一种大规模制备多糖修饰纳米硒的方法及应用与流程

本发明属于硒资源利用领域，特别涉及一种大规模制备多糖修饰纳米硒的方法及应用。

背景技术：

硒是动植物必须的微量元素，它在抗氧化防御、免疫调节以及抗衰老方面都起一定的作用。缺硒病症为禽畜类常发病之一。人体自身不能合成硒，必须要从外界摄入，硒在地质化学中属于超微量元素，天然的硒只有一种稳定同位素，其原子量为79。根据现有技术，已知灰色元素硒和黑色元素硒，几乎无生物活性且有毒性，而对于红色元素硒生物性质的认识是模糊的。硒是第四周期的准金属元素，我国科学家对硒的研究主要集中在其性质及用途上，如灰硒被广泛应用与光电池、复印等技术领域，因为它具有良好的光点特性及单向导电性。晶型硒具有较低的熔点、光导率和高的活性，在化工领域有着广泛的市场应用。如cn105707659a公开了一种由纳米硒、壳聚糖、霉菌毒素配比复合制成的解毒剂及其制备方法，但是其合成条件苛刻，对设备要求高。cn1264521c公开一种由甲壳素(包括壳聚糖，水溶性壳聚糖和壳寡糖)同硒化合物反应制备的纳米硒，该方法只是适合小规模生产。cn104825484b公开了一种壳聚糖或羧甲基壳聚糖功能化纳米硒复合物的制备方法，但是反应过程其需要额外添加碘化钾，从而造成化学试剂的浪费。cn104496954b公开了一种功能化纳米硒的制备方法，但是其同样在反应的制备过程中用到了醋酸，不利于工业化生产。cn103420344b公开了一种常温常压合成纳米硒的方法，其合成的纳米硒尺寸较小。cn108208349a公开纳米硒在农业生产及加工中的应用，扩大了硒在食品及保健品等方面的用途。cn105154474b其提供了一种红色纳米硒的生物制备方法，这不仅能够降低纳米硒的生产成本，还为蛋白核小球藻开辟了新的药用价值和保健用途。在目前的纳米硒合成工艺中，基本都是靠添加多糖、表面活性剂、蛋白质等进行表面修饰，提高纳米硒的稳定性。这些方法在实验室规模试验都能取得比较好的修饰效果。但是，当体积提高到10升，甚至更高的时候，都存在着修饰剂不能溶解、聚集沉淀严重、后续分离繁琐、毒副作用大等问题。以壳聚糖为例，这是最广泛应用的纳米硒合成修饰剂，当用10升或30升的反应体系，按小规模合成的经验配料比，即使使用大量的醋酸也无法很好溶解，且对反应设备造成损害，并且造成环境污染。其他目前大量使用的修饰剂也都存在类似的问题。总体而言，现有纳米硒技术存在以下缺点：1.目前纳米硒合成的专利都是小规模合成，无法进行工业化大生产；2.现有技术合成纳米硒时，其加入的修饰剂多需要经过预处理，导致工艺繁琐、纳米硒成本比较昂贵，而且会造成环境污染，腐蚀设备等问题。因此，急需开发简便、环境友好、适合大规模生产的纳米硒合成技术。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种大规模制备多糖修饰纳米硒的方法。

本发明另一目的在于提供提供上述大规模制备多糖修饰纳米硒的方法的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种大规模制备多糖修饰纳米硒的方法，包括以下步骤：

