牛樟芝富萜菌丝体培养基及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种一种牛樟芝富萜菌丝体培养基及应用，属于生物科技领域。
【背景技术】
[0002] 真菌是世界第二大类生物，主要分成微生物和大型真菌(食、药用菌）两 类。牛樟芝（如troi/ia ci/Mamwea)是我国台湾特有的珍稀药用菌品种，属担子菌门 (Basidiomycota)、多孔菌目（Polyporales)、白肉迷孔菌科（Fomitopsidaceae)、薄孔菌属 (Awiroi/ia)，最早发现生长在腐烂空心的牛樟树（々aweAirai)内壁，早期牛樟 树被认为是牛樟芝的唯一宿主。牛樟芝味苦，研究证实含有大量的三萜类、酚类、多糖类等 物质，可用于治疗抗过敏、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤、保肝、提高免疫力等具有显著功效。因 此，牛樟芝在市场价格极高且供不应求。
[0003] 为解决市场上牛樟芝子实体价格昂贵、供不应求的现状，本发明以葡萄糖、麦芽 糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04、Vbi、菌草灵芝水提物、菌草灵芝醇提取物和菌草灵芝菌糟水提取 物为筛选因素，优选出能显著提高牛樟芝菌丝体三萜含量的培养基配方及应用。
【发明内容】
[0004] 为了进一步提高牛樟芝菌丝体产生三萜类化合物的能力，本发明提供一种能进一 步促进牛樟芝菌丝体中三萜类化合物合成的培养基配方及其应用。
[0005] 牛樟芝富萜菌丝体培养基，所述培养基配方为：葡萄糖10-11 g吨\麦芽糖42-43 g .L \ 蛋白胨 15-16 S^lAMgSO4 1-1.5 g *L ^KH2PO4 0.5-1 g .L \ 灵芝水提取物 0.5-1 g · L、
[0006] 其培养方法为接种量为3%，在28°C，120 rpm，黑暗培养15天左右。
[0007] 所述培养基配方为：葡萄糖10 .32g·!/，麦芽糖42. 58 g^L1，蛋白胨15. 37 g · L \ MgSO4 1. 12 g · L 丄，KH2PO4 0· 63 g · L \ 灵芝水提取物 0· 55 g · L 工。
[0008] 牛樟芝菌丝体三砲提取方法，其特征在于：所述方法为：取粉碎均勾的牛樟芝菌 丝体适量，以80%乙醇作为提取溶剂，料液比1 : 40 (w/v)，70 °C水浴中超声I h，倒入提 取液，重复上述操作一次，合并提取液并过滤，浓缩，离心后取上清液定容到50 mL ;取0. 5 mL加入到刻度试管中，置于50-60 °C水浴中挥发溶剂，加入0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶 液和I mL的高氯酸，60 °C水浴反应20 min，冰水冷却后加入10 mL冰醋酸，摇匀后，以空白 为对照，于540 nm处扫测定吸光值，利用标准品齐墩果酸制作得出的回归方程计算三萜含 量。
[0009] 牛樟芝菌丝体培养基在牛樟芝菌丝体培养中的应用。
[0010] 本发明解决的技术问题所采用的技术方案是： 1牛樟芝菌丝体培养及三萜含量测定 牛樟芝菌丝体培养条件为28°C，黑暗培养15-28天，收集菌丝体在55°C条件下干燥至 恒重，干燥后的菌丝体利用香草醛-冰醋酸法测定其三萜含量。
[0011] 2 Placket-Burman 设计 Plackett-Burman (PB)设计是一种筛选针对多变量中关键因素的有效方法。实验采 用11个Plackett-Burman设计，通过大量文献信息，在前期实验基础上选取评估9个因素 对樟芝液体培养菌丝体中三萜含量的差异。每个因素设定2个水平：-1代表低水平，+1代 表高水平(表1)。不同因素的水平值根据前人实验结果设定，利用Design Expert 8. 0. 6软 件对结果进行分析，筛选出显著影响牛樟芝液体培养菌丝体三萜类化合物含量的因素。
[0012] 表1 Plackett-Burman design 水平及影响因素 （g · L 3
PB设计的结果表明牛樟芝菌丝体三萜含量从15. 36-47. 3 mg ^g1 (表2)，其中A-葡 萄糖、B-麦芽糖、D-蛋白胨，E-KH2PO4, H- MgSOjP K-菌草灵芝水提取物对樟芝菌丝体三萜 含量具有显著的促进作用；而A-葡萄糖对菌丝体三萜含量生长具有负相关的作用。分析结 果表明，A-葡萄糖、B-麦芽糖、D-蛋白胨，E-KH2PO4, H-MgSOjP K-菌草灵芝水提取物在模 型中的重要性高达95%以上，可以被认为是能显著影响牛樟芝菌丝体三萜含量的主要因素 (表3)，可进行下一步实验。
