专利名称：：高浓度纳米金溶液及其浓缩方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及纳米金
技术领域：
，特别涉及一种纳米金溶液的浓縮方法及其制得的高浓度纳米金溶液，以及该高浓度纳米金溶液在DNA分子自组装中的应用。
背景技术：
：自上个世纪九十年代以来，纳米材料由于具有独特的物理化学特性、量子尺寸效应及高比表面效应,被广泛应用于分子生物学、生物传感器等领域。其中，纳米金粒子由于具有优异的光学性质、电学性质、化学活性、生物兼容性，在生物领域的应用最为广泛。最早可以追溯到上世纪七十年代免疫金在生物成像中的应用。1996年，Mirkin研究组首次实现了巯基修饰DNA在纳米金粒子表面的组装，制备成纳米金-DNA复合纳米结构。基于这一发现，他们研究组在Science上发表了一系列论文，报道了生物分子识别过程对于纳米金光电性质的调控，并在此基础上提出了一系列超高灵敏检测DNA和蛋白质的生物检测方法，构建了基于纳米金比色方法的纳米检测平台。基于此，又开展了一系列与纳米金有关的生物检测，建立了基于纳米金放大的电化学检测方法，实现了多种靶物质的快速、灵敏检测。与传统的紫外、荧光等检测方法相比较，此法无需依赖于大型仪器，可以直接用肉眼观察，是一种低成本、简便快捷的检测方法，在疾病诊断、食品安全、生物反恐、环境等众多领域中具有非常广阔的应用前景。纳米材料的物理化学性质与颗粒的大小直接相关。不同粒径、不同浓度的纳米金颗粒与DNA相互作用的动力学和热力学性质有着显著差异。例如，DNA在小于5nm的纳米金上难以进行有效的组装，而粒径过大时，粒子本身不稳定，容易发生团聚现象。另外实践中也发现，DNA在高浓度纳米金中的组装更快也更稳定，而且能大大提高DNA的利用率，这些都对纳米金粒径的均匀度和浓度提出了较高的要求。目前市售的纳米金以Sigma的为主，其粒径均匀，但是浓度一般在0.01wAv^左右(以氯金酸浓度计)，相对较低，不能满足检测的要求，而且售价相对较高。因此大多数实验室还是采用自己制备的纳米金，主要方法是用柠檬酸三钠、鞣酸-柠檬酸三钠、硼氢化钠等还原剂对氯金酸还原得到。但是目前制备高浓度纳米金时粒径的均匀度方面不够理想，原因是氯金酸浓度的大小会直接影响纳米金的形状和均匀程度。而要建立高灵敏度和可重现性的检测方法，很大程度上依赖于纳米金材料的质量，因此能够制备出均匀性好、高浓度的纳米金溶液对于后续检测至关重要。中国专利文献公开了一系列的纳米金颗粒，但通常是表面包覆了高分子材料如PVP等，虽然得到的纳米金颗粒稳定性较高，但是由于改变了颗粒表面的性质以及电荷，无法应用于DNA分子自组装实验(参见公开号CN1663714A、CN1806973A的专利文献)。
发明内容本发明要解决的技术问题是克服现有技术中制备高浓度纳米金溶液方面存在着粒度分布不均匀的缺点，提供一种纳米金颗粒高度均一的高浓度的纳米金溶液，及制得其的浓縮方法。为解决上述技术问题，本发明人进行了诸多试验研究，发现将采用现有技术，即利用还原剂还原氯金酸溶液制得的纳米金溶液进一步采用高速离心法，通过一定转速和时间进行离心沉淀，根据所需的浓度弃去相应体积的上清或弃去上清液后再用相应体积的溶液来稀释，可制备高浓度和高均一性的纳米金颗粒。因此，本发明的纳米金溶液的浓縮方法，包括将由还原剂还原氯金酸溶液制得的纳米金溶液再进一步采用高速离心法浓縮，所述的高速离心法的离心转速在8000-16000rpm之间，离心时间为10-30分钟。本发明浓缩方法的核心在于控制离心转速和离心时间，使制得的纳米金颗粒粒径均一。因为本发明人经研究发现，通常离心速度太高容易导致不可逆聚集，太低则部分纳米金不能离心下来；而时间太长降低工作效率，也会导致不可逆的聚集，太短则部分纳米金不能离心下来。其中，本发明利用还原剂还原氯金酸溶液制得纳米金溶液的技术可采用现有技术，如
背景技术：
