专利名称：用于核酸固相合成的接头和载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于核酸固相合成的接头，携带该接头的用于固相合成的载体和利用该载体的核酸制备方法。
背景技术：
对于核酸如DNA、RNA等等的化学合成，广泛采用利用亚磷酰胺法的固相合成工艺。在固相亚磷酰胺法中，通常通过以下步骤合成核酸。首先，将待合成核酸3’末端的核苷通过3’_0H基团与切割接头(如琥珀酰基)形成酯键，以便首先在用于固相合成的载体上携带核苷(核苷接头)。然后，将携带核苷接头的用于固相合成的载体置于反应柱中，然后将反应柱设置在自动化核酸合成仪上。其后，根据自动化核酸合成仪的合成程序通常在反应柱中进行包括以下步骤的合成反应:
(1)用酸如三氯乙酸/二氯甲烷溶液等等对带保护的核苷的5’ -OH基团进行脱保护的步骤；
(2)在活化剂(四唑等等)存在的情况下用脱保护的5’-OH基团偶联核苷亚磷酰胺(核酸单体)的步骤；
(3)用乙酸酐等等为未反应的5’-OH基团加帽的步骤；和
(4)用含水碘等等氧化亚磷酸盐的步骤。通过重复合成循环，促进从3’末端至5’末端方向的寡核苷酸延伸反应，合成具有期望序列的核酸。最后，用氨水、甲胺溶液等等水解切割接头，以从用于固相合成的载体切割合成的核酸(非专利文献I)。如上述，当进行以上提及的合成时，必需预先经由切割接头在用于固相合成的载体上携带将在3’末端的核苷(原材料)。而且，3’末端会随着期望合成的核酸的序列而变化。在DNA寡核苷酸的情况下，dA、dG、dC、dT这四种是必要的，在RNA的情况下，rA、rG、rC、rU这四种也是必要的。为了合成经修饰的寡核苷酸，先前携带经修饰的核苷的用于固相合成的载体是必要的，这使得工艺变得复杂。为了解决上述问题，已经开发了携带通用接头的用于固相合成的载体(通用载体)作为接头，以连接固相载体和原材料，替代目前为止通常使用的核苷-琥珀酰接头等等。利用通用载体，与用于期望合成的核酸的3’末端的核苷或者核苷酸的种类无关，所述方法包括在与常规自动化核酸合成相同的步骤中使核苷亚磷酰胺反应以位于3’末端以启动合成，和在合成期望的核酸后，通过与常规方法类似的方法从用于固相合成的载体切割所述核酸。如上所述制备携带各种核苷-接头的用于固相合成的载体不是必需的。提出了一些通用载体，其为期望待合成的核酸的3’末端提供羟基(专利文献1-4和非专利文献2和3)。这些通用载体的结构具有两个相邻碳原子，一个碳原子与-OH基团连接成为核酸合成的起点，另一个碳原子与基团(例如-OH基团，-NH2基团，-SH基团)连接在除去保护基团后成为亲核基团。当在核酸合成后通过氨水等等切割核酸时，这些亲核基团的保护基团也被解离以攻击3’末端磷，磷酸基团被从3’末端切割以形成环磷酸酯。全部都用于合成在3’末端具有羟基的核酸。在3’末端具有羟基的核酸是非常有用的，因为它在生化领域如核酸药物等方面被广泛要求。鉴于这样的情况，期望能够合成在5’末端或者3’末端具有羟基的核酸的通用接头和携带该接头的通用载体。文献列表 专利文献
专利文献 1:US-B-5681945 专利文献 2:US-B-6653468 专利文献 3:W02005/049621 专利文献 4:US-A-2005/0182241 非专利文献
非专利文献 1:Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (2000)3.1.1-3.1.28
非专利文献 2:Bio Techniques, 22, 752-756 (1997)
非专利文献 3:Tetrahedron，57，4977_4986 (2001)
发明内容
本发明解决的问题
本发明目的是提供能够合成在3’末端具有羟基的核酸的通用接头，携带该接头的通用载体，和利用该通用载体合成核酸的方法。特别地，本发明目的是提供用于固相合成的载体，其能够通用地以高纯度合成在3’末端具有羟基的核酸，其不需要具有预先携带的经修饰的核苷的用于固相合成的载体，即使在合成经修饰的寡核苷酸时。解决问题的手段 因此，本发明提供以下。[I]用于核酸固相合成的接头，包括由下式代表的化合物
权利要求
1.用于核酸固相合成的接头，包括由下式代表的化合物
2.根据权利要求1所述的接头，其中L1和L2中至少一个可以被连接至载体而用于核酸固相合成。
3.根据权利要求1或2所述的接头，其中X1和X2是二甲氧基三苯甲基。
4.用于核酸固相合成的载体，其具有由下式代表的结构
5.根据权利要求4所述的载体，其中L1是琥珀酰基。
6.根据权利要求4或5所述的载体，其中L1和L2是琥珀酰基。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的载体，其中X1和X2是二甲氧基三苯甲基。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的载体，其中Sp是由多孔性合成聚合物颗粒或多孔性玻璃颗粒组成的固相载体。
9.产生核酸的方法，包括在根据权利要求4-8中任一项所述的载体上进行核酸合成反应的步骤。
10.根据权利要求9所述的产生方法，其中通过固相亚磷酰胺方法进行所述核酸合成反应。
全文摘要
本发明提供了能够合成在3'末端具有羟基的核酸的通用接头，携带该接头的通用载体，和使用该通用载体合成核酸的方法。本发明提供了用于核酸固相合成的接头，所述接头包含通过下式表示的化合物其中每个符号如说明书中所定义。
文档编号C40B40/06GK103224502SQ20131003543
公开日2013年7月31日 申请日期2013年1月30日 优先权日2012年1月30日
发明者塚本真幸, 铃木纪尊, 早川芳宏, 前田惠里, 森健二郎, 味吞宪二郎 申请人:日东电工株式会社, 国立大学法人名古屋大学