行采集)、mer-200-20uc相机4(用于收集侧边光路图像信息)、pco.edge5.5cmos相机5用于采集显微镜成像图像)、具有图像采集卡的计算机6总计六个组件构成。mer-200-20uc相机置于显微镜左侧，pco.edge5.55.5cmos相机置于显微镜前端。相机的型号可根据实际待采集的图片要求进行更换。

本发明采用led照明阵列源，结合相位成像的方法，通过灯板图样的快速变化引入相位梯度实现图像对比度的增加。倒置显微镜内部结构图如附图1所示。通过可编码控制的led照明阵列源可方便地实现任意角度和任意图样的照明。为实现相位成像技术的对称性照明方式，首先应对led照明阵列源进行位置校准，使led明场照明中心与显微镜视场中心重合。其关键在于将有ph标记的物镜送入光路，在进行观测前，校正(对准)物镜里的相差板及led照明源的照明中心。

具体校准方法如下：

步骤1、将位移平台的刻度归零，调整led灯板高度7厘米，其中三维x-y-z方向中的z方向旨在调整led灯板到显微镜载物台的距离。

步骤2、采用明场照明，将ph物镜转入光路，将显微镜右侧的“光路转换盘”转到<eye100>位置(100％光到观察口)。将样品放置载物台中。通过目镜观察，转动粗微调调焦旋钮对样品进行聚焦对焦。取走样品。

步骤3、将“目镜筒转盘”设到<b>位置，转动勃氏镜聚焦螺钉，使位相板像清晰。照明方式采用视场中心3×3正方形分布的9颗led，通过目镜观测，前/后/左/右调整位移平台，使其位于物镜相差板中心，完成水平面视场中心校准，其中三维x-y-z方向中的x，y方向可以用来调整led灯板水平面。

步骤4、将显微镜右侧的“光路转换盘”转到<side100>位置(100％光到左端口)，打开mer-200-20uc相机(cmos行曝光的usb摄像机，分辨率1600×1200，像素尺寸4.2um×4.2um)，配合灯板的x-y平面，调节z方向的俯仰角旋度，使3×3正方形分布的led的边缘与图像边缘平行，如附图2所示，完成水平面旋度校准。关闭相机。

步骤5、将显微镜右侧的“光路转换盘”转到<front80eye20>位置(80％光到前端口，20％光到观察口)，转动物镜转换器，在4倍物镜下采集图片。调节位移平台，实现上下左右对称位置的灯板单颗led图样呈上下左右对称分布。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。