一种具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针的制备方法及其用途与流程

本发明涉及氧化石墨烯纳米材料合成及生物分子影像分析领域，具体涉及一种具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针的制备方法及其用途。

背景技术：

核酸是由许多核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，是生命的最基本物质之一。根据其化学组成及核苷酸排列顺序的不同，可以分为脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)。dna是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，rna在蛋白质合成过程中起着重要作用。因此，核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。在活细胞中实时原位观察dna和rna结构的动态变化，对深入理解细胞的转录、凋亡等生命活动以及揭示肿瘤发生、病毒感染、遗传变异等疾病机理具有重要意义。

然而，由于细胞包含细胞膜及各种细胞器内膜等复杂膜结构，尤其是细胞核膜结构，其对核内外物质的交换具有高度的选择性，能够严格控制细胞核内外的物质运输及信息交换，以维持遗传信息的稳定性。因此，目前能用于细胞内dna和rna成像探针的并不多见。更重要的是，由于目前的dna和rna成像探针的局限性，在活细胞及生物活体中成功区分dna和rna，并实时动态的观察其结构变化仍然是一项挑战。首先，在dna和rna的结合染料中，只有少数的能够穿透层层的细胞内膜屏障，而且几乎没有一种能够直接穿透组织及器官屏障。其次，大多数的有机染料都有光漂白性，无法进行长时间的动态观察，而且无法承受需要高激光能量的超高分辨扫描成像。最后，目前大多数的染料不能同步区分dna和rna，需要同时使用多种染料，甚至需要借助复杂昂贵的成像技术，如门控技术等，这虽然能部分的解决问题，但多染料的同时使用同时也造成了染料的输送及生物分布的复杂化。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术所存在的问题，提供了一种具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针的制备方法及其用途。本发明的氧化石墨烯探针具有高效生物膜穿透能力以及核酸高效识别能力，有效解决了现有dna与rna成像探针存在的活细胞及生物活体水平上膜穿透能力差、易光漂白、无法同步检测等技术问题。

本发明具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针，是以导电炭黑颗粒为起始原料，首先经过硝酸氧化得到表面含羧基的氧化石墨烯，然后与氯化亚砜回流反应得到酰氯化中间体，再与过量二胺反应，得到表面含有氨基的氧化石墨烯，最后，通过酰胺化反应将带正电的阳离子化合物修饰到氧化石墨烯表面，得到表面带正电的氧化石墨烯，即所述具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针。具体包括如下步骤：

步骤1：将商业化的导电炭黑颗粒0.2g(粒径30nm)置于50ml、6m的硝酸中回流反应24小时，反应结束后冷却至室温，离心，收集上清液；所得上清液在180-200℃下蒸发除去溶剂，得到红棕色固体，于真空干燥箱中干燥，得到表面含羧基的氧化石墨烯；硝酸氧化得到的羧基氧化石墨烯具有均一的小尺寸，粒径尺寸＜10nm。

步骤2：向步骤1获得的表面含羧基的氧化石墨烯中加入过量氯化亚砜，然后滴加几滴无水dmf，搅拌溶解，回流反应，反应结束后蒸馏除去过量氯化亚砜，得到酰氯化中间体；本步骤中氯化亚砜做溶剂，dmf起助溶催化作用。

步骤3：向步骤2所得酰氯化中间体中加入二胺，并加入无水四氢呋喃作溶剂，60-80℃反应48-72小时，硅胶柱纯化后得到表面含有氨基的氧化石墨烯；本步骤中二胺的添加量是酰氯化中间体的1.5-2倍当量。

步骤3中，所述二胺包括乙二胺、对苯二胺、己二胺等能修饰到羧基氧化石墨烯上的二胺化合物。

步骤3中，硅胶柱纯化时的洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝5：1-10：1(v/v)。

步骤4：向带正电的阳离子化合物中加过量氯化亚砜，然后滴加几滴dmf，搅拌溶解，回流至反应完全，蒸馏除去过量的氯化亚砜，然后将获得的酰氯化的带正电的阳离子化合物加入到步骤3获得的表面含有氨基的氧化石墨烯中，并加入无水四氢呋喃作溶剂，60-80℃反应48-72小时，所得产物用乙醇溶解，旋蒸，再以超纯水溶解，即得所述高效膜穿透能力氧化石墨烯探针。

步骤4中，带正电的阳离子化合物的用量与步骤3中二胺的加入量相同，即二者质量比为1：1。

步骤4中，所述带正电的阳离子化合物是含有羧基的可以通过酰胺化反应偶联的离子型化合物，如羧丁基三苯基溴化膦、羧基季铵盐等。

本发明具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针的用途，是在活细胞的细胞核定位过程中作为检测试剂使用。

