一种磁性二氧化硅及其制备方法和在低丰度蛋白富集中的应用与流程

本发明涉及磁性纳米二氧化硅材料，具体涉及一种磁性纳米二氧化硅及其制备方法和在低丰度蛋白富集中的应用。

背景技术：

1、蛋白质组学(proteomics)，是以蛋白质组为研究对象，从整体水平上研究蛋白质组成及其变化规律的科学，由此获得蛋白质水平上的关于细胞活动、疾病发生等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学研究不仅能系统地揭示生命活动规律，而且能有效阐明疾病发生发展的分子机制和调控网络。基于液相色谱–串联质谱(lc-ms/ms)技术的鸟枪法蛋白质组学(shotgun proteomics)策略为复杂生物样品蛋白质组水平鉴定和定量提供了强有力的技术支撑。

2、然而对于一些动态分布范围宽的样本如血清、血浆、尿液、乳汁、脑脊液、唾液、细胞上清液等，基于lc-ms/ms的蛋白质组学研究受到了极大的限制。以血清或血浆为例，血清/血浆的动态范围分布极宽，估计有12-13个数量级，大约有22种蛋白质的浓度高达mg/ml，占总蛋白质的99％。而其他的数以千计的人们感兴趣的蛋白质，如组织泄漏蛋白和信号因子，在血浆中的浓度低至ng/ml甚至pg/ml。高丰度的功能蛋白造成的压倒性"掩盖"效应使得有价值的低丰度蛋白的检测非常困难，即使是使用最先进的质谱技术。

3、为了提高低丰度蛋白的检出覆盖度，基于免疫亲和力的高丰度蛋白的去除和肽段水平的组分分馏被开发出来。这些方法能够将血浆蛋白的鉴定数提高到500-800，但去除高丰度蛋白的过程中也会去除一些与高丰度蛋白互作的低丰度蛋白，导致重要的低丰度蛋白信息的损失。此外，该类方法的检测周期长，成本高，通量低；不适用于大规模的队列样本处理。更重要的是，基于抗体的高丰度蛋白去除方法只能针对特定样本类型进行特定蛋白的去除。非血液类样本，如脑脊液、尿液、乳汁、唾液、细胞上清液等样本，其高丰度蛋白种类与血清/血浆样本相差较大甚至完全不同，无法基于以上方法实现高丰度蛋白的去除。因此，迫切需要开发一种不受样本类型限制的、低成本、高通量并且易于操作的新方法，实现低丰度蛋白的快速和高效的富集，从而提高蛋白质的鉴定数。

技术实现思路

1、发明目的：本发明针对现有低丰度蛋白富集技术存在的问题，提出了一种磁性二氧化硅及其制备方法和在低丰度蛋白富集中的应用。本发明利用二氧化硅比表面积大、富含硅羟基的特点，通过其与蛋白质之间的静电作用、氢键作用、以及范德华力等实现各种样本类型中的低丰度蛋白质的富集；本发明所提出的磁性二氧化硅的制备方法，在保证二氧化硅表面性质不被破坏，二氧化硅的蛋白吸附性能没有下降的同时，又赋予其磁性；为大规模的样本处理提供了一种更加简单、快速、高效的技术方法，后期可实现高通量自动化生产。此外，该方法应用范围广泛，突破了基于免疫亲和力的高丰度蛋白去除方法的样本类型限制和蛋白质种类限制。

2、技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种磁性纳米二氧化硅的制备方法，包括以下步骤：

4、1)将fe3o4加入柠檬酸钠溶液中，反应，分离，干燥，得到柠檬酸钠改性的fe3o4；

5、2)取柠檬酸钠改性的fe3o4加入到去离子水中分散均匀，之后加入表面活性剂；

6、3)向2)中加入碱源，边加热边搅拌，之后缓慢滴加硅源，并持续边加热边搅拌，

7、直至液体完全挥干，分离，洗涤，干燥，得到所述磁性纳米二氧化硅材料。

8、优选的，步骤1)中所述fe3o4的颗粒尺寸为10～500nm，更优选为20nm；柠檬酸钠溶液浓度为0.01mol/l～1mol/l；fe3o4和柠檬酸钠的质量比为：1：1～100；所述反应的温度和时间为：40～100℃，0.5h～6h；更优选为80℃，1.5h。

