本发明属于农业生物防治与微生物肥料
技术领域：
，具体涉及一种防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥及其制备方法。
背景技术：
：番茄灰霉病作为现代栽培中为害番茄生产的真菌病害，常常造成巨大的损失。我国局部保护地番茄受灰霉病的为害严重地块减产高达60%以上；许多保护地番茄受灰霉病的为害导致减产20%-30%，严重地块超过50%；山东省胶东地区番茄幼果受灰霉病菌的侵害减产10%-30%，严重地块甚至绝产。番茄灰霉是由灰葡萄孢菌引起的一种世界性的真菌病害，严重影响番茄的产量和品质。目前，对番茄灰霉病的主要防治方法有:一是化学防治。化学防治虽有见效快、效率高等优点，但是因长期使用会造成环境污染、危害害虫的天敌等缺点，因此逐步被淘汰;其次是生物防治，由于生物防治药效高、持效期长、不易产生抗药性、环境友好等优点日益受到人们的青睐。植物病害的生物防治是在农业生态系统中调节寄主作物的微生物环境，使其利于寄主作物而不利于病原物或者使其对寄主与病原物的相互作用发生有利于寄主而不利于病原物的影响，从而达到防治病害的目的。生物防治的实质是利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过微生物次级代谢产物诱导植物产生抗病性等，来抑制某些病原物的存活和活动。它是一种对环境生态友好，可持续的田间植物病害防治方法，愈来愈得到各国植病工作者的承认和重视，己获得了长足的发展。近年来，生物防治于番茄灰霉防治方面，正在不断地深入和扩大。目前，用于防治番茄灰霉病的微生物主要包括真菌、细菌和放线菌三大类。防治灰霉病的生防真菌近10种，研究和应用较广的主要是木霉和酵母菌。潘亚妮等用绿色木霉防治温室番茄灰霉病防治效果达92.6%，与未处理的植株相比，发病率降低了39.1%；Wilson等利用纤细假丝酵母和清酒假丝酵母使灰葡萄抱造成的苹果伤口腐烂降低了50%。灰霉病防治研究和应用的细菌也有10多种，而芽孢杆菌则是目前灰霉菌生物防治中研究和应用的主要细菌菌株。童蕴慧等分离获得的拮抗性强、抗菌谱广的地衣芽抱杆菌W10,W3,Y2-11-1菌株，对番茄灰霉病叶片和果实的防效为70%-80%，优于50%速克灵2000倍液。放线菌用于防治番茄灰霉主要是利用链霉菌科链霉菌属产生的武夷菌素、磷氮霉素、白月太霉素、变构霉素、变构菌素和鱼时霉素等抗生素，对灰霉病均有较好的抑制作用。目前，用于防治番茄灰霉病的芽孢杆菌主要有CGMCCNo.4777(专利号:ZL201210059785.0)，BA-KA3(专利申请号:201410618581.5)，SZ23(专利申请号:201410683826.2)，LH-1(专利申请号:201410735508.6)和NCPSJI7(专利申请号:201310112580.9)等。由于病原菌的多样性和同步进化特性，单一拮抗菌株也无法达到很理想的防治效果，因此需要寻找不同种类的菌进行组合形成效果更好的防治番茄灰霉病的组合。由于病原菌的多样性和同步进化特性，单一拮抗菌株也无法达到很理想的防治效果，因此，生防菌的很多生物功能需要依靠两株或两株以上的细菌间的协同作用，才能发挥出更好的作用。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥。该复合微生物菌肥的原料配比为：生绿链霉菌发酵液10-30份，昌帕瓦底链霉菌发酵液20-40份，印度芽孢杆菌发酵液10-30份，摩加夫芽孢杆菌发酵液10-30份，卵孢木霉发酵液10-30份。在所述微生物菌剂中，生绿链霉菌，昌帕瓦底链霉菌，印度芽孢杆菌，摩加夫芽孢杆菌，卵孢木霉五种菌是从400多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存，能产生多种抗菌素如四环素，7-金霉素，昌帕霉素A和B（七烯抗真菌的抗菌素）和昌帕瓦底菌素；它们对抑制番茄灰霉病--灰葡萄孢菌有特别强大的效果，从而达到防治番茄灰霉病的作用；另一方面，本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过次级代谢产物诱导番茄产生抗病性，增强其防病效果；再次，本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果。本发明的第二目的在于提供一种防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥的制备方法，该方法步骤简单，确保微生物菌肥的药肥效果突出。为了达到上述目的，该防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：步骤一：生绿链霉菌发酵液的制备取出生绿链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为生绿链霉菌种子液；发酵：将上述制备的生绿链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的生绿链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，开搅拌200r/min，培养40-48小时，待菌体含量达到60g/L，即可停罐，即得到生绿链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7.2～7.4；其中，所述的生绿链霉菌发酵培养基：花生粕粉3%，葡萄糖1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；步骤二：昌帕瓦底链霉菌发酵液的制备取出昌帕瓦底链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为昌帕瓦底链霉菌种子液；发酵：将上述制备的昌帕瓦底链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的昌帕瓦底链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，开搅拌200r/min，培养40-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到昌帕瓦底链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7.2～7.4；其中，所述的昌帕瓦底链霉菌发酵培养基：芝麻粕粉3%，棉粕1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤三，印度芽孢杆菌发酵液的制备取出印度芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L印度芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30℃培养26-36小时，待总芽孢含量不低于60亿cfu/ml，即可作为印度芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB培养基：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0，NaCl10.0g，琼脂20g，水1000mL，pH7.2；其中，所述印度芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米淀粉22g/L，豆粕粉50g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤四，摩加夫芽孢杆菌发酵液的制备取出摩加夫芽孢杆菌保藏管，用营养肉汤固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汤固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L摩加夫芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为200L/min，8小时后通气量为300L/min，30℃培养24-36小时，待总芽孢含量不低于80亿cfu/ml，即可作为摩加夫芽孢杆菌发酵液；其中，所述营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20g/L，pH7.2±0.2；其中，所述摩加夫芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，木薯粉20g/L，菜粕粉30g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤五，卵孢木霉发酵液的制备取出卵孢木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为卵孢木霉种子液；发酵：将上述制备的卵孢木霉种子液以2%的接种量接种至装有300L卵孢木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min，24小时后通气量为360L/min，30℃培养32-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即可作为卵孢木霉发酵液；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的卵孢木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，甘薯粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤六，混合发酵液将前五个步骤制备的菌液按生绿链霉菌发酵液10-30份，昌帕瓦底链霉菌发酵液20-40份，印度芽孢杆菌发酵液10-30份，摩加夫芽孢杆菌发酵液10-30份，卵孢木霉发酵液10-30份。混匀，即得到防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥。其中，该复合微生物菌肥在防治番茄灰霉病的方法为叶面喷施每次2-5L/亩，其稀释的倍数为100-200倍，连续使用2-3次，每7-10天使用一次。本发明具有的优点和有益效果：、本发明中包含的生绿链霉菌，昌帕瓦底链霉菌，印度芽孢杆菌，摩加夫芽孢杆菌，卵孢木霉五种菌是从400多株微生物菌株中筛选得到的能共生共存，能在植株的根，茎，叶以及土壤中能够生长繁殖，能产生多种抗菌素如四环素，7-金霉素，昌帕霉素A和B（七烯抗真菌的抗菌素）和昌帕瓦底菌素；它们对抑制番茄灰霉病--灰葡萄孢菌有特别强大的效果，从而达到超强防治番茄灰霉病的效果，其对番茄灰霉病的药效高，平均防效在90.0%以上，且针对性强；、本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、重寄生、溶菌作用，或者通过次级代谢产物诱导番茄产生抗病性，增强其防病效果；、本发明中所使用的这5株菌株都是可从土壤中直接分离得到，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向植物根际分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到肥料的效果；(4)、本发明复合微生物菌肥对人、畜安全，属于环境友好型，利用本发明方法防治番茄灰霉病不易产生抗药性，本发明制备方法简单、菌种多，产生的拮抗物质广泛，效果显著，成本低、使用简单。具体实施方式实施例1一种防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥，其特征在于，该微生物菌肥的原料配比为：生绿链霉菌发酵液20份，昌帕瓦底链霉菌发酵液30份，印度芽孢杆菌发酵液20份，摩加夫芽孢杆菌发酵液20份，卵孢木霉发酵液20份。该防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：步骤一：生绿链霉菌发酵液的制备取出生绿链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为生绿链霉菌种子液；发酵：将上述制备的生绿链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的生绿链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，开搅拌200r/min，培养44小时，测得菌体含量为65g/L，停罐，即得到生绿链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7.2～7.4；其中，所述的生绿链霉菌发酵培养基：花生粕粉3%，葡萄糖1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤二：昌帕瓦底链霉菌发酵液的制备取出昌帕瓦底链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为昌帕瓦底链霉菌种子液；发酵：将上述制备的昌帕瓦底链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的昌帕瓦底链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，开搅拌200r/min，培养46小时，测得菌体含量为82g/L，停罐，即得到昌帕瓦底链霉菌发酵液；其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml，PH7.2～7.4；其中，所述的昌帕瓦底链霉菌发酵培养基：芝麻粕粉3%，棉粕1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜3%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤三，印度芽孢杆菌发酵液的制备取出印度芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L印度芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min，30℃培养28小时，测得总芽孢含量为61亿cfu/ml，即作为印度芽孢杆菌发酵液；其中，所述LB培养基：酵母提取物5.0g,蛋白胨10.0,NaCl10.0g，水1000mL，pH7.2，固体培养基中加入琼脂2%；其中，所述印度芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米淀粉22g/L，豆粕粉50g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤四，摩加夫芽孢杆菌发酵液的制备取出摩加夫芽孢杆菌保藏管，用营养肉汤固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时。在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汤固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L摩加夫芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为200L/min，8小时后通气量为300L/min，30℃培养29小时，检测总芽孢含量为83亿cfu/ml，即作为摩加夫芽孢杆菌发酵液；其中，所述营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0g/L,牛肉膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂20g/L，pH7.2±0.2；其中，所述摩加夫芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，木薯粉20g/L，菜粕粉30g/L，硫酸镁0.4g/L，硫酸锰0.5g/L，磷酸二氢钾0.2g/L，碳酸钙5g/L，pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤五，卵孢木霉发酵液的制备取出卵孢木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为卵孢木霉种子液；发酵：将上述制备的卵孢木霉种子液以2%的接种量接种至装有300L卵孢木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为240L/min，24小时后通气量为360L/min，30℃培养36小时，检测菌体含量为81g/L，停罐，即可作为卵孢木霉发酵液；其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；其中，所述的卵孢木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，甘薯粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。步骤六，混合发酵液将前五个步骤制备的菌液按生绿链霉菌发酵液20份，昌帕瓦底链霉菌发酵液30份，印度芽孢杆菌发酵液20份，摩加夫芽孢杆菌发酵液20份，卵孢木霉发酵液20份。混匀，即得到防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥。实施例2本发明复合微生物菌肥对番茄灰霉菌的拮抗作用试验(一)试验时间和地点:2014年4月，在佛山市艳晖生物科技有限公司微生物实验室内进行；(二)试验方法：(1)供试番茄灰霉菌来源：番茄灰霉菌病原菌-灰葡萄孢菌为广西大学农学院赠送，致病力测定表现为强致病力；(2)平板对峙实验:首先将灰葡萄孢菌在PDA平板上活化，培养4天后在菌落边缘区域，用打孔器(6mm)打孔制成菌片，将灰葡萄孢菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例1步骤(1)中制备的复合微生物菌液稀释100倍，点接在距指示菌菌片2.5厘米处，设空白对照(不点接复合微生物菌肥的番茄灰霉菌生长情况)。25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量灰葡萄孢菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量，拮抗作用用抑菌率表示。计算公式为:抑菌率(%)=(对照生长量一处理生长量)/对照生长量X100结果：如表1，复合微生物菌肥对灰葡萄孢菌的抑制率达91.79%；透明的抑菌带宽达21.5毫米，说明本发明复合微生物菌肥对番茄灰霉菌抑菌性强，具有防治番茄灰霉病的生防潜力。表1复合微生物菌肥对灰葡萄孢菌的拮抗作用试验结果处理对照生长量（mm）处理生长量（mm）抑菌率（%）复合微生物菌肥393.291.79实施例3防治番茄灰霉病的复合微生物菌肥在大棚中的试验效果(一)试验处理:试验组：实施例1制备的该复合微生物菌肥在防治番茄灰霉病的方法为叶面喷施每次4L/亩，其稀释的倍数为100-200倍，连续使用2次，每7天使用一次；化学药剂：嘧菌酯悬浮剂(250克/升)(英国先正达有限公司)，用水稀释500倍；空白对照：清水(二)试验方法：2015年3月一7月在河北省沧州市沧县某番茄大棚进行。开始试验时整个棚内番茄叶部灰霉病中度发生，施药前摘除病叶。每小区三行，四次重复，随机区组排列。采用背负式电动喷雾器接种实施例1所制备的复合微生物菌肥；另设对照药剂和空白对照。首次施药7天后再喷施1次，二次施药后的第7天调查各个处理小区的单株病叶数与采摘成熟果实，并计算防效与增产率；结果：从表2可以看出，复合微生物菌肥处理后，其番茄灰霉病的单株病叶数显著低于空白对照和化学药剂对照，其防效达到93.12%，说明本发明的复合微生物菌肥对番茄灰霉病有很好的防治效果；另外，从表2可看出，施用本发明的复合微生物菌肥的番茄产量远远高于空白对照组，增产率达到了40.45%，与化学药剂组对比也比其产量高22.55%，而且发现其果实大而饱满,结果数多，异形果少，口感好，着色鲜亮，其果实甜度也有明显提高。表2复合微生物菌肥对番茄灰霉病防效的对比试验结果处理单株病叶数（片）防效（%）产量（kg）增产率（%）复合微生物菌肥0.33c93.1212540.45化学药剂1.56b68.4210214.61空白对照4.94a89以上已将本发明做一详细说明，以上所述，仅为本发明之较佳实施例而已，当不能限定本发明实施范围，即凡依本申请范围所作均等变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖范围内。当前第1页1 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