专利名称：一种抗植物花叶病毒蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一利蛋白质，特别是一种新的来源于有毒植物种籽的植物花叶病毒抑制蛋白及其制备和应用。
本发明所述的蛋白可被定义为具有抑制植物花叶病毒的活性一抑制烟草花叶病毒(TMV)的活性。
烟草花叶病毒(TMV)引起的烟草花叶病是全世界范围内的烟草主要病虫害，在我国以东北、山东、河南、四川、云南等地受害严重。云南的发病率达20％。烟叶受害后，植株矮小，对产量和品质都有很大的影响(黄遵锡等西南农业学报vol10 No2 94-99,1997)。此外，烟草花叶病毒尚能侵染十字花科蔬菜如黄瓜、大白菜、油菜、蕃茄等，引起退绿、斑驳、甚至心叶畸形等，造成严重危害(盛方镜，陆关成浙江农业大学学报9:39-46,1983)。
对寄主细胞代谢有高度依赖性，对病毒有抑制作用的药物通常也对寄主产生药害(田波等《植物病毒弱毒疫苗》湖北科学出版社P4,1965)，因此，防治植物病毒在药剂筛选方面有较大困难。现已发现蘑菇等担子菌子实体抽出液对烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的侵染有抑制作用(都丸敬一等植物防疫29(1):1,1975)。Norifumi(Norifumi KOBAYASHI et,Agric.Biol.chem.51(31),883-890,1987)在香菇抽提液中分离纯化出植物花叶病毒抑制蛋白；M.M.Smookler(M.M.Smookler,Ann.Appl.Biol.69.157,1971)、J.D.Irvin(J.D.Irvin.Arch.Biochem.Biophics.169,552,1975)、S.Kubo(S.Kubo et,JapanPatent.S60-243100.1985(C.A.105.37465p,1985))和F.Osawa(F.Osawa et,Abstracts of Papers.llth Annual Meeting of thepesticide science Society of Japan.Tsukuba.march.P39 1986)等人分别在藜、美州商陆、紫茉莉、丝兰等植物中也发现了植物病毒抑制蛋白。我们从有毒植物种籽中分离出一种植物花叶病毒抑制蛋白。
本发明目的在于从有毒植物种籽中分离纯化含有较强的抑制烟草花叶病毒的活性的蛋白。
本发明采用简化、温和的分离纯化方法，包括盐溶液粗提、硫酸铵沉淀、G-25凝胶过滤脱盐、CM-纤维素阳离子交换层析和S-200凝胶过滤层析，得到高纯度高活性的豆薯种籽的抗植物花叶病毒蛋白，暂命名为PE4.
PE4的分离纯化流程见附图3，具体操作如下[1]粗提将豆薯种籽100克粉碎，匀浆，用含0.05～0.1M NaCl的PH5.5～6.0,5mM磷酸缓冲液浸泡，4℃过夜。预处理粗提掖用双层滤布去掉粗渣，滤液加硫酸铵至30～80％，经高速离心后，沉淀用少量PH5.5～6.0 5mM磷酸缓冲液溶解后上G-25柱脱盐。上CM-52柱由[2]所得粗提样品上CM-52阳离子交换柱(预先用5～10mM PH5.0～6.0PB平衡)。用平衡缓冲液洗去杂蛋白，用含0～0.3M NaCl的同样PB进行梯度洗脱，收集洗脱峰C1(见附图)。上S-200柱将[3]所得C1峰收集液，经浓缩、透析后，上预先用平衡缓冲液平衡过的S-200柱，并用平衡缓冲液洗脱，收集洗脱峰C1S(见附图)。冻干由[4]所得C1S峰收集液，经充分透析后，冷冻干燥得冻干粉即为豆薯蛋白PE4。
本发明从有毒植物种籽-豆薯种籽中分离纯化出一种植物花叶病毒抑制蛋白PE4，其分子量约为9KD(SDS-PAGE检测)，接种实验表明它具有明显的抑制烟草花叶病毒(TMV)的活性，其平均抑制效率达到49.9％。
本发明的植物花叶病毒抑制蛋白，将通过植物转基因工程，获得具有抵抗植物病毒侵害能力的新的植株，在防治植物病毒侵害方面有实用价值。
本发明的植物花叶病毒抑制蛋白，将可在防治十字花科植物(黄瓜、大白菜、蕃茄等)受烟草花叶病毒侵害方面有使用价值。
本发明与现有技术相比，有以下积极效果1、本发明从有毒植物种籽-豆薯种籽-提取植物花叶病毒抑制蛋白，是新发现，国内外尚未见报道。
2、采用温和的提纯方法，设备简化易操作。
3、豆薯种籽来源丰富，价格便宜。
现对附图作简要说明