(1)将多糖水溶液与还原剂水溶液混合搅拌得到混合溶液1；

(2)向步骤(1)所得混合溶液1中加入水，继续搅拌得到混合溶液2；

(3)向步骤(2)所得混合溶液2中加入亚硒酸钠水溶液，搅拌均匀，形成反应体系，反应后得到多糖修饰纳米硒水溶液；

(4)将步骤(3)所得多糖修饰纳米硒水溶液纯化，得到纯化后的多糖修饰纳米硒水溶液。

步骤(1)所述的多糖为香菇多糖、壳聚糖、水溶性壳聚糖衍生物、壳寡糖、云芝多糖、茶树菇多糖和黑木耳多糖中的至少一种。

所述的香菇多糖为来源于香菇子实体的多糖。

步骤(1)所述的多糖水溶液中多糖的浓度为5～10g/l。

步骤(1)所述的还原剂优选为维生素c(vc)。

步骤(1)所述的还原剂水溶液中还原剂的浓度为50～80mm。

步骤(1)所述搅拌的条件为：以50～120转/分钟，搅拌15～60分钟；优选为以90转/分钟，搅拌30分钟。

步骤(2)所述水的用量按每100～200g多糖配比50～100l水计算。

步骤(2)所述搅拌的条件为：以40～80转/分钟，搅拌5～20分钟。

步骤(3)所述的亚硒酸钠水溶液中亚硒酸钠的浓度为2～4g/l。

步骤(3)所述反应体系中多糖、还原剂和亚硒酸钠的质量比为(0.1～5)：1：(0.1～1)；优选为(0.5～2)：1：(0.17～1)；更优选为(0.6～0.8)：(0.9～1.1)：(0.4～0.6)；最优选为0.7：1：0.5。

步骤(3)中所述的反应体系的体积为50l以上，优选为50～1000l，进一步优选为100～1000l，进一步优选为200～1000l，更优选为200～500l，最优选为500l。

步骤(3)所述的搅拌条件为：以50～100转/分钟，搅拌2～5分钟。

步骤(3)所述的反应条件为：压力为0.1～1mpa，反应温度为15～70℃，反应时间为4～12h；

优选地，步骤(3)所述的反应条件为：压力为0.1mpa，反应温度为50℃，反应时间为8h。

步骤(4)所述的纯化的方式为通过使用滤膜对步骤(3)所得的多糖修饰纳米硒水溶液超滤。

所述的滤膜的规格为截留分子量是1～200kd的滤膜；优选为截留分子量是5～100kd的滤膜；更优选为截留分子量是5kd、10kd或100kd的滤膜。

上述大规模制备多糖修饰纳米硒的方法在大规模制备多糖修饰纳米硒中的应用。

所述的大规模是反应体系为50l以上的规模，优选为反应体系为50～1000l的规模；进一步优选为100～1000l的反应规模；进一步优选为200～1000l的反应规模；最优选为200～500l的反应规模。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

1、本发明提供一种简单的大规模工业化生产纳米硒的制备方法，将反应体系增大到工业级规模，这相比于其他小规模实验室反应体系，是一个巨大的突破。

2、传统修饰剂多糖是需要预处理的，造成其合成的纳米硒成本比较昂贵，或者并不能得到稳定的纳米硒，生产工艺比较复杂，而本发明的多糖不需要经过任何处理，降低了成本，适合大规模生产。

附图说明

图1为实施例1中500l香菇多糖-纳米硒、单质纳米硒和香菇多糖的红外光谱图。

图2为实施例1中500l香菇多糖-纳米硒的紫外光谱图。

图3为实施例1中500l香菇多糖-纳米硒三次产率图。

图4为实施例4～7制备得到不同多糖修饰纳米硒的实验现象图；其中图(a)为壳寡糖，图(b)为云芝多糖，图(c)为茶树菇多糖，图(d)为黑木耳多糖。

图5为实施例8～11制备得到的纳米硒粒子粒径及电位图；其中，图(a)为粒径图，图(b)为电位图。

图6为实施例11制备得到的香菇多糖-纳米硒透析前后溶解性图；其中，图(a)为25ml香菇多糖图-纳米硒透析前的溶解性图，图(b)为电位图25ml香菇多糖图-纳米硒透析后的溶解性图。

