一种防治马铃薯枯萎病的微生物菌肥及其制备方法和用途与流程

本发明涉及农业和生物技术领域，尤其涉及一种防治马铃薯枯萎病的微生物菌肥及其制备方法和用途。

背景技术：

有别于欧美等国家的休耕制度，我国土地的种植压力更大，连年大肥大水的种植模式下，随着种植年限的增加，导致土壤结构破坏、自毒物质累积、病原菌大量繁殖，土传病害和连茬障碍逐年加重，农产品产量及品质不断下降，对食品的安全性构成了巨大的威胁。

马铃薯枯萎病是马铃薯常见的土传病害，目前在一些重茬地块发病越来越重，严重影响了马铃薯的产量和品质，直接导致其经济效益的下降，制约了马铃薯产业的发展。

马铃薯枯萎病是由镰刀属真菌寄生引起的一种真菌性病害，该类病原菌可在土壤或病残体中存活5-6年，其侵染能力不会随着时间而减弱。在适宜条件下，病原菌可由根部侵入植株体内，通过增殖以及分泌代谢产物堵塞植株维管束，影响植株营养和水分的正常传导。初期表现为在中午或强光下叶片垂萎，早上或者傍晚可恢复；随着加重叶片由下而上枯死，根茎剖面显示维管束褐变。

技术实现要素：

针对以上技术缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种用于防治马铃薯枯萎病的微生物菌肥。

为解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种用于防治马铃薯枯萎病的微生物菌肥，所述微生物菌肥包括如下质量配比的原料：甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂1-10%、生化黄腐酸30-75%、糖蜜粉10-30%、可溶性淀粉1-15%、助剂1-25%。

生物保藏信息：本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌（bacillusmethylotrophicus），简称jq-018菌株，已于2015年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.11838。该菌株的特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明，其中，该菌株在不同培养条件下对镰刀菌均有着显著的抑制效果，尤其是通过定植试验发现，该菌株可在马铃薯植株的根、茎、叶及新生块茎中长期定植，从占位角度可长期抑制病原菌的侵染及增殖。

其中，所述助剂包括分别占所述助剂质量百分比为1-15%的分散剂、1-15%的润湿剂和1-15%的崩解剂。

其中，所述微生物菌肥的剂型为用于冲施、喷雾或微滴灌的可溶性粉剂。

本发明的另一个目的是提供一种用于防治马铃薯枯萎病的微生物菌肥的制备方法，具体包括发酵制备所述甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂，将制备所得的生防菌剂与配料中的其余原料以机械混合的方式充分混合均匀即得。

其中，所述甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂的制备方法包括以下步骤：

（1）甲基营养型芽孢杆菌的发酵液的配制：

①菌种活化：将甲基营养型芽孢杆菌接种到固体营养琼脂培养基中活化，培养温度为37℃，培养时间24h；其中，所用营养琼脂培养基包括蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000ml，在ph为7.0-7.2条件下，121℃高温灭菌30min得到；

②一级种子液制备：将上述平板活化的甲基营养型芽孢杆菌接种至lb培养基，培养条件为温度35-38℃，转速200-260rpm，摇床培养16-24h，作为一级种子液；其中，所用lb培养基包括胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，自来水1000ml，在ph为7.0-7.2条件下，121℃高温灭菌30min得到；

③二级种子液制备：将一级种子液以体积百分比0.5-3%接入1吨的种子罐，溶氧量控制为15-20％，搅拌速度200rpm，发酵温度37℃，培养至对数生长期，作为二级种子液；其中，种子罐所用的培养基包括以下质量配比的原料：玉米淀粉1-10%、玉米浆干粉1-10%、蛋白胨0.1-5%、硫酸镁2%、硫酸锰4%、碳酸钙1-5%和自来水；

④发酵培养：将种子罐发酵培养好的二级种子液培养液按照大规模工业发酵罐所用培养基的体积比5％接种量接入大规模工业发酵罐培养，在溶氧量为15-18％，搅拌速度200rpm，发酵温度37℃条件下培养至最终生物量为≥70亿/ml，芽孢形成率达到98％以上，发酵完成，得到甲基营养型芽孢杆菌发酵液；其中，大规模工业发酵罐所用培养基包括以下质量配比的原料：玉米淀粉1-10%、玉米浆干粉1-10%、蛋白胨0.1-5%、硫酸镁2%、硫酸锰%、碳酸钙1-5%，其余为水；