进一步地，所述氧化石墨烯探针在活细胞的细胞核定位过程中作为检测试剂使用，能够实现活细胞内dna和rna的同步成像。

更进一步地，所述氧化石墨烯探针能够实现活细胞内dna和rna两种不同核酸的同步区分成像检测。

本发明具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针的用途，是在活细胞有丝分裂过程中作为检测试剂使用，对活细胞内dna和rna的结构动态变化进行成像分析。所述氧化石墨烯探针与dna和rna的结合作用牢固，不会随着有丝分裂过程中细胞膜的消失而扩散到细胞质中。

本发明具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针的用途，是在生物活体内生殖腺细胞dna和rna的定位过程中作为检测试剂使用。所述氧化石墨烯探针能够穿过层层的生物膜屏障，对生物活体内生殖腺细胞dna和rna进行成像分析。

所述生物活体为活的秀丽隐杆线虫成虫。

本发明中，通过带正电阳离子化学物的修饰，使氧化石墨烯探针的表面电位达到20mv以上。其荧光发射光谱随着激发波长增加红移。

本发明氧化石墨烯探针能够有效穿过细胞膜和细胞核膜，对细胞内dna和rna同步成像。本发明氧化石墨烯探针与双链dna和单链rna具有不同的结合方式，结合后分别发射出绿色和红色荧光。

本发明氧化石墨烯探针能够穿过层层的生物膜屏障，对线虫等生物活体内的dna和rna进行成像。

本发明提出了一种阳离子表面修饰策略，在氧化石墨烯的表面修饰带正电的羧丁基三苯基溴化膦，成功实现了氧化石墨烯表面电荷从负到正的转变。和目前常用的通过氨基电离形成带正电离子相比，这种直接带电离子不受环境酸碱度影响，而且与带负电的dna和rna具有更高的亲和能力。与目前的核酸检测探针相比，该探针能够穿透细胞膜及细胞核膜，对细胞内的dna和rna进行成像。而且由于探针与双链dna和单链rna的结合方式不同，导致其与dna和rna结合后分别发出绿色和红色的荧光，成功实现了细胞内dna和rna的同步区分成像。目前，这种用单一探针能同步检测细胞内dna和rna，并且能够穿透层层的生物膜屏障实现对活的生物体内dna和rna的氧化石墨烯探针还未见报道。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明所用氧化石墨烯是通过硝酸氧化剥离30nm的导电炭黑颗粒得来，所得氧化石墨烯无需超声等处理，就具有几个纳米的均一尺寸，这种小尺寸有利于其穿透细胞核膜。

2、本发明氧化石墨烯探针所带正电荷来自于修饰的正电阳离子化合物，与目前常用的依靠氨基电离而生成正电荷的方法比，我们的方法合成的探针不受外界酸碱环境的影响，探针与核酸的亲和力更强，更易于穿透层层的生物膜结构。

3、本发明氧化石墨烯探针与dna和rna的结合方式不同，引发不同的荧光，可以同步检测细胞及生物体内的dna和rna。相对于目前通过多种染料分步染色或者多种染料的混合液来同步染色相比，我们的探针使用方法简单，检测结果可靠，能有效避免多种探针生物分布不一致带来的问题。

4、本发明氧化石墨烯探针，与目前的商用染料探针相比，具有强的光稳定性和低的细胞毒性，能够对细胞及生物活体进行长时程的原位成像检测，能够观察活细胞内dna与rna的动态变化，而且可以用于超高分辨(sted)显微镜的3d成像。

附图说明

图1本发明所得高效膜穿透氧化石墨烯探针的结构示意图，表面电势变化图及透射电镜图。从图中可以看出，原始的氧化石墨烯含有羧基，其表面电势为-10mv左右，当修饰上对苯二胺后其电势转为正的7mv，当进一步偶联上阳离子化合物4羧丁基三苯基溴化膦后，氧化石墨烯的表面电势达到正的20mv。表面电势的演变充分说明了氧化石墨烯表面修饰基团对表面电势的决定作用。从透射电镜图可以看出，该氧化石墨烯探针具有均一的尺寸，其平均粒径为2-3nm。

图2本发明所得高效膜穿透氧化石墨烯探针的荧光发射光谱及对双链dna和单链rna响应的荧光光谱。

图3本发明所得高效膜穿透氧化石墨烯探针对不同细胞系细胞核dna的成像。

图4本发明所得高效膜穿透氧化石墨烯探针与细胞内dna和rna的作用方式示意图及其对活细胞内dna和rna的同步成像。

图5本发明所得高效膜穿透氧化石墨烯探针对细胞有丝分裂不同时期dna和rna的成像分析。

图6本发明所得高效膜穿透氧化石墨烯探针对活细胞有丝分裂前期染色体的3d超高分辨(sted)成像和对核仁的3dsted成像。

图7本发明所得高效膜穿透氧化石墨烯探针对活的线虫生殖腺细胞内dna和rna的同步成像。

具体实施方式

下述实施例是对发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以而且应当知晓任何基于发明实质精神的简单转化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。

