专利名称：天然的抗hiv病毒抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及中和人类免疫缺陷病毒的抗体。上述抗体存在于正常个体的血清中，能够用来预防HIV感染或者延迟血清呈阳性的病人病情的发作。本发明还涉及含有上述抗体的药物制剂以及它们在进行HIV感染的被动免疫治疗中的用途。
背景技术：
诱导有效的针对HIV-1的免疫应答经常由于任何候选疫苗都不能引发抗体的产生，以中和感染者原发HIV分离物的感染性而受到限制(1，2)。另一方面，从对受感染者血清进行的分析表明，对原发病毒的中和较弱且是零星的(3，4)。然而，尽管培养抗体较难，或者在感染时或者通过实验疫苗，但是的确存在单克隆抗体，比如IG1b12，2F5和2G12(5-7)，它们能够中和原发性亚型A-E病毒。上述抗体来自亚型B感染的个体且不是通过接种培养所得(8)。
最早可检测到的HIV-1特异抗体是IgG的同种型(12)，表明是非常规的初次应答(13)。此外，有发现表明，HIV-1抗原和预先存在的所有抗体组成成分反应(14)。报道存在识别HIV-1包膜的交叉反应抗体(15)。
有人提议HIV-1感染中强烈的早期体液应答可能没有益处(16)，因为这将形成单克隆和多克隆抗体群而不是正常的多克隆应答(13)。有人提议抗特应型抗体1F7可能扩宽对HIV抗原的免疫应答(17)。
在申请人以前的研究中，预测HIV包膜蛋白和IgG可变蛋白具有同源性(18，19)。然而，最近的数据表明，HIV-1 gp120免疫显性表位和天然存在的IgG抗体的一部分结构互补(20，21)。
发明内容
现在申请人已经发现正常的、未HIV感染的个体血清中存在一组抗体，它们能够中和HIV病毒。
抗体的活性组分通过亲和层析从正常个体的血清中分离纯化出来，层析采用Sepharose树脂，其上结合人全IgG。观察证明，这种抗IgG抗体组分能够中和PBMC中HIV-1感染。用各种浓度的、得自商业的血清标本的不同的抗IgG制剂重复实验，利用亲和纯化的全IgG抗体作为阴性对照，HIVIG和mAb4117C抗体作为阳性对照。已证明后者对92HT593B无活性。
图1所示的中和曲线涉及用HIV-1主要分离物92HT593B和SF162WT以及重组NLHX-ADA病毒所做的代表性实验。已证明抗IgG抗体对92HT593B和NLHX-ADA有活性，50％的抑制浓度范围为小于1微克/毫升到7微克/毫升。
所观察到的抗IgG抗体制剂的中和效果是由于从正常血清中共同纯化出的趋化因子所致的可能性很小，因为这些物质的浓度不会超过20纳克/毫升血清，并且通过PAGE表明，没有特定带。此外，通过对抗体制剂的透析，已经将分子量低于50kDa的分子去除了。对抗IgG制剂进行PAGE分析发现，主要为IgG以及痕量的污染蛋白。
所观察结果的一个可能的解释是，HIV-1抗原决定簇和属于免疫网络的天然抗体可变区有互补的结构(9，23)，但这个和其他解释决非限制本发明。
因此，本发明的第一个方面涉及抗人IgG全组分的、能中和HIV-1的人抗体制剂。上述制剂可通过将正常的、未HIV感染者的血清进行亲和层析得到，其中树脂与人全IgG组分结合。分离的抗IgG抗体的终浓度优选范围为0.1-1000微克/毫升，更优选的范围为0.1-100微克/毫升。起始物质为正常人体的混和血清(pool of sera)。根据另一方面，本发明涉及本发明制剂在预防或治疗HIV的感染、优选HIV-1感染中的用途。
在用于治疗时，最好将本发明的制剂与药物学上接受的赋形剂一起配制。所述赋形剂包括缓冲剂、稳定剂、助溶剂、稀释剂、等渗剂等等。制剂优选通过胃肠外途经给药，优选通过静脉、皮内或者肌内途径给药。根据优选的实施方案，本制剂将用于HIV-1感染的被动免疫治疗。
附图内容图1用抗IgG抗体中和HIV-1主要分离物92HT593B和SF162WT以及重组NL-HX-ADA病毒。每条滴定曲线代表单个实验的数据。对于在1000和3333微克/毫升之间的全IgG以及对于HIVIG(10000毫克/毫升)，各个实验中采用的抗IgG的浓度分别为109.7、12.3和80.0微克/毫升。抗IgG和全IgG制剂用下面描述的方法得到。HIVIG从HIV感染者的血清中制得。
图2SDS-PAGE分离亲和纯化的抗体。抗IgG和全IgG制剂用下面描述的方法得到。对抗IgG抗体的电泳分离发现主要成分为IgG。此外，尽管其电泳带很弱，还是存在高分子量的蛋白带。
实施例1-抗IgG抗体的制备通过亲和层析从两种正常人混和血清中制备抗IgG抗体，层析采用Sepharose珠(CNBr活化过的Sepharose 4B)，其上结合有人全IgG(用GammaBind Sepharose 4B亲和柱纯化)。原则上，使用5-7毫克IgG抗体/0.5-0.6克Sepharose珠。按照厂家的说明进行结合。对柱子用5×PBS平衡，然后将热灭活血清(1毫升)上柱并用5×PBS稀释到1∶1。在室温下孵育1小时或者在4℃过夜。用30毫升5×PBS洗涤后，结合的抗体用0.1摩尔/升、pH＝2.5的柠檬酸盐(缓冲液)洗脱至含TRIS碱的试管中。将收集的洗脱液离心，透析(Centricon YM，截留值为分子量30000)并用10％SDS-PAGE分析，发现主要为IgG带(图2)。