（2）甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂的制备：

将制备的发酵液直接进行喷雾干燥，其中，进口温度150-200℃，出口温度50-90℃，以可溶性淀粉为喷雾载体，得到甲基营养型芽孢杆菌jq-018的生防菌剂。

进一步地，制备得到所述生防菌剂后，经过气流粉碎后过325目标准筛，从而得到可用于冲施、喷雾或微滴灌的微生物菌肥可溶性粉剂。

本发明制备的用于防治马铃薯枯萎病的微生物菌肥的用途为，将该微生物菌肥用于减轻或免除马铃薯膨薯期和积累期的枯萎病高发期的侵害。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的甲基营养型芽孢杆菌菌种应用于防治马铃薯枯萎病时，在平板培养不同条件下对病原菌均有良好的防治效果，在田间使用后，能够显著减轻甚至免除马铃薯膨薯期和积累期的枯萎病高发期的侵害。

附图说明

图1是本发明甲基营养型芽孢杆菌菌株的显微形态及菌落形态；

图2是本发明甲基营养型芽孢杆菌菌株发酵液拮抗效果测定的照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，进一步阐述本发明。以下具体实施例便于更好的理解本发明，但不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用实验材料，如无特殊说明，均为商店购买的常规生化制剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复试验，结果取平均值。

马铃薯枯萎病菌：内蒙古武川县福元村发病马铃薯茎上分离得到。

实施例中所采用的微生物菌剂及菌液均由山东京青农业科技有限公司生产制备。

实施例1、生防菌株筛选

将分离活化的单菌落与纯化培养的马铃薯病原菌进行平板对峙实验，以下是筛选过程对峙实验及其结果：

在pda培养基平板中央接入预先培养的病原菌（镰刀菌），待生长大小合适时用直径9mm的打孔器打出菌斑，移至新的培养基平板中央，在距离病原菌菌斑2cm处接种公司保藏的自有生防菌单菌落，每个处理重复3次，置于25℃生化培养箱培养3-6d，观察各菌落直径，测定抑菌率，对比结果如表1所示。

其中，本实施例中所用的甲基营养型芽孢杆菌（bacillusmethylotrophicus），简称jq-018菌株(已于2015年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.11838)。如图1所示，为本发明培育的甲基营养型芽孢杆菌菌株的显微形态及菌落形态。

抑菌率(%)=（对照组直径-处理组直径）/对照组直径×100%

表1菌株单菌落对镰刀菌处理的对比结果

注：上表中jq-001等菌株均为公司自有保藏菌株，其中jq-001、012、016均为枯草芽孢杆菌；jq-016、017、018为甲基营养型芽孢杆菌；jq-032、035为解淀粉芽孢杆菌。

从表1可看出jq-018菌株对马铃薯镰刀病的抑菌活性最高。

实施例2、jq-018菌株发酵液拮抗效果测定

固体培养基：na培养基，121℃灭菌30min；

pda培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和16g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分瓶装，每瓶定量75ml，121℃灭菌30min取出冷却后贮存备用；

液体培养基：即lb培养基，包括胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g和自来水1000ml，在ph7.0-7.2条件下经121℃高温灭菌30min即得。

实验方法：采用平板对峙培养法

1、病原菌的培养

取已经检定的马铃薯镰刀菌，于pda培养基上培养待用。

2、jq-018菌株发酵液的制备

将保存在斜面上的jq-018菌种用接种环接入na培养基平板上划线培养，37℃恒温培养24h活化。将活化的菌株接入装有50mllb培养基的500ml三角瓶中，在34℃、230r/min条件下，摇床振荡培养25h，制备菌种发酵液，待其完全产孢后，测定发酵液菌量。

3、发酵液处理

将测定好菌量的发酵液稀释成0.01、0.05、0.1、0.5、1、1.5、2亿/ml菌量，用1ml移液枪分别取各个浓度菌液3ml与灭菌并冷却至45℃熔融态的pda培养基（此培养基用100ml锥形瓶定量分装75ml）按1:25比例混匀，制成带菌平板，平均每板含有1ml菌液；以不接种拮抗菌的发酵液与培养基混匀倒成的平板为对照。

用直径5mm的打孔器从预先培养的镰刀菌平板上打出菌板，接入凝固的培养皿内，每平板均匀接种两片，每处理重复3次。25℃恒温箱中倒扣培养6天。

4、试验数据处理

待对照菌丝长满板时，拍照记录，如图2所示，得到本发明甲基营养型芽孢杆菌菌株发酵液拮抗效果测定的照片，通过观察菌体长势情况并采用十字交叉法测量菌落直径、抑菌圈直径，计算平均值和相对抑菌率记录菌落直径大小，比较不同菌量对病原菌的抑制效果，按照下列公式计算抑菌率。

抑菌率(%)=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

5、结果对比

表2jq-018不同菌量对马铃薯枯萎病的抑菌率

从表2可以看出，本实施例的甲基营养型芽孢杆菌菌株在较低浓度菌量下的抑菌率即可达到65.56%，随着菌量的增加，其抑菌效果不断增强，在1亿/ml的菌浓时达到83.57%，继续增大菌量其抑菌效果无显著增强。因此，最经济即可取得良好防效的浓度可以选择1亿/ml。

