Hiv转录阻遏物及其方法

专利名称：Hiv转录阻遏物及其方法
技术领域：
本发明涉及抑制获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)病毒基因组(RNA)自前病毒或长末端重复序列(LTR)启动子产生的阻遏物。更具体的，本发明涉及抑制艾滋病病毒基因组(RNA)转录的融合蛋白，包含选自下列组的多肽序列强有力抑制蛋白活性的蛋白例如Sp1或NF-kB；通过强有力浓缩染色质抑制转录的蛋白；能够结合艾滋病病毒启动子的蛋白例如锌指蛋白；以及识别短RNA链(HIV短转录本)的多肽序列(如Tat蛋白或Tat衍生物)。
当强有力抑制蛋白活性的蛋白例如Sp1或NF-kB以及通过强有力浓缩染色质抑制转录的蛋白作为发射物通过短RNA链识别蛋白(如Tat蛋白和其突变体)被靶向到HIV-1 LTR启动子表达调控区附近的时候，该融合蛋白对抑制人免疫缺陷病毒(HIV)-1 RNA的产生具有显著的效果。
背景技术：
一般而言，HIV入侵公知需要病毒包膜蛋白(GP120)和细胞膜表面受体的结合。在结合之后，病毒与细胞融合并将其病毒物质注入细胞。融合后，病毒基因组(RNA)通过反转录酶转变为DNA。另外，通过整合酶，DNA类型的病毒基因组随之整合到宿主细胞的DNA中，在那里它作为“前病毒”存在于细胞的一生中。前病毒HIV基因组利用宿主细胞的表达系统产生基因组RNA(转录步骤)，并利用病毒基因组大量产生在胞质中增殖(翻译以及蛋白剪切、蛋白酶功能)所必需的成分(蛋白、衣壳)。在装配步骤后，HIV基因组随之从宿主细胞释放并增殖。如果超过临界点，平均每天有100亿新的HIV增殖。因此，感染后爱滋病是无法治愈的。
已研发了许多抑制上述步骤的抗体(疫苗)或化合物抗爱滋病药物。广泛应用的抗爱滋病药物是反转录步骤和蛋白酶的抑制剂。尽管研发了抑制识别宿主细胞步骤的疫苗，但由于病毒包膜蛋白的迅速变异，他们很难抑制HIV。另外，HIV反转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂通常也有作用。HIV抑制物、以及多种反转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂已被研发并在许多制药公司销售。他们具有抑制早期HIV生长的效果，但是其存在一些问题例如毒性和快速的抗性。
此外，关于HIV注入宿主细胞或治疗制剂对该步骤的作用机制的研究还不完善。归因于对基因治疗爱滋病的兴趣，反义基因治疗和核酶基因治疗自1997年建立起来。从1997年起就进行了第一阶段的临床实验，但是这种治疗就获得病毒抗性而言具有根深蒂固的问题。
关于病毒RNA生长的表达调控机制的许多研究证明在特定宿主细胞中的转录调控蛋白对于RNA的表达很重要。最近，研究表明与TAK(Tat相关激酶或PTEF)作用的Tat对RNA合成酶的活性具有重大影响。因此，最近的研究焦点集中于抑制Tat或TAK作用的RNA生产抑制剂(例如Tat类似物蛋白片段，TAR类似物RNA片段，TAK抑制剂)。
上文提及的治疗制剂通过减缓疾病的进程能在一定程度上延长生命，但是由于迅速抗性的病毒的产生而失效。那些治疗制剂具有的基本问题是表达的可能性，存在于宿主细胞中的病毒DNA基因组(前病毒)有可能表达成为病毒RNA，因为不管是否有上述的制剂、疫苗和基因治疗，前病毒基因组都能够存在。
因此，克服现存制剂的问题的最好的方式是抑制前病毒LTR表达为基因组RNA的转录步骤。本发明提供了融合蛋白用于抑制HIV转录、调控爱滋病病毒RNA的表达。换言之，本发明的融合蛋白阻止宿主细胞中的病毒DNA基因组表达为病毒RNA基因组，并随之阻断病毒增殖所必需的成分的产生(RNA基因组、蛋白、衣壳)，从而基本上抑制病毒的增殖和抗性病毒的产生。因此，本发明克服了常规制剂的问题并提供了一种创新的爱滋病治疗制剂。

发明内容
根据本发明，本发明的一个目的是提供一种新的生物治疗制剂，基本上抑制爱滋病增生所必需的病毒基因组(RNA)并克服病毒抗性，以及一种抑制HIV转录以治疗爱滋病的方法。