中所述的技术。本发明根据文献(如Grabar，K.C.;Freeman,R.G.;Hommer,M.B.;Natan，M.J.」wa/.C7^附.1995，67，735-743)还原不同浓度的氯金酸溶液来制备不同浓度、纳米金颗粒粒径相似的纳米金溶液，还可以根据文献(《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》，蔡文琴，王伯沄等，成都四川科学技术出版社，1994，479-582)还原质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液来制备平均粒径5-150nm的纳米金颗粒。上述10-150nm纳米金的还原剂通常选用柠檬酸三钠(枸橼酸三钠)，所述的氯金酸溶液的质量百分比浓度一般为0.001%0.1%，较佳地，选用O.Ol%。上述5-10nm纳米金制备的还原剂选用柠檬酸三钠或鞣酸与柠檬酸三钠的混合液。较佳地，本发明制得的纳米金颗粒的平均粒径为5-40nm，更佳地为10-40nm。本发明通过离心法浓缩现有技术制得的纳米金，即将上述现有方法制备的较低浓度纳米金颗粒进行高速离心后去掉部分上清后重新悬浮，根据需要得到不同的高浓度纳米金。具体地来说，取l-10mL制备的低浓度纳米金颗粒，在4。C条件下，离心时的转速在8000-16000rpm之间，离心10-30min后，根据需要去掉不同体积的上清液，并重新用剩余溶液重悬浮，得到浓度从5nM-100nM之间不同浓度的纳米金颗粒。根据此方法可以对5-150nm的纳米金颗粒进行浓縮。由此，可制得本发明高浓度的纳米金溶液。其不仅较原有纳米金溶液提高了浓度，且得到的纳米金颗粒粒径均一。本发明将其成功应用于DNA分子自组装方面，制得的纳米金-DNA复合物具有更佳的耐盐性和稳定性，为进一步拓展纳米金在其他领域的应用奠定基础。本发明纳米金溶液的浓縮方法的优点是操作简便，快速，重复性好，得到的纳米金颗粒粒度分布窄，在耐盐性以及DNA组装方面都表现出很好的稳定性。图1为不同浓度的13nm纳米金的AFM图像;A为现有技术制备的3.5nM纳米金(低浓度组)，B为采用本发明浓縮方法制备的17.5nM纳米金(浓縮组)，C为现有技术制备的17nM纳米金。图2为不同浓度的13nm纳米金的UV谱；A为现有技术制备的3.5nM纳米金(低浓度组)，B为釆用本发明浓縮方法制备的17.5nM纳米金(浓縮组)，C为现有技术制备的17nM纳米金。图3为纳米金溶液耐盐性的紫外可见光谱分析(均未经体积校正)。图4为两组纳米探针离心前(虚线)和离心后(实线)的UV谱(A:低浓度组；B:浓縮组)。具体实施方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例13.5nM纳米金(低浓度组)的制备(根据文献Grabar,K.C.;Freeman,R.G.;Hommer，M.B.;Natan,M.J.C7ie肌1995，67，735-743):将100mL的0.01%(质量百分比)的氯金酸水溶液加入250mL圆底烧瓶中，加热至剧烈沸腾后，剧烈搅拌下快速加入3.5mL的1%(质量百分比)柠檬酸三钠水溶液，继续加热搅拌15min后，停止加热，继续搅拌30min后静置，室温自然冷却。用0.22pm滤膜过滤，4'C保存。AFM图像如图1的A图所示，粒径为12.5±2.3nm，分布均匀，同时观察到少量小颗粒存在。UV谱(图2的A图)显示最大吸收在516nm左右，且520nm处的吸收值为0.673。将3.5nM纳米金浓縮5倍得到17.5nM(未计损失)的高浓度纳米金(浓縮组)。取lmL3.5nM的纳米金溶液放入1.5mL的axygen离心管中进行离心浓縮。在4。C条件下，离心机(himacCF16RX，Hitachi)转速控制在12000rpm，离心20min后，去掉0.8mL上清，纳米金重新分散在0.2mL溶液中。离心浓縮后的AFM图显示粒径没有变化，仍然为12.5±2.3nm，而原有的小颗粒消失了(图1的B图)；UV谱(图2的B图)显示最大吸收在518nm左右，且518nm处的吸收值为2.955。实施例2参考文献(《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》，蔡文琴，王伯沄等，成都四川科学技术出版社，1994，479-582)，取100mL的0.01%(w/w)的氯金酸溶液加热至剧烈沸腾后，迅速加入0.5mL的10mg/mL的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌15min后，停止加热，继续搅拌并自然冷却至室温，得到40nm的纳米金颗粒溶液。用0.22pm滤膜过滤后，置于冰箱4'C保存。AFM测得平均粒径为40nm左右。根据上述方法制备的40nm的纳米金颗粒，浓度为0.15nM。浓縮步骤如下，取lmL0.15nM的40nm纳米金溶液放入1.5mL的axygen离心管中进行离心浓縮。