实施例2-用抗IgG抗体中和HIV-1分离物按照以前发表的方法(22)，在PBMC中进行病毒中和评价。中和分析用5组独立的实验，每组4个不同的抗体制剂进行。
表1总结了针对两个HIV主要分离物(92HT593B，SF162WT)和一个重组NL-HX-ADA病毒的中和数据。
HIVIG和mAb4117C用作阳性对照；蛋白-G IgG用作阴性对照。
在该试验中证明，所有抗IgG抗体制剂都能够抑制92HT593B和NL-HX-ADA对PBMC的感染，但是没有观察到对SF162WT的中和活性。
表从HIV-1感染的(a)和正常(b)实验对象血清中纯化的Ig病毒中和效价主要分离物重组病毒92HT 593B SF162 WTNLHX-ADA抗体制剂分析 微克/毫升 ％neut 微克/毫升 ％neut 微克/毫升 ％neut阴性对照1508.3 150 2.9 150 -6.8蛋白GIgGb)50 1.1 50 -0.5 50 -4.416.7 2.2 16.7 2.7 16.7 -4.4阳性对照10016.1 100 100 100 98.7mAb4117C a) 33.3 9.0 33.3 100 33.3 96.011.1 5.2 11.1 100 11.1 55.03.70.4 3.7 80.4 3.7 23.21.2 -0.6 1.2 57.4 1.2 -8.6阳性对照HIVIG a) 10088.0 100 57.4 100 93.433.3 62.0 33.3 39.9 33.3 94.811.1 44.4 11.1 2.1 11.1 92.43.739.4 3.7 -14.4 3.7 87.21.23 22.2 1.23 0.7 1.23 69.20.41 8.3 0.41-3.7 0.41 54.5抗IgG b) 11 1.87 57.40.62 37.6NA ND0.21 6.1抗IgG b) 12 1.23 71.80.41 48.9NA ND0.14 14.4抗IgG b) 21 8.00 42.08.00 60.32.67 24.1NA 2.67 14.60.89 5.7 0.89 1.3抗IgG b) 31 2.17 46.40.72 27.1NA ND0.24 3.3抗IgG b) 41 10.97 39.810.97 68.73.66 - NA 3.66 54.01.22 - 1.22 45.0文献1.Mascola，JR，Snyder，SW，Weislow，OS.Belay，SM，Belshe，RB，Schwartz，DH，Clements，ML，Dolin，R，Graham，BS，Gorse，GJ，Keefer，MC，McElrath，MJ，Walker，MC，Wagner，KF，McNeilJG，McCutchan，FE，and Burke，DS用包膜亚单位疫苗产品免疫引起针对实验室适应的但非原初人免疫缺陷病毒1型分离物的中和性抗体。J Infect Dis 1996；173340-348。2.Montefiori，DC，and Evans，TG一个能够产生有效的、广泛交叉反应中和抗体的HIV1型疫苗。AIDS Res Hum Retroviruses1999；15689-698；3.Moore，JP，Coa，Y，Leu，Qin，L，Korber，B，and Ho，DD中间和内部中和人免疫缺陷病毒1型遗传进化枝不和中和血清型相对应但和gp120抗原血清型部分对应。J Virol 1996；70427-444；4.Weber，J，Fenyo，EM，Beddows，S，Kaleeby，P，Bjorndal，A，and the WHO Network for HIV Isolation andCharacterizationHIV-1区分离物中和血清型没有被遗传亚型所预测。J Virol 1996；707827-7832；5.Burton，DR，Pyati，J，Koduri，R，Sharp，SJ，Thornton，GB，Parren，PWHI，Sawyer，LSW，Hendry，RM，Dunlop，N，Nara，PL，Lamacchia，M，Garratty，E，Stiehm，ER，Bryson，YJ，Cao，Y，Moore，JO，Ho，DD，and Barbas III，CF通过重组人单克隆抗体有效中和HIV-1主要分离物。Science 1994；2661024-1027；6.Mascola，JR，Louder，MK，VanCott，TC，Sapan，CV，Lambert，JS，Muenz，LR，Bunow，B，Birx，DL，and Robb，ML通过高免疫的抗HIV免疫球蛋白和单克隆抗体2F5与2G12有效、协同的中和人免疫缺陷病毒(HIV)1型主要分离物。J Virol1997；717198-7206；7.Trkola，A，Pomales，AB，Yuan，H，Kober，B，Maddon，PJ，Allaway，GP，Katinger，H，Barbas III，CF，Burton，DR，Ho，DD，and Moore，JP通过人单克隆抗体和四聚体CD4-IgG交叉进化枝中和人免疫缺陷病毒1型主要分离物。