为了实现上文提及的目的，本发明提供了一种抑制HIV转录的融合蛋白，包括一种选自由a)强有力的抑制转录因子例如Sp1或NF-KB的活性；b)通过浓缩染色质抑制转录活动；和c)能结合启动子区(例如，锌指蛋白)组成的组的多肽或化合物；以及一种识别表达调控区附近的RNA链或者病毒启动子顺式作用区的多肽或化合物。
在本发明的融合蛋白中，化合物是通过酶学或化学方法连接于蛋白的识别特定核酸序列的化合物。化合物可以是小分子、核酸类似物或寡聚多糖。
在本发明的融合蛋白中，强有力抑制转录因子例如Sp1或NF-KB的活性、或者通过浓缩染色质抑制转录活动、或者能够结合转录调控启动子的多肽或化合物优选是选自由a)POZ-结构域蛋白；b)HDAC或其激活转录抑制的区域；c)MeCP2或类似物MBP-型蛋白；d)选自由polycom家族蛋白、mSin3A、SMRT和N-CoR组成的组的辅阻遏蛋白；e)Sp1，Sp2，Sp3，Sp4或NF-KB的DNA结合区域多肽；以及f)能在HIV启动子附近结合的蛋白(例如，锌指蛋白)组成的组的多肽或化合物。
识别表达调控区附近的短转录本或者病毒启动子顺式作用区的多肽或化合物优选是SEQ ID NO1或2中所示的Tat蛋白、它衍生的多肽片段或其突变体。
更优选本发明的融合蛋白是选自由SEQ ID NO3～10中所示的蛋白组成的组的一个或多个融合蛋白。
本发明还提供了分别编码SEQ ID NO3～10中所示的多肽的碱基序列SEQ ID NO11-18。
本发明的一种融合蛋白，SEQ ID NO1-2中所示的多肽分别是包括73和72个氨基酸的Tat蛋白突变体，SEQ ID NO3是MeCP2-TatdMT(73aa)融合蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO4是HDAC 1-TatdMt(73aa)融合蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO5是POZ-TatdMt(73aa)融合蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO6是FBI-1-TatdMt(73aa)融合蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO7是TatdMt(72aa)-MeCP2融合蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO8是TatdMt(72aa)-HDAC1融合蛋白的氨基酸序列，SEQ ID NO9是TatdMt(72aa)-POZ融合蛋白的氨基酸序列，而SEQ ID NO10是TatdMt(72aa)-FBI-1融合蛋白的氨基酸序列。
本发明还提供了SEQ ID NO11中所示的编码融合蛋白MeCP2-TatdMt(73aa)的碱基序列，SEQ ID NO12是编码HDAC1-TatdMt(73aa)的碱基序列，SEQ ID NO13是编码POZ TatdMt(73aa)的碱基序列，SEQ ID NO14是编码FBI-1-TatdMt(73aa)的碱基序列，SEQ ID NO15是编码TatdMt(72aa)-MeCP2的碱基序列，SEQ ID NO16是编码TatdMt(72aa)-HDAc1的碱基序列，SEQ ID NO17是编码TatdMt(72aa)-POZ的碱基序列，而SEQ IDNO18是编码TatdMt(72aa)-FBI-1的碱基序列。
本发明提供了抑制HIV增殖的、包括部分或全部这些融合蛋白的组合物。
本发明提供了选自由pcDNA3.0-TatWt、pcDNA3.0-TatMt、pcDNA3.0-FBI-1、pcDNA3.0-MeCP2-TatWt、pcDNA3.0HDAC1-TatWt、pcDNA3.0FBI-1-TatWt、pcDNA3.0-POZ-TatWt、pcDNA3.0TarWt-MeCP2、pcDNA3.0TatWt-HDAC1、pcDNA3.0TatWt-FBI-1、pcDNA3.0TatWt-POZ、pcDNA3.0-MeCP2-TatdMt、pcDNA3.0HDAC1-TatdMt、pcDNA3.0FBI-1-TatdMt、pcDNA3.0-POZ-TatdMt、pcDNA3.0TatdMt-Mecp2、pcDNA3.0TatdMt-HDAC1、pcDNA3.0TatdMt-FBI-1和pcDNA3.0TatdMt-POZ组成的组的一个或多个包含编码上文提及的融合蛋白的基因的重组载体的部分或全部碱基序列。
