专利名称：一种人氨基酸转运蛋白、其编码序列、制法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及一种人N系统氨基酸转运蛋白(hNAT-1)的cDNA序列，本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
氨基酸的转运主要由A、ASC、B、GLY、IMINO、L、N、PHE和X等系统完成(physiological reviews Vol.78 No.4 October 1998，pp.969-1054)。
其中，N系统还有三个亚型在肝脏中作用的N型、在骨骼肌中作用的Nm和在神经系统中作用的Nb。所有这些亚型在转运谷氨酸和精氨酸是都表现为钠离子依赖性。肝脏中的N系统转运体蛋白在用锂离子代替钠离子的条件下将会表现出更好的活性(J.Biol.Chem.，Vol.275，Issue 31，23707-23717)。
N系统氨基酸转运体对于尿素循环和肝脏中新合成的谷氨酸输出都有重要作用。这些转运活动可以通过组氨酸阻断。此外，N系统氨基酸转运在脑组织中的研究表明，它可能参与血脑屏障的作用(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.97，Issue 7，3230-3235)。
Gu S等人分离并鉴定了一个编码小鼠膜氨基酸转运体的cDNA。该cDNA推测得到的多肽由505个高度疏水的氨基酸残基组成，所形成的蛋白有9个跨膜结构，将氨基末端置于细胞质中而将羧基末端定位于细胞表面。该转运体主要在肝脏中表达，在肾、脑、心脏中也有表达。在肝脏中，它主要定位在细胞的质膜上，在重要的血管附近表达量较高，然后顺着其通向次要血管的方向逐步递减，这表达谱显示它在肝细胞生理学上可能起到很重要的作用(Proc Natl Acad Sci USA2000 Mar 28；97(7)3230-5)。
Nakanishi T等人从大鼠的脑组织中又克隆出了N系统氨基酸转运蛋白的第二个亚型，并称之为SN2(Am J Physiol Cell Physiol 2001 Dec；281(6)C1757-68)。
然而，到目前为止，本发明的hNAT-1尚未有人报道。
本发明的另一个目的是提供一种蛋白，该蛋白被命名为人氨基酸转运蛋白(hNAT-1)。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的hNAT-1蛋白的方法。
本发明还提供了这种hNAT-1核酸序列和蛋白的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人hNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的hNAT-1蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有hNAT-1蛋白活性的多肽的方法，该方法包括
(a)将编码具有hNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hNAT-1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hNAT-1蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hNAT-1蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hNAT-1蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1516个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于117-1487位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“hNAT-1蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有HNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中117-1487位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框117-1487位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中117-1487位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人HNAT-1相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“hNAT-1蛋白多肽”指具有hNAT-1蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人hNAT-1相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括hNAT-1蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与hNAT-1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗hNAT-1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含hNAT-1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了hNAT-1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有hNAT-1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供hNAT-1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然hNAT-1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括hNAT-1多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内hNAT-1的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有hNAT-1多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码hNAT-1的核酸分子。