9、优选的，步骤2)中所述的所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵等中的一种或多种；所述的柠檬酸钠改性的fe3o4、去离子水、表面活性剂的质量比为：1:2～5000:0.5～50。

10、优选的，步骤3)中所述的碱源为：氨水、四丙基氢氧化铵等中的一种或多种；所述硅源为：硅溶胶、硅藻土、硅酸四乙酯、硅酸乙酯、水玻璃等中的一种或多种；以fe3o4的用量为对比，所述碱源和硅源的加入质量比为fe3o4：碱源：硅源为：1:1～500:1～500；所述的边加热边搅拌的温度为40～100℃；

11、本发明提供了一种磁性纳米二氧化硅材料，由上述制备方法制得。所述的磁性纳米二氧化硅材料为fe3o4型二氧化硅，fe3o4被二氧化硅外壳所包覆。

12、本发明还提供了所述的磁性纳米二氧化硅在低丰度蛋白富集中的应用。

13、本发明最后提供了利用所述的磁性纳米二氧化硅富集低丰度蛋白的方法，包括以下步骤：

14、1)向待测样本中加入结合缓冲液和磁性纳米二氧化硅，得到混悬液；

15、2)将所述混悬液震荡孵育后，进行磁分离，去除上清液并保留沉淀；

16、3)加入清洗缓冲液洗涤沉淀，所得沉淀即为磁性纳米二氧化硅及其所富集的低丰度蛋白的混合物；

17、4)采用质谱、ihc、elisa、western blot或化学发光对目标蛋白质组或目标蛋白进行检测。

18、优选的，步骤1)中，所述的磁性纳米二氧化硅和待测样本的加入量的对应关系为：1mg:5μl～10ml。

19、优选的，步骤1)中，所述的待测样本类型选自血液、尿液、脑脊液、唾液、乳液、蛋清或细胞上清液等。

20、优选的，步骤1)中，所述结合缓冲液的成分包括tris、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸钾、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、氯化钾、氯化钠、柠檬酸、柠檬酸钠、巴比妥酸、巴比妥钠、氢氧化钠、盐酸、甲酸、乙酸、edta、sds、np-40、chaps、吐温、triton、peg、乙腈、甲醇的中的一种或任意组合，优选为tris、edta的组合缓冲液。

21、优选的，步骤2)中，所述震荡孵育的条件为：18～37℃，500～2000rpm，孵育1～120min；置于磁力架上进行磁分离，放置时间为1～5min；

22、优选的，步骤3)中，所述清洗缓冲液选自步骤1)所使用的结合缓冲液或相应稀释液；所述洗涤沉淀的次数为3次，过程为：加入清洗缓冲液，室温震荡3min，将样本置于磁力架上磁分离2min后，弃上清，保留沉淀；重复以上过程3次。

23、优选的，步骤4)中，对目标蛋白检测的手段包括：质谱、ihc、elisa、western blot、化学发光中的一种或几种，优选质谱。

24、有益效果：

25、1.本发明所提出的磁性二氧化硅的制备方法，在保证二氧化硅表面性质不被破坏，二氧化硅的蛋白吸附性能没有下降的同时，赋予其磁性。

26、2.本发明为大规模的样本处理提供了一种更加简单、快速、高效的技术方法。非磁性材料需要高速离心才能实现固液分离，耗时又耗力；而磁分离仅需数秒即可完成，极大优化了样本的处理流程。

27、3.该方法应用范围广泛，适用于血液、尿液、脑脊液、唾液、乳液、蛋清、细胞上清液等多种含有高丰度蛋白的样本；突破了基于免疫亲和力的高丰度蛋白去除方法的样本类型限制和蛋白质种类限制。

28、4.基于磁性纳米二氧化硅的低丰度蛋白的富集，仅需孵育-洗涤2个步骤就可完成样本中低丰度蛋白的富集，与传统的基于免疫亲和力的高丰度蛋白的去除和组分分馏相比，显著减少了样本的处理步骤和操作时长。

29、5.与未经处理直接进行质谱检测的结果对比，经磁性纳米二氧化硅富集后的样本，其蛋白鉴定数可提高100％-700％，有效避免了质谱检测时高丰度蛋白对低丰度蛋白鉴定的干扰。