本发明提供了一种抑制病毒基因组(RNA)的转录的方法，利用对HIV短转录本或启动子调控区(顺式作用元件)具有结合作用的蛋白或物质靶向抑制转录的蛋白或物质。


图1为HIV LTR区病毒基因组(RNA)的转录调控示意图。低水平的RNA合成主要由Sp1、NF-κB和TATA框决定。缺陷型的Sp1-结合的GC-框或TATA框阻止转录。如果发生一次转录，则在LTR启动子附近存在HIV短链(短转录本)。如果Tat蛋白结合TAR区域，则PTEF(正转录延伸因子)结合，并且接着CDK9(细胞周期蛋白依赖性激酶9)强有力磷酸化聚合酶II(Po1 II)的CTD(C末端结构域)。结果形成了长链病毒RNA，从而迅速复制HIV。
图2显示了阻遏物-TatWt(包含野生型86个氨基酸的Tat蛋白)融合蛋白的构建(a)，而(b)显示了CV-1细胞中瞬时表达的分析结果。与TatWt融合的融合蛋白可能不在转录水平抑制HIV-LTR病毒基因组表达，但该融合蛋白可以被TatWt组分靶向到HIV LTR启动子，从而通过刺激转录延伸而增强表达。
图3显示了(a)阻遏物-TatdMt(含有72或73个氨基酸的突变体，其中Tat蛋白的2个氨基酸序列被突变)的构建，(b)显示了CV-1细胞中瞬时表达的结果，而(c)显示了HeLa细胞中的表达结果，其中HIV-1 LTR启动子象前病毒状态一样被插入到基因组中。与TatdMt融合的融合蛋白在存在300ng TatWt表达质粒时强有力的抑制HIV-LTR病毒基因组的转录，从而可在无Tat时将表达降至低水平。该结果揭示HeLa细胞中象前病毒状态一样的HIV-LTR的转录通过Tat将融合蛋白靶向到TAR区域而被强有力的抑制。
图4显示了TatWt和FBI-1、FBI-1-TatdMt、TatdMt对启动子的功能。FBI-1本身不表现出转录抑制功能。TatdMt仅表现出竞争性抑制功能。当提供等量的FBI-1和TatdMt时，表现出大约50％的抑制功能(b8)。但FBI-1-TatdMt在1ng时表现出抑制功能，并且在3ng时表现出50％的抑制功能。FBI-1-TatdMt在81ng时表现出与不存在TatWt时相同的抑制功能，因此完全抑制TatWt介导的转录。不过，FBI-1-TatdMt在243ng时比不存在TatWt时表现出较低水平的表达抑制。
具体实施例方式
本发明将以参照伴随附图详细描述示范性实施方式的方式予以说明，其仅仅是提供用于解释而不是限制本发明的。
HIV RNA合成的调控是复杂的，它需要各种病毒LTR中的顺式作用元件、病毒转录激活子和细胞蛋白之间的相互作用。这种相互作用控制基础水平的RNA转录，并诱导表达高数量的病毒基因。HIV-LTR启动子的转录主要由在不存在病毒蛋白Tat的情况下识别邻近启动子的细胞蛋白Sp1转录因子调控。
诱导激活NF-κB的各种信号通过与位于Sp1-结合的GC-框上游的顺式作用元件相互作用激活转录。其他蛋白(辅因子)通过调控蛋白例如Sp1或NF-κB的活性促进具有潜伏性HIV前病毒的细胞中的转录和复制。
HIV编码的Tat蛋白通过增加转录的起始或延伸激活转录，而且他们对于复制很重要。Tat需要TAR，一种存在于病毒转录本5’端的顺式作用RNA元件。Tat还可高度的促进所有在5’端具有TAR茎环RNA结构的HIV转录本产生病毒RNA。
作为最近研究的结果，Sp1通过锌指DNA结合结构域与HDAC和POZ-结构域的相互作用被抑制，并且还可通过与MeCP2的相互作用被抑制。该研究证明一种称之为FBI-1的POZ-结构域转录因子通过与Sp1和Tat相互作用并结合到HIV-LTR的IST区域(短链诱导区域)抑制HIV转录。这些蛋白与辅阻遏蛋白例如mSin3A、SMRT/N-CoR和HAD相互作用通过浓缩染色质抑制转录。从而，如果这些蛋白被靶向到HIV-1 LTR，可通过阻断Sp1的活性、浓缩HIV启动子附近的染色质以及靶向能够结合启动子区域的多肽来调控Sp1和Tat介导的转录活性。