在(C条件下，离心机(himacCF16RX，Hitachi)转速控制在8000rpm，离心10min后，纳米金颗粒集中在管底，上清为无色澄清溶液。去掉0.8mL(或0.7mL)上清，纳米金重新均匀分散在0.2mL(或0.3mL)溶液中。得到浓度为0.75nM(或0.5nM)的40nm纳米金。实施例35nm纳米金颗粒的制备过程如下(《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》，蔡文琴，王伯沄等，成都四川科学技术出版社，1994，479-582):将配制好的A液(4mL的l%w/w柠檬酸钠，0.2mL的0.1MK2C03，0.7mL的1%鞣酸，15.1ml水)和B液(lmL的1%HAuC14，79mL水)分别加热到60"C，然后在搅拌情况下迅速将A液加入B液，继续加热直至胶体金变成葡萄酒色，自然冷却至室温，用0.22pm滤膜过滤后，置于冰箱4X:保存。AFM测得平均粒径为5nm左右。根据上述方法中制备的5nm的纳米金颗粒，浓度为82nM。浓縮步骤如下，取lmL82nM的5nm纳米金溶液放入1.5mL的axygen离心管中进行离心浓缩。在4"C条件下，离心机(himacCF16RX，Hitachi)转速控制在16000rpm，离心30min后，纳米金颗粒集中在管底，上清为无色澄清溶液。去掉0.8mL(或0.92mL)上清，纳米金重新均匀分散在0.2mL(或0.08mL)溶液中。得到浓度为410nM(或1000nM)的5nm纳米金。实施例4参考文献(《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》，蔡文琴，王伯沄等，成都四川科学技术出版社，1994，479-582)，取画mL的0.01%(w/w)的氯金酸溶液加热至剧烈沸腾后，迅速加入5mL的10mg/mL的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌15min后，停止加热，继续搅拌并自然冷却至室温，得到平均粒径为10nm的纳米金颗粒溶液。用0.22pm滤膜过滤后，置于冰箱4"C保存。根据上述方法中制备的10nm的纳米金颗粒，浓度为9.5nM。浓縮步骤如下，取lmL9.5nM的5nm纳米金溶液放入1.5mL的axygen离心管中进行离心浓縮。在(C条件下，离心机(himacCF16RX，Hitachi)转速控制在13000rpm，离心20min后，纳米金颗粒集中在管底，上清为无色澄清溶液。去掉0.8mL上清，纳米金重新均匀分散在0.2mL溶液中。得到浓度为44.5nM的10nm纳米金。实施例5参考文献(《实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术》，蔡文琴，王伯沄等，成都四川科学技术出版社，1994，479-582)，取100mL的0.01。％(w/w)的氯金酸溶液加热至剧烈沸腾后，迅速加入2mL的10mg/mL的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌15min后，停止加热，继续搅拌并自然冷却至室温，分别得到平均粒径为20nm的纳米金颗粒溶液。用0.22pm滤膜过滤后，置于冰箱4'C保存。根据上述方法中制备的20nm的纳米金颗粒，浓度为1.16nM。浓縮步骤如下，取lmL1.16nM的20nm纳米金溶液放入1.5mL的axygen离心管中进行离心浓縮。在4"C条件下，离心机(himacCF16RX，Hitachi)转速控制在11000rpm，离心20min后，纳米金颗粒集中在管底，上清为无色澄清溶液。去掉0.8mL上清，纳米金重新均匀分散在0.2mL溶液中。得到浓度为5.8nM的20nm纳米金。本发明由现有技术直接制备的较低浓度纳米金离心浓縮得到，保留了粒径分布均匀的特点，而且控制离心时的条件，还可以把原溶液中的小颗粒有效去除。对比实施例117nM纳米金的直接制备(根据文献Grabar，K.C.;Freeman,R.G;Hommer,M.B.;Natan，M.J.Oiew.1995，67，735-743):将100mL的lmM(相当于0.04%质量百分比)的氯金酸溶液加到250mL圆底烧瓶中，加热至剧烈沸腾后，剧烈搅拌下快速加入5mL的38.8mM的柠檬酸三钠水溶液，继续加热搅拌15min后，停止加热，继续搅拌30min后静置，室温自然冷却。