实施例3、甲基营养型芽孢杆菌jq-018微生物菌肥的制备和应用

一、甲基营养型芽孢杆菌jq-018微生物菌肥的制备具体步骤如下：

1、菌种活化：将低温保存的甲基营养型芽孢杆菌jq-018菌株接种于na固体培养基上，于37℃培养24h。

2、一级种子液制备：挑取固体培养基中甲基营养型芽孢杆菌单菌落，接入lb液体培养基中，转速250rpm，温度37℃，摇床培养20h，作为一级种子液。

3、二级种子液制备：按照1.5%（体积百分比）的接种量向种子培养基中接入步骤2制备的一级种子液，通气量为1.2v／v·min，搅拌速度为220rpm，培养时间为22h，作为二级种子液。

其中，本步骤所用种子培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米淀粉6%、玉米浆干粉5%、蛋白胨3%、硫酸镁2%、硫酸锰4%、碳酸钙3%、自来水500ml、ph7.5，121℃灭菌30min。

4、发酵培养：按照体积百分比8%的接种量向发酵培养基中接入步骤3制备的二级种子液，通气量为1.2v／v·min，搅拌速度为220rpm，培养时间为28h，得到发酵液。

其中，本步骤所用发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米淀粉6%、玉米浆干粉5%、蛋白胨3%、硫酸镁2%、硫酸锰4%、碳酸钙1-5%和自来水；培养条件：溶氧量为18％，搅拌速度200rpm，发酵温度37℃；

5、喷雾干燥：以可溶性淀粉为喷雾载体，将上述发酵产物直接进行喷雾干燥，控制进口温度180℃，出口温度75℃，得到甲基营养型芽孢杆菌jq-018菌剂；

6、将制备得到的生防菌剂经过气流粉碎后过325目标准筛，保证过筛率不低于99%；

7、菌肥制备：将甲基营养型芽孢杆菌生防菌剂、生化黄腐酸、糖蜜粉、可溶性淀粉、助剂按质量配比甲基营养型芽孢杆菌菌剂8%、生化黄腐酸55%、糖蜜粉20%、可溶性淀粉8%、助剂9%以机械混合的方式充分混合均匀即得。

二、jq-018菌剂的定植情况考察试验

选取苗株长势较一致的盆栽马铃薯，分别向其根部灌施10⁷cfu/ml的jq-018发酵液50ml，自第二天开始跟踪考察马铃薯母薯、根、茎、叶、及后期新薯中是否存在jq-018，具体情况见表3。

表3jq-018的定植情况

注：“+”表示存在，“++”表示大量存在，“-”表示不存在。

试验表明，灌根处理下，jq-018均可迅速在马铃薯体内定植，且可长期存在，其良好的对峙及占位特性使其有着巨大的应用潜力。

三、甲基营养型芽孢杆菌jq-018微生物菌肥的应用—大田试验

1、供试药剂

本发明制备的甲基营养型芽孢杆菌jq-018菌株可溶性粉剂；

多菌灵80%可湿性粉剂。

2、供试作物与防治对象

供试作物为马铃薯，品种为夏波蒂。

防治对象：马铃薯枯萎病

3、试验地情况

试验地设在河北省张北县大囫囵村，海拔1600—1800米，土壤为沙质土壤，有机质1.15%-1.35%。

4、马铃薯枯萎病小区试验

①灌根试验设计及安排

本试验设计了甲基营养型芽孢杆菌（jq-018菌株）可溶性粉剂5kg/亩（处理组一）、可溶性粉剂10kg/亩（处理组二）、常规药剂对照（多菌灵300倍液，处理组三）及空白对照（灌清水，处理四）共4个处理，重复3次，共12个小区，每小区面积10m²，各小区随机排列。

②试验调查及计算方法

于马铃薯收获期，调查每组病情指数。

病情指数调查每株全部叶片的病情严重度，并按下列标准分级：

0级，无任何症状；1级，叶片出现失水但未萎蔫；2级，0-1/4叶片萎蔫；3级，1/4-1/2叶片萎蔫；4级，1/2-3/4叶片萎蔫；5级，3/4以上叶片萎蔫；6级，全株枯死。

病情指数及病指防效计算公式如下：

病情指数=∑（各级病叶数×各级代表值）/(调查总叶数×最高级代表值)×100%

病指防效=（对照病指-实验组病指）/对照病指×100%

③结果

表4灌根处理实验结果统计

注：由于调查样本较大，各级病叶数、各级代表值等数据就不在此处罗列。

结果显示，甲基营养型芽孢杆菌可溶性粉剂对马铃薯枯萎病有着良好的防治效果，其中甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂10kg/亩防治效果最好，防治效果达到了87.50%。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。