为了靶向转录抑制蛋白到核心启动子区域，制备了融合转录抑制蛋白与TatWt的表达质粒。本发明的发明人制备了不抑制细胞中HIV LTR(启动子)转录的TatWt融合蛋白，并且TatWt融合蛋白通过该融合蛋白的TatWt组分起着病毒RNA转录激活因子的作用。与TatWt融合的转录抑制蛋白的转录刺激因子功能被认为在转录延伸步骤中的有力作用足以补偿抑制转录起始的抑制剂的作用。不过，尽管融合蛋白包括两种不同的蛋白，其可以通过TatWt组分靶向到TAR。因此，蛋白可用作到核心LTR启动子区域的靶向工具。
因而，本发明利用Tat蛋白突变体(TatdMtTatK28A&K50A)，它强有力的结合TAR，但是不与TAK(或称之为‘PTEF’)，一种转录激活中重要的细胞因子相互作用。
HIV最长的Tat包括101个氨基酸。由于存在许多变化各异的突变体，很难辨别哪种Tat是野生型的。本发明利用Lys-28和Lys-50被替换为丙氨酸的Tat蛋白，并且利用了包含72或73个氨基酸的Tat多肽。不过，除了上文提及的Tat之外，Tat多肽的片段或其他Tat突变体具有与上述相似的功能。
在猿CV-1细胞中，甚至是Tat(300ng表达质粒)过量表达的情况下，TatdMt融合蛋白显著的抑制HIV基因组的转录。该实验结果是关于显性-阴性形式的蛋白的一个划时代性的发现。大多数Tat融合蛋白不管其结合TatdMt的方向如何都具有功能。特别的，HDAC-TatdMt、FBI-1-TatdMt融合蛋白强有力的抑制转录(见图3b)。这种融合蛋白在HIV-1 LTR-氯霉素乙酰基转移酶基因被插入到人基因组的HeLa细胞中强有力的起抑制剂的作用。尽管Tat蛋白本身可46倍的激活转录，MeCP2、HDAC、POZ-或FBI-1-TatdMt融合蛋白强有力的抑制TatWt的转录激活作用，甚至是在300ng TatWt过表达条件下。这些融合蛋白中的HDAC-TatdMt和FBI-1-TatdMt在HeLa细胞中也完全抑制Tat的转录激活作用。这一结果表明融合蛋白可抑制以前病毒状态插入人基因组的HIV的转录，从而有效抑制HIV的增殖。
因为本发明的融合蛋白抑制HIV LTR启动子的转录，而生产病毒复制的所有成分所必需的RNA不能产生，继之而来的必然是抑制病毒蛋白的表达和HIV的复制。
实施例1TatWt质粒的制备HIV-1 LTR CAT融合质粒(pUC3R-III CAT)通过克隆大约720bp的HIV-LTR到pCAT-基础质粒中(Promega Co.)予以制备。HIV-1 LTR荧光素酶融合质粒(pUC3R-III-Luc)通过克隆720bp的、用Xho I HidIII限制性内切酶消化的pUC3R-III CAT的片段到pGL3-基础质粒中(Xho I HidIII，Promega Co.)予以制备。
本发明中与Tat(包含86个氨基酸)、TatdMt(包含73个氨基酸)、HDAC1、MeCP2、FBI-1、POZ-结构域以及TatWt或突变体TatdMt(TatK28AK50A)融合的融合蛋白通过PCR法扩增相应的基因、然后将基因克隆到哺乳动物表达载体pCDNA3.0(Inivtorgen)中予以制备。为了制备pcDNA3.0 TatWt(86个氨基酸)，该基因通过PCR法扩增，利用模板pET-15b-TATWt(86aa，由韩国Hallym大学的Park Jinseo博士提供，HIVHBX2R型)和5’引物GATCGAATTCATGGAGCCAGTACCTAGACTAGAGCCC，3’引物GATCTCTAGATCATTCCTTCGGGCCTGTCGGGTCCCCTC。
反应条件如下模板94℃变性3分钟、30个循环的扩增反应(94℃30秒；60℃1分钟；72℃30秒)，随后是72℃3分钟的扩增后反应。在用两个限制性内切酶EcoR I和Xba I对PCR产物和表达载体pcDNA3.0进行消化后，用T4 DNA连接酶连接消化产物，然后通过转化方法引入到E.coliDH5a中，并且用碱裂解法制备pcDNA3.0 TatWt(86个氨基酸)质粒。