图7为实施例1、实施例11和实施例12不同规模制备得到的香菇多糖-纳米硒的粒径和电位比较图；其中，图(a)为粒径图，图(b)为电位图。

图8为实施例1、实施例11和实施例12制备得到的香菇多糖-纳米硒的透射电镜检测结果图；其中，图(a)为25ml反应体系的纳米硒透射电镜图，×37000；图(b)为10l反应体系的纳米硒透射电镜图，×97000；图(c)为500l反应体系的纳米硒透射电镜图，×97000。

图9为实施例1、实施例11和实施例12不同规模制备的香菇多糖-纳米硒的稳定性比较图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。

实施例1

在500升反应器中，将浓度为100l10g/l的香菇多糖(陕西森弗天然制品有限公司，1kg/包50％，cas号37339-90-5)水溶液和100l浓度为80mm的vc水溶液混合均匀。然后将混合溶液泵入500l发酵罐中，加水至450l，启动发酵罐，搅拌速度维持在90转/min搅拌5min，继续将香菇多糖水溶液与vc水溶液混匀。接着用低压水泵缓慢加入30l含700g的亚硒酸钠水溶液。封闭发酵罐，设置转数70转/min，在压力为0.1mpa，反应温度为50℃的条件下反应8h。反应完成后，通过发酵罐出料口将制备的香菇多糖修饰的纳米水硒溶液导出，放置于干净的桶内。然后将香菇多糖修饰的纳米硒水溶液通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤，得到纯化后的香菇多糖修饰的纳米硒水溶液(简称香菇多糖-纳米硒)，在4℃下保存。

图1为实施例1制备得到的香菇多糖-纳米硒、单质纳米硒和香菇多糖的红外光谱图。如图所示，纳米硒和香菇多糖上的羟基作用，使得-oh的伸缩振动峰由3400cm^-1蓝移到3434cm^-1，-h2o+的变形振动峰由1600cm^-1蓝移到1650cm^-1，说明纳米硒与香菇多糖成功结合。

图2为实施例1制备得到的香菇多糖-纳米硒的紫外光谱图。由图可知，本实施例生产的纳米硒在波长为280nm左右有一个很强的吸收峰，由于本身单独的香菇多糖是没有吸收峰的，实验得到的紫外谱图多了一个吸收峰，正是由于纳米粒子的出现造成的，说明了香菇多糖修饰纳米硒的成功合成。

将实施例1的试验重复3次，图3为三次试验制备出香菇多糖-纳米硒的产率图。从图中可以看出，通过3次工业化生产所得到的纳米硒产率都在50％左右，说明试验的重复性良好，即本发明大规模制备纳米硒的反应条件较为成熟，产率较为稳定。

实施例2

在25毫升反应器中，用壳聚糖(国药集团化学试剂有限公司，生化试剂，批号20160525，100g/瓶)为修饰剂制备纳米硒。首先将0.05g壳聚糖与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，添加0.2ml1％(v/v)的醋酸溶解，然后加水5ml，在90转/min的条件下搅拌5min。再加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数为70转/min，在0.1mpa、50℃的条件下反应8h，所得溶液呈透明的橙色溶液。最后将壳聚糖修饰的纳米硒水溶液通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤，得到纯化后的壳聚糖修饰的纳米硒水溶液，外观呈现橙色，在4℃下保存。

将所得橙色溶液放置120小时后，出现大量灰红色絮状沉淀，且无法摇匀分散，壳聚糖纳米硒大量沉淀，稳定性差。

实施例3

在25毫升反应器中，用羧甲基壳聚糖(取代度大于80％，麦克林mackin)代替实施例2中的酸溶性的壳聚糖制备纳米硒。首先将0.05g羧甲基壳聚糖与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，然后加水5ml，在90转/min搅拌5min。再加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h。最后将羧甲基壳聚糖修饰的纳米硒水溶液通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤得到纯化后的羧甲基壳聚糖修饰的纳米水硒溶液，在4℃下保存。