J Virol1995；696609-6617；8.Moore，JP，and Trkola，AJIV 1型共受体，中和血清型和疫苗的开发。AIDS Res Human Retroviruses 1997；13733-736；9.Coutinho A克隆选择和网络远景。Immunological Reviews1989；11063-67；10.Avrames，S天然自身抗体从“horror autotexicus”到”gnothiseauton”。Immunol Today 1991；12154-159；11.Moller，G抗免疫球蛋白血清对B淋巴细胞功能的影响。Scand J Immunol 1978；8469-474；12.Race，EM，Ramsey，KM，Lucia，HL，and Cloyd，MW人免疫缺陷病毒引发不能用标准方法检测出的抗体；对诊断学和病毒免疫学的暗示。Virology 1991；184716-722；13.Nara，PL，and Garrity，R假印记与疫苗有关的通用策略。Vaccine 1998；161780-1787；14.Zubler，RH，Perrin，LH，Doucet，A，Zhang，X，Huang，YP，andMiescher，PAHIV反应性B细胞在血清阳性和血清阴性个体中的出现率。Clin Exp Immunol 1991；8731-36；15.Davis，D，Chaudhri，B，Stephens，DM，Carne，CA，Willers，C，and Lachmann，PJ人免疫缺陷病毒1型的跨膜蛋白(gp41)的主要免疫表位可能由宿主以前暴露于不相关抗原的相似表位决定。J Gen Virol 1990；711975-1983；16.Velijovic，V，Metlas，R，Khler，H，Urnovitz，HB，Prljic，J，Velikovic，N，Johnson，E，and Müller，S艾滋病在3000年初的流行病学新艾滋病疫苗策略出现的时间。Vaccine 2000；19；1855-1863；17.Wang，QL，Wang，HT，Blalock，E，Moller，S，and K”hlerm H鉴定在免疫缺陷病毒1感染的个体中被自身抗体识别的特应性肽。Idiotype-specific autoantibodies in AIDS 1995；96775-780；18.Veljkovic，V，and Metlas，R鉴定HIV-1包膜基因中的免疫球蛋白重组成分。Immunol Lett 1991；3111-14；19.Metlas，R，Veljkovic，V，Paladini，DR，and Pongor，S人免疫缺陷病毒1型包膜蛋白gp120 V3环和免疫球蛋白可变区的蛋白和DNA序列的同源性。Biochem Biophys Res Commun1991；1791056-1062；20.Metlas，R.Skerl，V，Veljkovic，V，Colombatti，A，and Pongor，SHIV1-1包膜糖蛋白gp120的类免疫球蛋白区编码假定的某些普通人蛋白的内部图像。Viral immunol 1994；7215-219；21.Metlas，R，Traj kovic，D，Srdic，T，Veljkovic，V，andColombatti，A正常个体的抗V3和抗IgG抗体有互补结构。JAIDS 1999；21266-270；22.Pinter，A，Honnen，WJ，Tilley，SA构象改变影响人免疫缺陷病毒1型gp120和包膜加工以及配基与这些位点结合相关的V3和V4结合域。J Virol1993；675692-5697；23.Holmberg，D，Andersson，A，Carlsson，L，and Forsgren，SB细胞连接的建立和功能含义。Immunological Reviews 1989；11089-103；24.Ochsenbein，AF，and Zinkernagel，RM天然抗体和先天的互补链与获得免疫性。Immunol Today 2000；21624-629；25.Fearon，DT，and Locksley，RM先天免疫性在获得性免疫应答中的指导作用。Science 1996；27250-54。
权利要求
1.抗人IgG全组分的人抗体，该抗体能够中和HIV-1。
2.权利要求1中的抗体，通过采用与人IgG全组分结合的树脂对正常的、未HIV感染对象的血清进行亲和层析得到。
3.含权利要求1-2的抗体的药物制剂。
4.权利要求1和2中的抗体在制备用于预防或治疗HIV感染的药物中的用途。
5.权利要求1和2中的抗体在制备用于HIV-1感染的被动免疫治疗的药物中的用途。
全文摘要
能中和HIV－1病毒的人抗体制剂以及它的使用以治疗HIV感染。
文档编号C07K16/42GK1494554SQ02806063
公开日2004年5月5日 申请日期2002年3月6日 优先权日2001年3月9日
发明者R·梅特拉斯, R 梅特拉斯 申请人:戴法姆有限公司