本发明还包括检测hNAT-1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于hNAT-1多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对hNAT-1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于hNAT-1基因产物或片段。较佳地，指那些能与hNAT-1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制hNAT-1蛋白的分子，也包括那些并不影响hNAT-1蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的hNAT-1基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的hNAT-1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达hNAT-1或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断hNAT-1功能的抗体以及不影响hNAT-1功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用hNAT-1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与hNAT-1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在本发明中，人hNAT-1的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以人睾丸λgt10cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用两对寡核苷酸为引物A1GTACGGAATG CCGGAAGGGC CGG；B1 C TTCCAGATTT CAAATGTTAC AG为正向引物；A2CACAGTATAT GGGCAATATT GAG；B2 TTCTTGTAAGAAGTAG GAAAATA为反向引物，进行PCR。PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、64℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断，大小分别为约九百和七百个碱基对的片段及杂质。去除杂质，用NcoI分别酶切上述两个片段，然后连接，得到目的片段。将核苷酸序列装入载体，导入宿主细胞。宿主细胞就可表达出相应蛋白，经过分离纯化就将得到本发明的hNAT-1蛋白。
本发明的hNAT-1蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索，结果发现它具有氨基酸转运蛋白的特征序列，而且与其他物种的N系统氨基酸转运体有一定的相似性。
本发明的hNAT-1蛋白与其他物种的N系统氨基酸转运体都有一定的相似性。N系统氨基酸转运体对于尿素循环和肝脏中新合成的谷氨酸输出都有重要作用。这些转运活动可以通过组氨酸阻断。此外，N系统氨基酸转运在脑组织中的研究表明，它可能参与血脑屏障的作用。该类转运体主要在肝脏中表达，在肾、脑、心脏中也有表达。在肝脏中，它定位在重要血管周围肝细胞的细胞膜上，表达量随着血管渐渐分支为小血管而下降，这暗示这类转运体在肝脏中可能有重要的生理作用。
综上所述，本发明的hNAT-1具有氨基酸转运蛋白的特征序列，而且与其他物种的N系统氨基酸转运体有一定的相似性，可对氨基酸的跨膜转运起到调控作用，从而对细胞的营养乃至整个生物体的生理活动，尤其是对肝细胞生理活动起到调控作用。这些生理作用包括激素的分泌，细胞的生长、增殖、分化和凋亡，细胞间的相互作用等等。
将本发明的hNAT-1核酸、其反义链及片段制成探针，可检测hNAT-1基因异常；将hNAT-1蛋白序列制成试剂盒或药物，可调节细胞生长增殖分化，促进组织切除乃至器官摘除后的伤口愈合。将本发明的hNAT-1核酸反义链或hNAT-1抗体制成试剂盒可用于减轻或辅助治疗由于hNAT-1表达量过高而导致的疾病，也可辅助临床上肿瘤和癌症的诊断，预防及治疗。此外，本发明hNAT-1还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，例如可将本发明hNAT-1的N端与鼠TF的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。针对本发明hNAT-1的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
2.PCR产物的测序将上述目的片段与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后获得全长cDNA序列，共1516bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于117-1487位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出hNAT-1的氨基酸序列，共456个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。
实施例2hNAT-1在大肠杆菌中的表达在该实施例中，将编码hNAT-1的cDNA序列，用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得hNAT-1 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’GGAG GGATCCATGG AGGCGTCCTG GGGGA，该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的hNAT-1的部分编码序列；3′端引物序列为5’ATTT CTGCAGTTTA TTAATCCAAT CAAAA，该引物含有PstI限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和hNAT-1的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和PstI消化pQE-9载体和插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，用NcoI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证hNAT-1的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的hNAT-1。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱hNAT-1。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白，纯化后的蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质对含PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例3hNAT-1在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码hNAT-1的cDNA序列下列寡核苷酸引物进行扩增，获得hNAT-1 cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5’-GGAG GGATCCATGG AGGCGTCCTG GGGGA该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的hNAT-1的部分编码序列；3′端引物序列为5’-ATTT CTGCAGTTTA TTAATCCAAT CAAAA该引物含有PstI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和hNAT-1的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(fl ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用BamHI及PstI消化pcDNA3载体和插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用NcoI酶切鉴定插入片段大小及方向，并测序验证hNAT-1的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行，转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.2的序列一致。
实施例4同源比较用实施例2和实施例3得到的hNAT-1蛋白(SEQ ID NO.2)本发明的hNAT-1蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST软件进行核酸和蛋白同源检索，结果发现它具有氨基酸转运蛋白的特征序列，而且与其他物种的N系统氨基酸转运体有一定的相似性。
本发明的hNAT-1的蛋白序列中氨基酸转运蛋白的特征序列为GVSFGLSVFNLMNAIMGSGILGLAYVMANTGVFGFSFLLLTVALLASYSVHLLLSMCIQTAVTSYEDLGLFAFGLPGKLVVAGTIIIQNIGAMSSYLLIIKTELPAAIAEFLTGDYSRYWYLDGQTLLIIICVGIVFPLALLPKIGFLGYTSSLSFFFMMFFALVVIIKKWSIPCPLTLNYVEKGFQISNVTDDCKPKLFHFSKESAYALPTMAFSFLCHTSILPIYCELQSPSKKRMQNVTNTAIALSFLIYFISALFGYLTFYDKVESELLKGYSKYLSHDVVVMTVKLCILFAVLLTVPLIHFPARKAVTMMFFSNFPFSWIRHFLITLALNIIIVLLAIYVPDIRNVFGVVGASTSTCLIFIFPGLFYLKLSREDFLSWKKLGAFVLLIFGILVGNFSLALIIFDWIN(SEQ ID NO 2中43-455)。
本发明的hNAT-1蛋白与其他物种的N系统氨基酸转运体都有一定的相似性。N系统氨基酸转运体对于尿素循环和肝脏中新合成的谷氨酸输出都有重要作用。这些转运活动可以通过组氨酸阻断。此外，N系统氨基酸转运在脑组织中的研究表明，它可能参与血脑屏障的作用。该类转运体主要在肝脏中表达，在肾、脑、心脏中也有表达。在肝脏中，它定位在重要血管周围肝细胞的细胞膜上，表达量随着血管渐渐分支为小血管而下降，这暗示这类转运体在肝脏中可能有重要的生理作用。
综上所述，本发明的hNAT-1具有氨基酸转运蛋白的特征序列，而且与其他物种的N系统氨基酸转运体有一定的相似性，可对氨基酸的跨膜转运起到调控作用，从而对细胞的营养乃至整个生物体的生理活动，尤其是对肝细胞生理活动起到调控作用。这些生理作用包括激素的分泌，细胞的生长、增殖、分化和凋亡，细胞间的相互作用等等。
将本发明的hNAT-1核酸、其反义链及片段制成探针，可检测hNAT-1基因异常；将hNAT-1蛋白序列制成试剂盒或药物，可调节细胞生长增殖分化，促进组织切除乃至器官摘除后的伤口愈合。将本发明的hNAT-1核酸反义链或hNAT-1抗体制成试剂盒可用于减轻或辅助治疗由于hNAT-1表达量过高而导致的疾病，也可辅助临床上肿瘤和癌症的诊断，预防及治疗。此外，本发明hNAT-1还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，例如可将本发明hNAT-1的N端与鼠TF的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。针对本发明hNAT-1的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
本发明的hNAT-1除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明hNAT-1还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，例如可将本发明hNAT-1的N端与鼠CKR的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明hNAT-1的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
实施例5制备抗体将实施例2或3获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀hNAT-1基因翻译产物的能力加以评估。
实例6作为微矩阵的底物微矩阵，又称为DNA芯片。通过使用一些著名的生物软件(如LASERGENESOFTWARE(DNASTAR)，来选择将hNAT-1全长cDNA、EST、或基因片段作为微矩阵的底物样品。然后通过使用喷墨技术及一系列化学方法如射线、化学、热力学、机械方法等把样品固定在载体上，如玻璃上，得到芯片(Schena，M.et al.(1995)Science 270467-470；and Shalon，D.et al.(1996)Genome Res.6639-645.)，形成的元件有点状、条形等等。一块典型的芯片通常含有一定数量的元件。杂交反应后，洗去未结合的探针，然后用扫描仪来检测发生杂交反应的元件及反应的程度。探针与每一个芯片元件的互补性和结合量都可通过对扫描出的图像的分析来判断。