实验结果表明，虽然羧甲基壳聚糖很容易溶解在水中，但在向羧甲基壳聚糖与亚硒酸钠混合溶液中滴加vc水溶液时，纳米硒迅速聚沉，不能制得性质稳定的纳米硒。

实施例4

本实施例与实施例3的不同之处在于，用壳寡糖(分子量为3600，cas号148411-57-8，青岛博智汇力生物科技有限公司)代替壳聚糖为修饰剂制备纳米硒，具体步骤如下：在25毫升反应器中，先将0.05g壳寡糖与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，在90转/min搅拌5min；然后加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h，反应结束通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤。所制得的壳寡糖纳米硒稳定性有所提高，但在透析的过程中依然容易聚沉。

实施例5

本实施例与实施例3的不同之处在于，用云芝多糖(分子量1.3×106以上，1kg/袋，10％～50％纯度，山西玉宁生物科技有限公司)为修饰剂制备纳米硒，具体步骤如下：在25毫升反应器中，先将0.05g云芝多糖与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，在90转/min搅拌5min。最后加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h，反应结束通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤。所得到的云芝多糖纳米硒水溶液依然容易聚沉。

实施例6

本实施例与实施例3的不同之处在于，用茶树菇多糖(1kg/袋，98％含量西安青芷生物技术有限公司)为修饰剂制备纳米硒，具体步骤如下：在25毫升反应器中，先将0.05g茶树菇多糖与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，在90转/min搅拌5min，然后加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h，反应结束通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤。所得茶树菇多糖纳米硒水溶液依然容易聚沉。

实施例7

本实施例与实施例3的不同之处在于，用黑木耳多糖(30％，大于80目，1kg/袋，陕西慈缘生物技术有限公司)为修饰剂制备纳米硒，具体步骤如下：在25毫升反应器中，先将0.05g黑木耳多糖与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，在90转/min搅拌5min，然后加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h，反应结束通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤。所得黑木耳多糖纳米硒水溶液依然容易聚沉。

图4为实施例4～7制备得到不同多糖修饰纳米硒的实验现象图，其中图(a)为壳寡糖，图(b)为云芝多糖，图(c)为茶树菇多糖，图(d)为黑木耳多糖。通过对比可以发现，壳寡糖和云芝多糖修饰的纳米硒，在反应的过程中就会产生沉淀，而茶树菇多糖和黑木耳多糖在纳米硒透析纯化的过程中也会发生聚沉的现象，说明这四种多糖都不适合工业化生产纳米硒。

实施例8

本实施例与实施例3的不同之处在于，用吐温40(分子量为1285)为修饰剂制备纳米硒，具体步骤如下：在25毫升反应器中，先将0.05g吐温40与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，在90转/min搅拌5min。最后加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h，反应结束通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤，得到吐温40修饰的纳米硒水溶液。

实施例9

本实施例与实施例3的不同之处在于，用吐温60(分子量为607)为修饰剂制备纳米硒，具体步骤如下：在25毫升反应器中，先将0.05g吐温60与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，在90转/min搅拌5min。最后加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa，50℃下反应8h，反应结束通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤，得到吐温60修饰的纳米硒水溶液。

实施例10

本实施例与实施例3的不同之处在于，用吐温80(分子量为1312)为修饰剂制备纳米硒，具体步骤如下：在25毫升反应器中，先将0.05g吐温80与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，在90转/min搅拌5min。最后加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h，反应结束通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤，得到吐温80修饰的纳米硒水溶液。

实施例11

在25毫升反应器中，用香菇多糖(陕西森弗天然制品有限公司，1kg/包50％，cas号37339-90-5)为修饰剂制备纳米硒。首先将0.05g香菇多糖与5ml浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，然后加水5ml，在90转/min搅拌5min。再加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液5ml，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h，得到的香菇多糖修饰的纳米硒溶液通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤，得到纯化后的香菇多糖修饰的纳米硒水溶液，在4℃下保存。