[0013] 表3 PB设计变量影响因素及结果分析
3最陡爬坡实验 最陡爬坡试验以Plackett-Burman试验值的变化方向为爬坡方向，根据PB试验结果对 各因素的效应值确定变化步长(表4)，最快的逼近最佳值范围，以菌丝体生物量含量为考察 对象，筛选最高的处理并设置为下一步响应面分析的中心点。
[0014] 表4最陡爬坡实验设计及结果（g · L 3
表4结果表明，当葡萄糖为20 g.L1，麦芽糖40 g.L1，蛋白胨20 g· IAkh2PO4S 0.8 g.L1，MgSO4S 0.8 g*L \菌草灵芝水提取物为0.75 g.L1的时候，菌丝体三萜含量 最高，因此，将此作为响应面实验的中心点进行实验设计。
[0015] 4响应面实验设计 根据以上的实验结果，按Box-Behnken进行响应面设计(表5)，并将结果进行ANOVA分 析(表6)。结果表明该模型具有显著性（p〈0. 05)，F值为2. 16,与本实验数据表现出良好的 相关性。检查符合效率的模型的相关系数（R2=O. 5866)和调整确定系数的（Adj R2=O. 3153)， 表明方程拟合性较好。C.V.值表示实验的精确度，C.V.值越高，实验的可靠性越低，本研究 中C. V. =6. 84%，说明实验操作可信。因此，该模型可以作为评估的趋势预测生物量的影响。 从表中可以看出，线性系数（X3，X6)，交叉系数（X1X4,X 1X6)具有显著差异（P〈〇. 05)，而其他则 无显著差异（P>〇. 05)。在本研究中，影响菌丝生物量因素的顺序为：灵芝水提取物〉蛋白胨 >麦芽糖〉葡萄糖〉MgS04> KH2PO4。数据结果（Y)和RSM实验的矩阵来确定6个变量的 影响，包括葡萄糖（X1)、麦芽糖（X2)、蛋白胨（X3)、MgSO 4 (X4)、KH2PO4 (X5)、JCGLWE (X6)适 合下列二阶多项式方程（Eq. 1): 、 、、ν 、、说 ^ \, s'-\\ 、$、\ \ >.·. .V. '? V-. ·?*... .V . .1V V 叫、、- HX A、、Χ' (Eq.l)
通过对培养条件的优化得出液体发酵牛樟芝菌丝体三萜培养基条件为：葡萄糖10. 32 g.L1，麦芽糖 42.58 g.L1，蛋白胨 15.37 S^lAMgSO4 1.12 8·?ΛΚΗ2Ρ04 0 . 63 g.L1， 灵芝水提取物0. 5 g · L 1时，牛樟芝菌丝体三砲含量可高达36. 84 mg/g。通过验证实验， 液体发酵生产牛樟芝菌丝体三萜产量实际值为36. 84±0. 103 mg · g 1 (n=3)，实际值与预 测值结果一致，远高出对照组(葡萄糖25 g · L \蛋白胨5 g · L \麦芽糖3 g · L 3所产牛 樟芝菌丝体三萜含量为28. 47 mg · g \因此，该模型具有较好的预测性，能作为提升牛樟芝 菌丝体三萜含量液体发酵培养基优化的理论基础。
[0016] 本发明的效益：通过对若干因素的筛选和组合，选择对牛樟芝菌丝体三萜含量影 响较大的因素为葡萄糖、蛋白胨、麦芽糖、MgS04、KH2POjP灵芝水提取物，其培养基配方为葡 萄糖 10-11 g · L \ 麦芽糖 42-43 g · L \ 蛋白胨 15-16 g · L \ MgSO4 1-1. 5 g · L \ KH2PO40. 5-1 g · L \灵芝水提取物0. 5-1 g · L 1时，仅通过培养基配方的调整能使牛樟芝菌丝体 生产大量三萜类物质，提升产品品质，在工业化生产应用中可以获得最大量的牛樟芝菌丝 体的三萜类物质。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1 本实施例的牛樟芝菌丝体培养基按以下比例制备：葡萄糖10 g，麦芽糖4.2 g，蛋白胨 15 g，MgSO4Ig, KH2PO4 0.6 g，灵芝水提取物0.5 g定容于1000 mL水中，调节pH值为5. 5， 每100 mL分装至250 mL三角瓶中，在121°C灭菌20 min，冷却后备用。
[0018] 培养方法：在28°C，120 rpm，黑暗培养15天。
[0019] 经测量，其菌丝三萜含量为35. 67 mg · g 1O