实施例1：

1、0.2g的导电炭黑(vxc-72)加入到100ml圆底烧瓶中，搅拌下加入50ml6m的硝酸，回流反应24小时，冷却到室温，离心，保留红棕色的上清液；将上清液在180℃下蒸馏，得到红棕色固体，并进一步放入真空烘箱中干燥。

2、向步骤1干燥后的固体中加入10ml氯化亚砜，搅拌溶解，再滴加100μl无水dmf，80℃回流反应12h，蒸馏除去过量的氯化亚砜；然后加入20mg对苯二胺，2ml无水四氢呋喃做溶剂，60℃下搅拌反应72小时，冷却至室温，所得固体用二氯甲烷：甲醇＝10：1(v/v)做洗脱剂，进行纯化，纯化的固体于真空烘箱中干燥，备用。

3、4-羧丁基三苯基溴化膦20mg，加10ml氯化亚砜，搅拌溶解，再滴加100μl无水dmf，80℃回流反应12h，蒸馏除去过量的氯化亚砜；将活化过的酰氯化4-羧丁基三苯基溴化膦加入到步骤2中纯化干燥的固体中，加2ml无水四氢呋喃做溶剂，60℃下搅拌反应72小时，冷却至室温；所得固体加入20ml乙醇，超声溶解，然后旋蒸，所得固体用超纯水溶解，即得到具有高效生物膜穿透能力的氧化石墨烯探针。

实施例2：不同种类细胞的细胞核dna成像检测。

结合图3，将氧化石墨烯探针用于细胞核内dna的成像检测。细胞种在共聚焦培养皿上，培养24小时，然后将探针加入到培养基中，混匀，探针终浓度为30μg/ml，在细胞培养箱中与细胞共培养2小时，然后利用激光共聚焦显微镜进行荧光成像。在488nm激发下，发现包括肿瘤细胞及正常细胞在内的12种细胞的细胞核都发出强的绿色荧光，而细胞质几乎没有绿色荧光，这显示了氧化石墨烯探针能够穿透细胞膜、细胞核膜，然后与细胞核内的dna结合，在488nm激发下发出绿色荧光。

实施例3：对活细胞内dna和rna的同步成像检测。

结合图2和图4，由于氧化石墨烯探针与dna和rna的结合方式不同，从而引发不同的荧光光谱响应。对于双链dna，氧化石墨烯探针嵌入到dna的沟槽中，引起荧光的增强；而对于单链rna，由于其没有dna那样的规则双螺旋结构，其表面负电荷引起氧化石墨烯探针的聚集团聚，产生红色的荧光。因此，我们将探针与细胞共培养后，分别用488nm和543nm激发光对细胞进行共聚焦成像，结果如图4所示，488nm激发的绿色荧光主要集中在细胞核，而543nm激发的红色荧光主要集中在细胞质及核仁。所以，通过氧化石墨烯探针实现了对活细胞内dna和rna的同步检测。

实施例4：对细胞有丝分裂不同时期dna和rna的动态成像。

结合图5，不同分裂期的细胞同步化，利用饥饿法来获取。取处于对数生长期的细胞，pbs缓冲液清洗后，用含1％血清的培养基继续培养过夜，然后除去就培养基加入含10％血清的培养基继续培养，培养不同的时间来获取处于有丝分裂不同时期的细胞。然后加入氧化石墨烯探针，分别在488nm和543nm激光下，观察有丝分裂不同时期dna和rna的结构变化。从图5中可以发现，细胞有丝分裂过程中，细胞膜消失，染色质高度螺旋化形成染色体，在488nm激发下，染色体仍然显示很强的绿色荧光，说明氧化石墨烯探针仍然与染色体结合在一起，没有因为核膜的消失而释放到细胞质中，证明了探针与dna间强的亲和力。随着有丝分裂的完成，探针也被均匀的分散到两个子细胞中去。同时，在543nm激发下，细胞质内的rna呈现强的红色荧光，核仁在有丝分裂过程中消失，随着分裂的完成，在两个新的子细胞中，核仁又重新出现。

实施例5：线虫生殖腺细胞dna和rna的原位同步成像检测。

野生型线虫bristoln2按照标准程序进行培养，即在20℃条件下，将线虫培养在线虫生长培养基琼脂板上，以op50大肠杆菌为食物。取成虫期的线虫，用超纯水将线虫成虫从琼脂板上冲洗下来，然后转移到含有氧化石墨烯探针的m9缓冲液中培养4小时，然后将线虫吸取出来滴在载玻片上，用nan3溶液进行麻醉，然后盖上盖玻片，进行共聚焦成像。激发波长分别为488nm和543nm，结果如图7所示。