一种菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的制备方法及应用

1.本发明涉及金铂纳米簇合成技术领域，尤其涉及一种菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的制备方法及应用。


背景技术：

2.菠萝蛋白酶是从菠萝属植物茎中提取的巯基蛋白酶，它是由冷却的菠萝汁液经过超滤、离心和冻干而制备的黄色无定形粉末，微有特异臭。菠萝蛋白酶是菠萝所有已知和分离的化学物质中生物活性光谱最广泛和最复杂的。研究表明，这种酶具有抗炎、心脏保护、免疫调节、抗氧化和抗癌的特性。除了临床应用，菠萝蛋白酶在食品工业的许多分支中也有应用，如食品工业、啤酒厂、肉类加工、纺织和化妆品行业。由于其具有毒性较低、生物相容性较好、获取相对简单、价格低廉等优点，菠萝蛋白酶在医疗领域具有较大的发展潜力，此外，它也是制备金属纳米簇的理想模板。
3.金属纳米簇是由几个到几百个原子组成的具有荧光特性的新型超小纳米材料，由于其独特的物理化学特性，如荧光寿命长、粒径小、斯托克斯位移大及生物相容性良好等优点，在生物传感、分析检测等领域备受关注。蛋白质表面一般具有巯基、羧基和氨基等官能团，可以有效地与贵金属原子发生相互作用，从而使这些金属原子在蛋白质空腔中均匀分散，从而形成粒径合适的金属纳米簇。向单组分的金属纳米簇中掺杂另一种金属元素，形成双金属纳米簇可解决单金属纳米簇量子产率较低、发光弱等问题，与单金属纳米团簇相比，具有更强的荧光，更好的生物相容性且更加稳定，是应用于生物和医学领域的理想荧光材料。
4.茶作为一种传统的健康饮品，越来越受到人们的喜爱。茶的有益特性很大程度归功于其主要成分之一——茶多酚。茶多酚除了具有抗氧化和抗菌作用外，还具有抗癌、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、调节致癌代谢等生物学活性。虽然茶叶中的茶多酚可以给人们带来诸多好处，但过度摄取也会导致神经和精神问题，严重时，可能影响正常的生理调节功能，甚至引起肝病等疾病。鉴于其强大的健康功效及副作用，因此对茶多酚的高灵敏度和准确检测至关重要。目前，传统的检测技术和方法大多具有需要昂贵的仪器、耗时、操作复杂等局限性。因此，亟需开发一种有效的低成本、高选择性、方便快捷的方法来检测茶多酚。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的制备方法及应用，以菠萝蛋白酶为模板，采用一步合成法制备菠萝蛋白酶-金铂纳米簇，产物表现出独特的光物理特性、几乎无毒且具有优异的生物相容性，检测茶多酚方法快速简单、检测灵敏度好、检测限低。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.一种菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的制备方法，具体步骤如下：
8.s1、称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将氯金酸溶液加入到菠萝
蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入氯铂酸溶液，室温下混合均匀，得到溶液a；
9.s2、将适量浓度为1m的氢氧化钠溶液加入至步骤s1得到的溶液a中，混合均匀，溶液水浴条件下加热0.5-4小时，得到溶液b；
10.s3、将步骤s2得到的溶液b，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，以去除未反应的反应物，使蛋白尽可能的恢复到天然状态，产物保存在4℃条件下，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
11.优选地，在步骤s1中，菠萝蛋白酶浓度为40mg ml-1
。
12.优选地，在步骤s1中，氯金酸和氯铂酸的浓度比为6:1。
13.优选地，在步骤s2中，反应时间为3小时，反应温度为50℃。
14.本发明还提供了一种采用上述的制备方法制得的菠萝蛋白酶-金铂纳米簇在茶多酚检测中的应用，将不同浓度的茶多酚溶液加入至菠萝蛋白酶-金铂纳米簇中，并在室温下孵育，从而实现检测茶多酚的目的；激发波长条件下，随着茶多酚浓度的增加，菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的荧光强度逐渐减弱，实现检测。
15.优选地，在室温条件下孵育20分钟，在380nm激发波长条件下，实现荧光检测。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.1、本发明以菠萝蛋白酶为模板，采用一步合成法制备菠萝蛋白酶-金铂纳米簇，产物表现出独特的光物理特性、毒性低、稳定性良好和优异的生物相容性。
18.2、本发明制备的菠萝蛋白酶-金铂纳米簇，检测茶多酚方法简单便捷、检测灵敏度好，检测限低，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。
附图说明
19.图1为本发明制得的菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的激发光谱和发射光谱图；
20.图2为本发明不同比例的氯金酸和氯铂酸合成菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的荧光光谱图；
21.图3为本发明不同反应时间合成菠萝蛋白酶-金铂纳米簇荧光光谱图；
22.图4为本发明不同温度合成菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的荧光光谱图；
23.图5为本发明不同浓度菠萝蛋白酶合成菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的荧光光谱图；
24.图6为本发明加入不同浓度的茶多酚后，菠萝蛋白酶-金铂纳米簇溶液的荧光发射光谱图；
25.图7为本发明茶多酚浓度与菠萝蛋白酶-金铂纳米簇荧光强度之间的线性关系图。
具体实施方式
26.下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.提高产物的发光性能，包括以下步骤：
28.称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶
液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液水浴加热，得到产物。利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。改变氯铂酸体积以改变氯金酸和氯铂酸的浓度比，检测荧光光谱，当氯金酸和氯铂酸的浓度比为6:1时，荧光强度达到最强；因此选择氯金酸和氯铂酸的浓度比为6:1作为制备菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的最佳反应比例。
29.称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液水浴加热0.5小时，得到产物，并利用荧光光谱仪检测产物的发射光谱。增加反应时间，检测荧光光谱，随着反应时间增加，荧光强度逐渐增强，当反应时间为3小时，荧光强度最佳。因此选择3小时作为制备菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的最佳时间。