杂交结果可用于检测出hNAT-1基因变异、突变及多态现象，理解由于hNAT-1表达不正常引起的疾病的分子基础，并可改进及监测相关药剂的活性。
实施例7试剂盒的制备试剂盒1它含有(1)特异性扩增hNAT-1的引物对和使用说明。该试剂盒还可含有或不含有将mRNA逆转录成cDNA的所需试剂。其中，该特异性引物的序列衍生自SEQ ID NO1的序列。对逆转录成的cDNA进行特异性扩增，以检测样品中是否含有hNAT-1的核酸序列。该试剂盒还可含有进行PCR反应所需的其他试剂，例如缓冲液等。
此外，较佳地，至少一个所用的引物跨越了两个外显子，因为此时对应于hNAT-1的基因组序列将不产生扩增产物。
试剂盒2该试剂盒含有针对hNAT-1的特异性的抗体(例如实施例5中制备的多克隆抗体，或者用标准的杂交瘤技术产生的抗hNAT-1的单克隆抗体)，和使用说明。该试剂盒用于直接检测样品中是否存在或缺失hNAT-1蛋白。先通过特异性免疫反应形成免疫复合物，然后用常规技术检测免疫复合物。
试剂盒3该试剂盒含有可特异性地与hNAT-1的mRNA杂交的探针。它还可含有或不含有杂交缓冲液。该试剂盒通过核酸分子与hNAT-1特异性探针之间的杂交反应来检测样品中是否存在hNAT-1的核酸分子。
试剂盒也可用于检测出基因变异、突变及多态现象，并检测出一系列与本发明的hNAT-1相关的基因，从而对相关疾病的诊断、治疗起辅助作用。
实例8制成药物本发明的hNAT-1蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等可作为药物，可促进烫伤烧伤、组织切除乃至器官摘除后的伤口愈合，防止伤口感染。将本发明的hNAT-1核酸反义链或hNAT-1抗体制成试剂盒可用于减轻或辅助治疗由于hNAT-1表达量过高而导致的疾病，也可辅助临床上肿瘤和癌症的诊断，预防及治疗。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常为约5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
此外，本发明hNAT-1核酸(编码序列或反义序列)可以直接引入细胞，以提高hNAT-1的表达水平或者抑制hNAT-1的过度表达。本发明的hNAT-1蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因hNAT-1缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
当本发明的hNAT-1蛋白多肽被用作药物时，治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
序列表<210>1<211>1516<212>核苷酸<213>人类<220><221>编码序列<222>(117)..(1487)<223><400>1gtacggaatg ccggaagggc cgggctcaaa gctccgcctc tggcgcgacc gacgactgga60gcgcagggca ggggtagagg ctcgtagatg gaactggtag tcagctggag agcagc atg119Met1gag gcg tcc tgg ggg agc ttc aac gct gag cgg ggc tgg tat gtc tct 167Glu Ala Ser Trp Gly Ser Phe Asn Ala Glu Arg Gly Trp Tyr Val Ser5 10 15gtc cag cag cct gaa gaa gcg gag gcc gaa gag ttg agt ccg ttg cta 215Val Gln Gln Pro Glu Glu Ala Glu Ala Glu Glu Leu Ser Pro Leu Leu20 25 30agc aac gaa ctt cac aga cag cga tcc cca ggt gtt tca ttt ggt tta 263Ser Asn Glu Leu His Arg Gln Arg Ser Pro Gly Val Ser Phe Gly Leu35 40 45tca gtg ttt aat ttg atg aat gcc atc atg gga agt ggc atc ctt ggc 311Ser Val Phe Asn Leu Met Asn Ala Ile Met Gly Ser Gly Ile Leu Gly50 55 60 65tta gct tat gtt atg gct aat acc ggt gtc ttt gga ttt agc ttc ttg 359Leu Ala Tyr Val Met Ala Asn Thr Gly Val Phe Gly Phe Ser Phe Leu70 75 80ctg ctg aca gtt gct ctc ctg gct tct tac tca gtc cat ctt ctg ctt 407Leu Leu Thr Val Ala Leu Leu Ala Ser Tyr Ser Val His Leu Leu Leu85 90 95agt atg tgt att cag aca gct gta aca tct tat gaa gat ctt gga ctc 455Ser Met Cys Ile Gln Thr Ala Val Thr Ser Tyr Glu Asp Leu Gly Leu100 105 110ttt gca ttt gga tta cct gga aag ttg gtg gtg gca ggc acc ata ata 503Phe Ala Phe Gly Leu Pro Gly Lys Leu Val Val Ala Gly Thr Ile Ile115 120 125att cag aat att gga gct atg tca tct tat ctt tta att att aaa aca 551Ile Gln Asn Ile Gly Ala Met Ser Ser Tyr Leu Leu Ile Ile Lys Thr130 135 140 145gag ctt cct gct gct att gca gaa ttt ttg act gga gac tat agt aga 599Glu Leu Pro Ala Ala Ile Ala Glu Phe Leu Thr Gly Asp Tyr Ser Arg150 155 160tat tgg tat ctt gat gga caa aca cta cta ata atc ata tgt gtt ggc 647Tyr Trp Tyr Leu Asp Gly Gln Thr Leu Leu Ile Ile Ile Cys Val Gly165 170 175att gtg ttc cct ctt gca ctt ctt ccc aaa ata ggc ttt ctt ggc tac 