4) 实验设4个处理，每个处理重复3次，小区面积为6m2 (3mX 2m)，各处理采用随机 区组排列，实验设一个胁迫程度，实验期间实验小区维持重度胁迫（409^20% FC)，实验设计 如下： 1) 加入1L空白培养基 2) 加入8g纳米堆肥并加入1L空白培养基 3) 加入8g纳米堆肥并加入1L稀释100倍的复合微生物菌剂 4) 加入8g纳米堆肥并加入1L稀释4倍的复合微生物菌剂 (5) 处理后，于2014年4-11月-进行株高测定，每次采取随机取样的方式进行测定。
[0012] 其中：？￡66000的浓度分别为5%、10%、15%、20%和25%。每增加一次？￡66000的浓 度，要待菌体增长量稳定后，才能继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌 群。所用材料： 选取籽粒饱满、大小均勾的多年生高羊茅aryflt/iaacea Z.)种子为试验材 料； 生活垃圾堆肥来自天津市小淀堆肥厂，基本理化性质为：pH 7. 62,饱和含水量0.76 ml/g，容重 0? 85 g/ml，全氮 5. 18%，全钾 50. 83 g/kg，有效磷 77. 92 mg/kg，有机质 12. 12%， 将垃圾堆肥去除其中的木头、塑料、金属等杂物，风干后备用； 土壤基质剔除杂物，过2mm筛，放置于通风口处2-3d，自然条件下风干，其理化性质为： pH 7. 44,饱和含水量0. 58mL /g，有机质4. 68%，全氮0. 21%，有效磷22. 03 mg /kg，全钾 45. 61g /kg〇
[0013] 本发明进一步公开了采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高田间草皮生产抗旱性 的方法在提升草皮绿度后期效果方面的应用。特别是在延长草皮绿期、提前返青时间、提高 返青率方面的应用。
[0014] 本发明更加详细的制备方法如下： 1研制材料与方法 1.1实验材料 实验田设在天津北辰红港绿茵花草技术中心院内，地处N 39。23'，E 117。21'，海 拔5m，年平均气温12. 1°C，最低气温_10°C，最高气温31. 2°C。试验田基本理化性质为：pH 7. 7,含盐量0. 3%，全氮0. 32%，全钾43. 27 g/kg，有效磷22. 41mg/kg，有机质4. 83%，供试草 坪由草地早熟禾和多年生黑麦草按质量比9:1比例混播，建植6年。
[0015] 生活垃圾堆肥来自天津市小淀堆肥厂，基本理化性质为：pH 7. 62,饱和含水量 0.76 1111/^，容重0.85 8/1111，全氮5.18%，全钾 50.83 8/1^，有效磷 77.92 11^/1^，有机质 12. 12%，将垃圾堆肥去除其中的木头、塑料、金属等杂物，风干后备用。
[0016] 1. 2实验区水分控制与管理 2014年降水量293. 8mm，多集中在7 ~ 9月，实验田处理初期含水量为15-20%，处理后 基本无水分灌溉，全年靠天然降水，但冬春几乎无降水，维持在重度水分胁迫状态。
[0017] 1.3纳米堆肥的制备 将垃圾堆肥l〇5°C烘干至恒重，由秦皇岛市太极环纳米制品有限公司，利用改进的高能 球磨技术，通过罐体快速的多维摆动式运动，将垃圾堆肥加工研磨制成纳米堆肥，备用。在 电镜下通过粒径分析，纳米堆肥粒径大小分布均匀，平均粒径在30nm左右。
[0018] 1.4耐旱微生物菌剂的制备 1.4. 1菌种的富集 将堆肥样品称取l〇g置于无菌锥形瓶中，加入lOOmL无菌水振荡均勾后，取10mL悬浮 液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28°C，220r/min下振荡培养3d，即为混合微生 物菌群。
[0019] 1. 4. 2耐旱微生物的强化 混合微生物菌群耐旱强化采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法。未经过强化的混合 菌群一般在无PEG6000的条件下生长较好，在强化过程中，视00_增长而逐步提高PEG6000 浓度，PEG6000的浓度以5%的梯度增加，最终目标是25% ;即在本实验中PEG6000的浓度分 别为5%、10%、15%、20%和25%。每增加一次PEG6000的浓度，要待菌体增长量稳定后，才能继 续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群。
[0020] 1. 4. 3强化耐旱微生物的分离及纯化 1. 4. 3. 1稀释涂布平板法 1)倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁氏（PDA)琼脂培养 基高温灭菌，冷却至55-60°C时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液(最终质量浓度为 0.3%)，混均匀后分别倒平板。
[0021] 2)制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛 有9ml无菌水的大试管中充分混勾，此为KT 1稀释液，以此类推制成10'10'10'101口 1〇_6几种浓度的稀释液。
[0022] 3)涂布：用移液枪分别吸取0. 2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平 板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次。用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
[0023] 4)培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37°C培养箱中培养，将含高氏I号培养基和马 丁氏培养基（PDA)的平板倒置于28°C培养箱中培养3-5 d。