30.称量一定量的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在25℃条件下水浴加热3小时，得到产物，并利用荧光光谱仪检测产物的发射光谱。提高反应温度，检测荧光光谱，随着反应温度增加，荧光强度逐渐增强，当反应温度为50℃时，荧光强度最佳。因此选择50℃作为制备菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的最佳温度。
31.称量8mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50℃条件下水浴加热3小时，得到产物，并利用荧光光谱仪检测产物的发射光谱。增加菠萝蛋白酶浓度，检测荧光光谱，随着菠萝蛋白酶浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当使用40mg ml-1
的菠萝蛋白酶时，荧光强度最佳；因此选择40mg ml-1
菠萝蛋白酶作为制备菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的最佳浓度。
32.以菠萝蛋白酶-金铂纳米簇为荧光探针检测茶多酚：
33.将不同浓度的茶多酚溶液加入至菠萝蛋白酶-金铂纳米簇溶液中，并在室温条件下孵育。在380nm激发波长条件下，随着茶多酚浓度的增加，菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的荧光强度逐渐减弱。
34.(一)菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的制备及优化
35.实施例一：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50℃条件下水浴加热3小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。如图1所示，在380nm激发波长下，在480nm和650nm处分别有两个荧光发射峰。
36.实施例二：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入90μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50
℃条件下水浴加热3小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
37.实施例三：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入22.5μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50℃条件下水浴加热3小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
38.实施例四：实施例一、实施例二、实施例三得到的菠萝蛋白酶-金铂纳米簇，如图2所示，在380nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定当氯金酸与氯铂酸的比例为6:1时，菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的荧光发射强度最强。
39.实施例五：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50℃条件下水浴加热1小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
40.实施例六：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50℃条件下水浴加热2小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
41.实施例七：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50℃条件下水浴加热4小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
42.实施例八：实施例一、实施例五、实施例六、实施例七得到的菠萝蛋白酶-金铂纳米簇，如图3所示，在380nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定反应时间为3小时，菠萝蛋白酶-金铂纳米簇的荧光发射强度最强。
43.实施例九：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在25℃条件下水浴加热3小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
44.实施例十：称量16mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在45℃条件下水浴加热3小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
45.实施例十一：实施例一、实施例九、实施例十得到的菠萝蛋白酶-金铂纳米簇，如图
4所示，在380nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定当反应温度为50℃时，荧光发射强度最强。
46.实施例十二：称量8mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50℃条件下水浴加热3小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
47.实施例十三：称量12mg的菠萝蛋白酶固体，加入400μl水溶解，将90μl浓度为10mm的氯金酸溶液加入到菠萝蛋白酶溶液中，混合均匀，再加入15μl浓度为10mm的氯铂酸溶液，室温下搅拌均匀，加入一定量浓度为1m的氢氧化钠溶液混合均匀，调节溶液ph；混合溶液在50℃条件下水浴加热3小时，用分子截留量为12-14kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，得到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇。
48.实施例十四：实施例一、实施例十二、实施例十三得到的菠萝蛋白酶-金铂纳米簇，如图5所示，在380nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定当菠萝蛋白酶浓度为40mg ml-1
时，荧光发射强度最强。
49.(二)菠萝蛋白酶-金铂纳米簇作为荧光探针检测
50.实施例十五：将不同浓度的茶多酚溶液加入到菠萝蛋白酶-金铂纳米簇溶液中，使其终浓度为100～500μm，在室温下孵育20分钟后，用荧光光谱仪检测380nm激发波长下的荧光光谱。
51.本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。