695Ile Val Phe Pro Leu Ala Leu Leu Pro Lys Ile Gly Phe Leu Gly Tyr180 185 190aca agt agt tta tca ttt ttc ttt atg atg ttc ttt gct ctt gtg gta 743Thr Ser Ser Leu Ser Phe Phe Phe Met Met Phe Phe Ala Leu Val Val195 200 205ata att aaa aaa tgg tcc atc cct tgt cct ctg aca tta aat tat gta 791Ile Ile Lys Lys Trp Ser Ile Pro Cys Pro Leu Thr Leu Asn Tyr Val210 215 220 225gag aaa ggc ttc cag att tca aat gtt aca gat gat tgt aag cca aag 839Glu Lys Gly Phe Gln Ile Ser Asn Val Thr Asp Asp Cys Lys Pro Lys230 235 240ctc ttt cat ttc tcc aaa gag agt gct tat gcc tta cca acc atg gct 887Leu Phe His Phe Ser Lys Glu Ser Ala Tyr Ala Leu Pro Thr Met Ala245 250 255ttt tca ttt ctc tgc cat acc tca ata ttg ccc ata tac tgt gaa ctt 935Phe Ser Phe Leu Cys His Thr Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Cys Glu Leu260 265 270caa agt cct tca aag aaa aga atg cag aat gtt acc aat aca gca att 983Gln Ser Pro Ser Lys Lys Arg Met Gln Asn Val Thr Asn Thr Ala Ile275 280 285gct tta agt ttt ctc att tat ttt ata tct gca ctc ttt ggg tac ctc 1031Ala Leu Ser Phe Leu Ile Tyr Phe Ile Ser Ala Leu Phe Gly Tyr Leu290 295 300 305act ttt tat gac aaa gtg gag tca gaa tta cta aaa ggt tat agt aaa 1079Thr Phe Tyr Asp Lys Val Glu Ser Glu Leu Leu Lys Gly Tyr Ser Lys310 315 320tac tta tca cat gat gtt gtt gtc atg act gtg aag tta tgc ata cta 1127Tyr Leu Ser His Asp Val Val Val Met Thr Val Lys Leu Cys Ile Leu325 330 335ttt gct gtg ctt ttg aca gtc cct cta atc cac ttc cct gcc aga aaa 1175Phe Ala Val Leu Leu Thr Val Pro Leu Ile His Phe Pro Ala Arg Lys340 345 350gct gta aca atg atg ttt ttc tcc aat ttt cca ttc tca tgg att cgc 1223Ala Val Thr Met Met Phe Phe Ser Asn Phe Pro Phe Ser Trp Ile Arg355 360 365cat ttt ttg atc act cta gca ctc aat att atc atc gtt tta ctt gca 1271His Phe Leu Ile Thr Leu Ala Leu Asn Ile Ile Ile Val Leu Leu Ala370 375 380 385ata tat gtt cct gac att aga aat gta ttt ggt gta gtt ggt gcc agt 1319Ile Tyr Val Pro Asp Ile Arg Asn Val Phe Gly Val Val Gly Ala Ser390 395 400aca tca aca tgt ttg att ttt ata ttc cca gga cta ttt tat ctt aaa1367Thr Ser Thr Cys Leu Ile Phe Ile Phe Pro Gly Leu Phe Tyr Leu Lys405 410 415ctt agc aga gag gat ttt ctg tca tgg aaa aag ctt ggg gca ttc gtt1415Leu Ser Arg Glu Asp Phe Leu Ser Trp Lys Lys Leu Gly Ala Phe Val420 425 430ttg ctc atc ttt gga att ttg gtt ggg aat ttt agt tta gca ctc atc1463Leu Leu Ile Phe Gly Ile Leu Val Gly Asn Phe Ser Leu Ala Leu Ile435 440 445att ttt gat tgg att aat aaa taa aagaaatatt ttcctacttc ttacaagaa1516Ile Phe Asp Trp Ile Asn Lys450 455<210>2<211>456<212>氨基酸<213>人类<400>2Met Glu Ala Ser Trp Gly Ser Phe Asn Ala Glu Arg Gly Trp Tyr Val1 5 10 15Ser Val Gln Gln Pro Glu Glu Ala Glu Ala Glu Glu Leu Ser Pro Leu