[0024] 1. 4. 3. 2平板划线分离法 挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划 线纯化。直到培养基上长出来的是纯种，如不纯，仍需重复该步骤，最后得到3个菌种。
[0025] 1.4. 4强化耐旱微生物的鉴定 按照试剂盒的操作手册提取优势菌种的DNA。优势细菌的PCR体系：10XBuffer(with MgCl2)2 乩，dNTP (10mmol/L)0.4ML，341f (l〇Mmol/L)ll^L，534r (10Mmol/L)lML，Taq酶（5u/ML)0.4ML，模板DNA1ML，加超纯水定容至终体积20ML。PCR反应条件：94°C 5min 预变性，94°〇变性11^11，551：复性458,721：延伸458,30个循环，721：延伸10111111。引物为 34If (5r -CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3')和534r (5' -AIT ACC GCG GCT GCT GG-3')。优势真菌的PCR反应体系： lOXBuffer (without MgCl2)2 ML，MgCl2(25mmol/L)1.6ML，dNTP(10mmol/L)0.4ML，Geoll (lOMmol/L) 0? 4ML，GeoA2 (lOMmol/L) 0? 4ML，Taq酶（5u/ML) 0? 2ML，模板DNA 1ML，加超纯 水定容至终体积20ML。PCR反应条件：94°C 4min预变性，94°C变性lmin，54°C复性lmin， 72°C延伸2min，30个循环，72°C延伸7min。引物为GeoA2(5'-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3')和Geoll (5' -ACC ITG TTA CTT TTA CTT CC-3'）。将得到的PCR产物送到 北京华大基因测序部，根据测序的结果，在BLAST系统中找出对应菌种。
[0026] 将分离出的菌种通过对其菌落形态观察，结合分子鉴定结果（PCR序列相似度）比 较，鉴定出分别为：蜡样芽孢杆菌、粘红酵母和赖氨酸芽孢杆菌。
[0027] 表1强化耐旱微生物鉴定结果
【主权项】
1. 一种采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高田间草皮生产抗旱性的方法，其特征在于 按如下的步骤进行 (1) 以灭菌后的土壤为基质进行草坪植物栽培试验，纳米堆肥采用混施的方式施入土 壤基质，实验时基质用量为9400gnT2,草皮基质厚度为15 mm，高羊茅草种播种量为160gnT2， 将种子浸泡24h后均匀播洒于基质表层，首先进行黑暗处理，萌发后植株生长初期，每天统 一定量给水，以保持培养基质水分状况良好，然后加入30-35nm纳米堆肥8g并加入IL稀 释100倍的强化耐旱菌剂；或加入30-35nm纳米堆肥Sg并加入IL稀释4倍的强化耐旱菌 剂；所述的强化耐旱菌剂采用的是逐步增加PEG6000浓度的方法，PEG6000的浓度以5%的 梯度增加，最终目标是25% ;所述的菌剂指的是：蜡样芽孢杆菌，赖氨酸芽孢杆菌和粘红酵 母按体积比1: 1:1的配制； (2) 处理后，于2014年4-11月进行株高测定，每次采取随机取样的方式进行测定。
2. 权利要求1所述采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高田间草皮生产抗旱性的方法， 其中： (1) 纳米堆肥的制备：将生活垃圾堆肥105°C烘干至恒重，将垃圾堆肥加工研磨制成 3〇-35nm纳米堆肥，备用； (2) 实验设4个处理，每个处理重复3次，小区面积为6m2 (3mX2m)，各处理采用随机 区组排列，实验设一个胁迫程度，实验期间实验小区维持重度胁迫（409^20%FC)，实验设计 如下： 1) 加入IL空白培养基 2) 加入8g纳米堆肥并加入IL空白培养基 3) 加入8g纳米堆肥并加入IL稀释100倍的复合微生物菌剂 4) 加入8g纳米堆肥并加入IL稀释4倍的复合微生物菌剂 (5)处理后，于2014年4-11月进行株高测定，每次采取随机取样的方式进行测定。
3. 权利要求1所述采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高田间草皮生产抗旱性的方法， 其中：PEG6000的浓度分别为5%、10%、15%、20%和25%，每增加一次PEG6000的浓度，要待菌 体增长量稳定后，才能继续增加PEG6000的浓度，逐级强化出耐旱混合微生物菌群。
4. 权利要求1所述采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高田间草皮生产抗旱性的方法 在提升草皮绿度后期效果方面的应用。
5. 权利要求1所述采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高田间草皮生产抗旱性的方法 在延长草皮绿期、提前返青时间、提高返青率方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种采用耐旱强化活性纳米垃圾堆肥提高田间草皮生产抗旱性的方法。它是从生活垃圾堆肥中通过分离提取出合适的有益微生物菌株，通过耐旱强化获得更为高效的微生物菌剂，将其与纳米堆肥联合施用于草坪基质，研究其对干旱胁迫下草坪植物的耐旱性，为纳米堆肥联合微生物菌剂在草坪草抗旱性方面的应用提供依据。实验结果表明：在干旱胁迫下，纳米堆肥联合微生物有助于高羊茅的生长，提高叶片保护酶活性，增强植株对干旱胁迫的适应能力，中度胁迫和重度胁迫时，节水率分别为43.10%和52.39%。
【IPC分类】C05G3-00
【公开号】CN104844345
【申请号】CN201510186487
【发明人】多立安, 赵树兰, 刘春湘
【申请人】天津师范大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月20日