[0020] 实施例2 本实施例的牛樟芝菌丝体培养基按以下比例制备：葡萄糖100 g，麦芽糖42 g，蛋 白胨15 g，MgSO4IOg, KH2PO4 6 g，灵芝水提取物5g定容于10 L水中，调节pH值为5. 5,每 I L分装至三角瓶中，在121°C灭菌20 min，冷却后备用。
[0021] 培养方法：在28°C，120 rpm，黑暗培养15天。
[0022] 经测量，其菌丝三萜含量为38. 98 mg · g 1D
[0023] 实施例3 本实施例的牛樟芝菌丝体培养基按以下比例制备：葡萄糖500 g，麦芽糖210 g，蛋白胨 75 g，MgSO4 50g，KH2PO4 30 g，灵芝水提取物25g定容于50 L水中，调节pH值为5. 5,每5 L分装至小型发酵罐中，在121°C灭菌20 min，接种后内部搅拌通气备用。
[0024] 培养方法：在28°C，120 rpm，培养15天。
[0025] 经测量，其菌丝三萜含量为43. 98 mg · g 1O
[0026] 实施例4 本实施例的牛樟芝菌丝体培养基按以下比例制备：葡萄糖10. 32g，麦芽糖42. 58 g，蛋 白胨 15. 37 g，MgSO4 1. 12 g，KH2PO4 0. 63 g，灵芝水提取物 0. 55 g，定容于 1000 mL 水中，调 节pH值为5. 5,每IOOmL分装至250mL三角瓶中，在121°C灭菌20min，冷却后备用。
[0027] 培养方法：在28°C，120 rpm，培养15天。
[0028] 经测量，其菌丝三萜含量为36. 84 mg · g 1O
[0029] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 牛樟芝富萜菌丝体培养基，其特征在于：所述培养基配方为：葡萄糖10-llg ? L \麦 芽糖 42-43 g ? L \ 蛋白胨 15-16 g ? L \ MgSO4 1-1. 5 g ? L \ KH2PO4 0? 5-1 g ? L \ 灵芝水 提取物 0.5-1 g.L1。2. 根据权利要求1所述的牛樟芝富萜菌丝体培养基，其特征在于：其培养方法为接种 量为3%，在28°C，120 rpm，黑暗培养15天。3. 根据权利要求1所述的牛樟芝富萜菌丝体培养基，其特征在于：所述培养基配方为： 葡萄糖 10. 32g ? L \ 麦芽糖 42. 58 g ? L \ 蛋白胨 15. 37 g ? L \ MgSO4 L 12 g ? L \ KH2PO4 0? 63 g ? L \灵芝水提取物0? 55 g ? L、4. 如权利要求1所述培养基培养的牛樟芝菌丝体三萜提取方法，其特征在于：所述方 法为：取粉碎均匀的牛樟芝菌丝体适量，以80%乙醇作为提取溶剂，料液比1 : 40 (w/v)， 70 °C水浴中超声I h，倒入提取液，重复上述操作一次，合并提取液并过滤，浓缩，离心后取 上清液定容到50 mL ;取0.5 mL加入到刻度试管中，置于50-60 °C水浴中挥发溶剂，加入 0.3 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和I mL的高氯酸，60 °C水浴反应20 min，冰水冷却后加入 10 mL冰醋酸，摇匀后，以空白为对照，于540 nm处扫测定吸光值，利用标准品齐墩果酸制作 得出的回归方程计算三萜含量。5. -种如权利要求1所述的一种牛樟芝富萜菌丝体培养基在牛樟芝菌丝体培养中的 应用。
【专利摘要】本发明提供了一种牛樟芝富萜菌丝体培养基及应用，属于生物科技领域，通过Placket-Burman设计、爬坡实验设计、响应面设计优----化出制备牛樟芝菌丝体的最佳培养基配方：葡萄糖10.32g·L-1，麦芽糖42.58g·L-1，蛋白胨15.37g·L-1，MgSO4？1.12g·L-1，KH2PO4？0.63g·L-1，灵芝水提取物0.55g·L-1，接种量3%，培养15天后，其菌丝体三萜含量达36.84mg·g-1，可为实际工业生产中提升液体培养基中牛樟芝菌丝体三萜含量。
【IPC分类】C05G3/00, A01G1/04
【公开号】CN105001009
【申请号】CN201510493533
【发明人】李晶, 林春梅, 林雄杰, 林占熺
【申请人】福建农林大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年8月13日