20 25 30Leu Ser Asn Glu Leu His Arg Gln Arg Ser Pro Gly Val Ser Phe Gly35 40 45Leu Ser Val Phe Asn Leu Met Asn Ala Ile Met Gly Ser Gly Ile Leu50 55 60Gly Leu Ala Tyr Val Met Ala Asn Thr Gly Val Phe Gly Phe Ser Phe65 70 75 80Leu Leu Leu Thr Val Ala Leu Leu Ala Ser Tyr Ser Val His Leu Leu85 90 95Leu Ser Met Cys Ile Gln Thr Ala Val Thr Ser Tyr Glu Asp Leu Gly100 105 110Leu Phe Ala Phe Gly Leu Pro Gly Lys Leu Val Val Ala Gly Thr Ile115 120 125Ile Ile Gln Asn Ile Gly Ala Met Ser Ser Tyr Leu Leu Ile Ile Lys130 135 140Thr Glu Leu Pro Ala Ala Ile Ala Glu Phe Leu Thr Gly Asp Tyr Ser145 150 155 160Arg Tyr Trp Tyr Leu Asp Gly Gln Thr Leu Leu Ile Ile Ile Cys Val165 170 175Gly Ile Val Phe Pro Leu Ala Leu Leu Pro Lys Ile Gly Phe Leu Gly180 185 190Tyr Thr Ser Ser Leu Ser Phe Phe Phe Met Met Phe Phe Ala Leu Val195 200 205Val Ile Ile Lys Lys Trp Ser Ile Pro Cys Pro Leu Thr Leu Asn Tyr210 215 220Val Glu Lys Gly Phe Gln Ile Ser Asn Val Thr Asp Asp Cys Lys Pro225 230 235 240Lys Leu Phe His Phe Ser Lys Glu Ser Ala Tyr Ala Leu Pro Thr Met245 250 255Ala Phe Ser Phe Leu Cys His Thr Ser Ile Leu Pro Ile Tyr Cys Glu
260 265 270Leu Gln Ser Pro Ser Lys Lys Arg Met Gln Asn Val Thr Asn Thr Ala275 280 285Ile Ala Leu Ser Phe Leu Ile Tyr Phe Ile Ser Ala Leu Phe Gly Tyr290 295 300Leu Thr Phe Tyr Asp Lys Val Glu Ser Glu Leu Leu Lys Gly Tyr Ser305 310 315 320Lys Tyr Leu Ser His Asp Val Val Val Met Thr Val Lys Leu Cys Ile325 330 335Leu Phe Ala Val Leu Leu Thr Val Pro Leu Ile His Phe Pro Ala Arg340 345 350Lys Ala Val Thr Met Met Phe Phe Ser Asn Phe Pro Phe Ser Trp Ile355 360 365Arg His Phe Leu Ile Thr Leu Ala Leu Ash Ile Ile Ile Val Leu Leu370 375 380Ala Ile Tyr Val Pro Asp Ile Arg Asn Val Phe Gly Val Val Gly Ala385 390 395 400Ser Thr Ser Thr Cys Leu Ile Phe Ile Phe Pro Gly Leu Phe Tyr Leu405 410 415Lys Leu Ser Arg Glu Asp Phe Leu Ser Trp Lys Lys Leu Gly Ala Phe420 425 430Val Leu Leu Ile Phe Gly Ile Leu Val Gly Asn Phe Ser Leu Ala Leu435 440 445Ile Ile Phe Asp Trp Ile Asn Lys45045权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人hNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列是SEQ ID NO.1中核苷酸117-1487位的序列。
4.一种分离的hNAT-1蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有hNAT-1蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有hNAT-1蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成hNAT-1蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成hNAT-1蛋白的重组细胞；(c)在适合表达hNAT-1蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有hNAT-1蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸117-1487位。
12.一种能与权利要求4所述的hNAT-1蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸
15.一种试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子。
16.一种试剂盒，其特征在于，它含有权利要求12所述的抗体。
17.一种权利要求1所述DNA分子的应用，其特征在于，它作为引物用于核酸扩增反应或者用制造基因芯片；或者用于制备药物以预防、诊断或治疗由于hNAT-1编码基因异常而引起的疾病。
18.一种权利要求4所述蛋白多肽的应用，其特征在于，它应用与筛选人氨基酸转运蛋白的激动剂或抑制剂；或者用于制备药物以预防、诊断或治疗由于hNAT-1表达异常而引起的疾病。
全文摘要
本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明提供了一种人N系统氨基酸转运蛋白(human N system amino acids transporter，hNAT－1)、其编码序列、制法及用途。本发明的hNAT－1具有跨膜氨基酸转运体的特征序列并与已发现的N系统氨基酸转运蛋白相似。将本发明的hNAT－1核酸、其反义链或片段制成探针，可检测hNAT－1基因异常；将hNAT－1蛋白或其抑制剂制成药物或试剂盒，可对氨基酸的跨膜转运起到调控作用，从而对细胞的营养乃至整个生物体的生理活动，尤其是对肝细胞生理活动起到调控作用。
文档编号C07K14/435GK1401770SQ0213729
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月29日 优先权日2002年9月29日
发明者余龙, 唐丽莎, 郭金虎 申请人:复旦大学