用0.22pm滤膜过滤，4"C保存。AFM图像显示(图1的C图)，粒径在14士5nm附近，分布非常不均匀，统计结果显示大颗粒的比例超过总数的30%。UV谱(图2的C图)显示最大吸收在518nm左右，且518nm处的吸收值为2.346。试验实施例1本发明纳米金对盐耐受性的比较比色法取对比实施例l和实施例l浓縮组的纳米金(平均粒径相仿，约13nm左右)各100nL，分别加入0.1MPBS(10mMPB，pH7.0，O.lMNaCl)各5、10、15、20、25pL，观察纳米金的颜色变化状况。结果显示实施例l浓縮组在加入PBS后，颜色没有发生明显变化，而对比实施例l在加入l(HiL的0.1MPBS时颜色开始变紫，30nL时已经全部变兰。光谱法分别取对比实施例1和实施例1浓縮组的纳米金各100^iL，测紫外可见光谱，并分别逐次滴加0.1MPBS，每次5|iL，用紫外可见光谱监测纳米金吸收光谱的变化情况，并做吸收值与加盐体积的曲线分析，如图3所示。实验确定浓縮组能够耐受的最高盐浓度为44mMNaCl，而同时对比实施例1只能耐受9mM的NaCl。因此本发明纳米金溶液在稳定性、耐盐性方面较现有技术制得的纳米金溶液有很大程度的改善，这对于纳米金在生物传感器中的应用非常重要。试验实施例2本发明纳米金应用于DNA分子自组装参考文献(Rosi,N.L.;Giljohann，D.A.;Thaxton，C.S.;Lytton-Jean,A.K.R.;Han，M.S.;Mirkin，C.A.Sc/e"ce2006，312，1027-1030.):将27bp的巯基DNA组装到对比实施例1和实施例1浓縮组的纳米金颗粒上，室温老化完后进行离心，除去溶液中游离的DNA。分别在离心前后测两组的UV谱并进行分析。如图4所示，对比实施例l在离心后，最大吸收波长红移到522nm，长波处的吸收也明显升高，说明纳米探针颗粒发生了一定程度的团聚。而实施例l浓縮组则没有明显变化，整个离心过程并没有影响纳米金的性质，保证了纳米金DNA探针在检测中的应用。耐盐性分析向上述两种Au-DNA溶液中加入5MNaCl溶液，确定本发明实施例1浓縮组能够耐受的最高盐浓度为2.6M;而对比实施例l最高只可以耐受1.5M。因此对于反应和检测过程在高盐浓度下发生的情况，本发明纳米金溶液有更好的适用性。具体结果如下表l所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>稳定性分析将上述两组探针在4'C恒温保存，观察随时间延长纳米探针的状态变化。发现实施例1浓縮组储存30天仍稳定，而对比实施例1在7天时有黑色点状沉淀出现。因此本发明浓縮组制得的Au-DNA在稳定性方面也远优于对比实施例，有利于将纳米金DNA探针进一步推广应用。权利要求1.一种纳米金溶液的浓缩方法，其包括将由还原剂还原氯金酸溶液制得的纳米金溶液再进一步采用高速离心法浓缩，所述的高速离心法的离心转速在8000-16000rpm之间，离心时间为10-30分钟。2、如权利要求1所述的浓縮方法，其特征在于所述的还原剂为拧檬酸三钠或鞣酸与柠檬酸三钠的混合物。3、如权利要求1所述的浓縮方法，其特征在于所述的氯金酸溶液的质量百分比浓度为0.001%~0.1°/0。4、如权利要求3所述的浓縮方法，其特征在于所述的氯金酸溶液的质量百分比浓度为0.01%。5、如权利要求1所述的浓縮方法，其特征在于该纳米金溶液中纳米金颗粒的平均粒径为5-150nm。6、如权利要求5所述的浓縮方法，其特征在于该纳米金颗粒的平均粒径为10-40nm。7、如权利要求l-6任一项所述的浓縮方法制得的高浓度纳米金溶液。8、如权利要求7所述的高浓度纳米金溶液在DNA分子自组装中的应用。全文摘要本发明公开了一种纳米金溶液的浓缩方法，其包括将由还原剂还原氯金酸溶液制得的纳米金溶液再进一步采用高速离心法浓缩，所述的高速离心法的离心转速在8000-16000rpm之间，离心时间为10-30分钟。本发明还提供了利用上述浓缩方法制得的高浓度纳米金溶液，其中纳米金颗粒粒度分布均匀，溶液具有更高耐盐性。本发明的高浓度纳米金溶液应用于DNA分子自组装，制得的Au-DNA复合物具有更佳的耐盐性和稳定性。文档编号B22F9/24GK101224502SQ200710019390公开日2008年7月23日申请日期2007年1月16日优先权日2007年1月16日发明者宋世平,樊春海,王丽华申请人:苏州市长三角系统生物交叉科学研究院有限公司