图1．豆薯种籽蛋白PE4的分离纯化流程图2．豆薯种籽蛋白PE4的CM-52洗脱图(取Cl峰)；图3．PE4的S-200洗脱图(取C1S峰)；图4．PE4的SDS-PAGE凝胶电泳图；以下结合附图通过实施例进一步描述本发明；实施例1从有毒植物种籽中分离纯化植物花叶病毒抑制蛋白PF41．粗提掖的准备称取100克豆薯种籽，用粉碎机粉碎后，加入一定量的含0.1MNaCl PH6.0 5mM磷酸缓冲液(PB)，用高速自控组织捣碎机(8,000rpm)，捣碎3分钟×2次，再加入同样的缓冲液至总体积800ml，静置24hr后，用双重滤布过滤，即得粗提掖，以上操作均在4℃下进行。
2．硫酸铵沉淀及G-25脱盐粗提液加硫酸铵至30-80％饱和度，静置24hr充分沉淀后高速离心(18,000)，弃去上清液，沉淀用少量PH6.0 5mMPB溶解后上G-25柱脱盐(用PH6.0 5mM PB洗脱)。
3．CM-52纤维素阳离子交换柱层析将2．所得脱盐溶液，用PH6.0 5mM PB透析后，上预先用PH6.05mM PB平衡的CM-52柱(1.5×15cm)，然后用同样PB洗杂蛋白，再用含0～0.3M NaCl的平衡缓冲液进行梯度洗脱，收集洗脱峰C1(见附图1)。
4．S-200凝胶过滤层析将CM-52柱的洗脱峰溶液经过浓缩透析离心使体积达到5～6ml后，上预用含0.15MNaCl PH7.25mM PB平衡的S-200柱(1.5×80cm)，用平衡缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰C1S，即PE4蛋白(见附图2)。经多次透析完全脱盐后，进行冷冻，在FLEXI-DRY真空冷冻干燥仪(FTS Systems Inc.USA)上得到冻干粉(PE4蛋白)。
实施例2植物花叶病毒抑制蛋白PF4的生物性能十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶浓度15％，浓缩胶浓度4％，甲叉丙烯酰胺∶丙烯酰胺摩尔比为1∶30，上下槽缓冲液为Tris-甘氨酸(PH8.3)。电泳前，将含1％SDS的样品溶液在100℃水溶液中加热3min。电泳时恒流30mA，用溴酚兰作指示剂，电泳时间约1hr。电泳结束后，用乙醇∶冰醋酸∶水(体积比5∶1∶4)固定液固定，再用90ml乙醇∶水(体积比1∶1)和10ml冰醋酸的混合液中溶解0.25克考马氏亮兰R250染色液染色4hr，最后用含25％乙醇和8％HAc的脱色液长时间充分脱色，结果与低分子量标准蛋白比较，计算未知蛋白的分子量。其中标准蛋白为∶天花粉蛋白(28KD)，溶菌酶(14.4KD)实施例3 PE4对植物病毒-烟草花叶病毒抑制活性的测定本实验在福建农业大学病毒所完成。除所采用的蛋白干粉样品外，本项实验中所使用的试剂均为分析纯。参照Gianinazzi(Gianinazzi and B.Kassanis,J.Gen.Virol.23.1 1997)等法。采用半叶法接种检测。以具有典型TMV花叶症状的普通烟(nicotiana tobacum)叶片，一1∶15加入蒸馏水研磨，过滤得到病毒溶液。将病毒溶液分别与等体积的20μg/ml PE4蛋白和等体积水溶液混合，接种于TMV的枯斑半叶。4天后计算左右两半叶的枯斑数。
抑制剂的相对抑制率(％)按以下公式计算。
经四次重复实验后的结果表明，PE4蛋白的平均抑制率达到49.9％，显示较强的抗植物病毒活性。
权利要求
1.一种植物花叶病毒抑制蛋白，其特征在于这种蛋白来源于有毒的豆薯种子，其分子量约为9KD、等电点略偏碱性。
2.根据权利要求1行述的植物花叶病毒抑制蛋白，其特征在于它具有较强的抗烟草花叶病毒活性。
3.根据权利要求1所述的植物花叶病毒抑制蛋白，其特征在于该蛋白的分离纯化方法，包括盐溶液粗提、硫酸铵沉淀、CM-52纤维素阳离子交换梯度层析和S-200凝胶过滤层析。
4.根据权利要求1所述的植物花叶病毒抑制蛋白，其特征在于所述的蛋白的应用，在于可防治花叶病毒对十字花科蔬菜的侵染方面具有实用价值。
全文摘要
从豆科植物有毒的豆薯种子中分离纯化一种抗植物花叶病毒蛋白、暂命名为PE4,其分子量明显低于溶菌酶,约为9KD左右(SDS－PAGE检测),等电点略偏碱性。分离纯化该蛋白的手续简化、温和、纯度高。该蛋白具有明显的抗植物病毒－抗烟草花叶病毒－的活性。经四次重复实验,测得其平均抑制率为49.9%。PE4可用于植物基因工程,在防治十字花科蔬菜受烟草花叶病毒侵染方面有较大的应用价值。
文档编号C07K2/00GK1315328SQ0010633
公开日2001年10月3日 申请日期2000年3月28日 优先权日2000年3月28日
发明者蔡建华, 林玉娟, 宋立军 申请人:中国科学院福建物质结构研究所