图5为实施例8～11制备吐温40、吐温60、吐温80及香菇多糖得到的纳米硒粒子粒径及电位图。由图可知，香菇多糖修饰的纳米硒粒径最小，并且电位保持在34.37ev，这说明了香菇多糖修饰比吐温修饰的更加稳定，更有利于工业化生产。图6为实施例11中25ml香菇多糖修饰的纳米硒的透析前后溶解性图。由图可知，小规模香菇多糖修饰的纳米硒透析过程中并不会影戏其溶解性，依然保持一个良好的状态，这证明香菇多糖可以作为一个良好的修饰剂，初步证明了此方法的可行性。

实施例12

在10升反应器中，用香菇多糖(陕西森弗天然制品有限公司，1kg/包50％，cas号37339-90-5)为修饰剂制备纳米硒。首先将20g香菇多糖与2l浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，然后加水2l，在90转/min搅拌5min。再加入0.5l浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h，得到的香菇多糖修饰的纳米硒水溶液通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤，得到纯化后的香菇多糖修饰的纳米水硒溶液，在4℃下保存。

对实施例1、实施例11和实施例12所制备的多糖修饰的纳米硒的粒径进行表征，图7为实施例1、实施例11和12不同规模制备的香菇多糖修饰的纳米硒粒径(a)和电位(b)比较图。由图可知，三种不同反应规模得到的纳米硒的水合粒径都保持在120nm左右，并且电位值保持在-15mv附近，说明了本发明扩大纳米硒的反应体系，并不会对其合成过程造成干扰。图8为实施例1(500l香菇多糖)、实施例11(25ml香菇多糖)和实施例12(10l香菇多糖)制备的香菇多糖修饰纳米硒的透射电镜图，其中图(a)为25ml反应体系的纳米硒透射电镜图，×37000；图(b)为10l反应体系的纳米硒透射电镜图，×97000；图(c)为500l反应体系的纳米硒透射电镜图，×97000。由图可知，三种体系得到的纳米硒实际粒径都在80～120nm，并且稳定性及分散性良好。进一步，对实施例1、实施例11和实施例12所制备的多糖修饰的纳米硒的稳定性进行了表征。图9为实施例1、实施例11和实施例12不同规模制备的香菇多糖-纳米硒的稳定性比较图。由图可知，将三种体系得到的纳米硒放置21天，其粒径变化都不大，证明了500l香菇多糖纳米硒合成方案的可行性。

实施例13

在10升反应器中，用壳聚糖为修饰剂制备纳米硒。首先将20g壳聚糖(国药集团化学试剂有限公司，生化试剂，批号20160525，100g/瓶)与2l浓度为80mm的vc水溶液混合均匀，再用1％(v/v)的醋酸水溶液溶解壳聚糖，然后加水2l，在90转/min搅拌5min。再加入浓度为23.3g/l的亚硒酸钠水溶液2l，设置转数70转/min，在0.1mpa、50℃下反应8h。然后将壳聚糖修饰的纳米硒水溶液通过滤膜(截留分子量：10kd)过滤得到纯化后的壳聚糖修饰的纳米硒水溶液，在4℃下保存。

在溶解壳聚糖的过程中，发现壳聚糖大量聚集，无法溶解。即使提高醋酸水溶液浓度为5％(v/v)、10％(v/v)，壳聚糖的溶解度略有提高但依然无法全部溶解，致使无法进行后续纳米硒的制备。并且使用高浓度的醋酸不仅会造成反应器的腐蚀，还会带来环境污染问题。在加入亚硒酸钠水溶液后，发现制备的纳米硒大量沉淀，稳定性差。

从上述结果可以看到，通过壳寡糖，云芝多糖，茶树菇多糖和黑木耳多糖修饰的纳米硒非常不稳定，不适合工业化生产。而壳聚糖修饰纳米硒需要额外加入醋酸溶解，会腐蚀设备，带来污染；水溶性壳聚糖在中试生产会聚沉，得不到稳定的纳米硒。吐温系列修饰得到的纳米硒其粒径及稳定性都不如香菇多糖修饰的，进一步，通过不同规模体系的合成，对比发现，香菇多糖修饰的纳米硒稳定性良好，适合工业化生产。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。