下一步，为了制备pcDNA3.0 TatdMt(73aa)，利用了与上文提及的方法相似的方法。不过，pcDNA3.0 TatdMt的PCR扩增是利用模板HIV Tat基因(Kiernan等，EMBO J.186106-6118，1999)和5’引物GAT CGAATT CAT GGA GCC AGTAAATCC TAG CCTAG，3’引物GATCTCTAGATCAGCTTTGATAGAGAAACTTGATG(包含终止密码子)。为了制备X-TatdMT的HDAC、MeCP2、POZ-或FBI-1融合蛋白，非-Tat蛋白用PCR法通过扩增相应的人cDNA、然后将扩增的基因克隆到pcDNA3.0 TatdMt中予以制备。反应条件如下模板95℃变性3分钟、30个循环的扩增反应(95℃30秒；62℃1分钟；72℃7分钟)以及72℃3分钟的扩增后反应，并且PCR反应利用下列引物进行MeCP25’引物GATCGGATCCACCATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCAG3’引物GATCGAATTCGCTAACTCTCTCGGTCACGGGCGTCCGHCAC15’引物GATCAAGCTTACCATGGCGCAGACGCAGGGCACCCGGAGG
3’引物GATCGAATTCGGCCAACTTGACCTCCTCCTTGACCCCTTTGPOZ-结构域5’引物GATCAAGCTTACCATGGCCGGCGGCGTGGACGGCCCCATC3’引物GATCGAATTCCTGCCGGTCCAGGAGGTCGGCGCACACGFBI-15’引物GATCAAGCTTACCATGGCCGGCGGCGTGGACGGCCCCATC3’引物GATCAGATTCGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTT.
用BamH I-EcoR I(MeCP2)或HindIII-EcoR I(HDAC 1、POZ、FBI-1)消化扩增产物，然后克隆到pcDNA3.0 TatdMt/BamH I-EcoR I或pcDNA3.0TatdMt/HindIII-EcoR I。
为了制备pcDNA3.0 TatdMt-X的HDAC、MeCP2、POZ-、FBI-1融合蛋白，利用了与上文提及的方法相似的方法。不过，pcDNA3.0 TatdMt(73aa)的PCR扩增是利用模板HIV Tat基因(Kiernan等，EMBO J.186106-6118，1999)和5’引物GATCGGATCCACCATGGACGGAGTAAATCCTAGCCTAG3’引物GATCGAATTCGGGCTTTGATAGAGAAACTTGATG。
pcDNA3.0 TatdMt-x家族的非-Tat部分在与上文提及的相同的条件下通过扩增相应的人cDNA、并用EcoR I-Xba I消化扩增产物、以及将消化产物克隆到pcDNA3.0 TatdMt/EcoR I-Xba I中予以制备。扩增反应中所用的引物组合如下MeCP25’引物GATCGAATTCATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCTCA3’引物GATCTCTAGATCAGCTAACTCTCTCGGTCACGGGC
HDAC15’引物GATCGAATTCATGGCGCAGACGCAGGGCACCCGGA3’引物GATCTCTAGATCAGGCCAACTTGACCTCCTCCTTGPOZ-结构域5’引物GATCGAATTCATGGCCGGCGGCGGCGTGGACGGCC3’引物GATCTCTAGATCACTGCCGGTCCAGGAGGTCGGCGFBI-15’引物GATCGAATTCATGGCCGGCGGCGGCGTGGACGGCC3’引物GATCTCTAGATCAGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTT.
实施例2瞬时表达分析CV-1细胞培养于具10％FBS的DMEM培养基中。当细胞生长到足以覆盖培养50-60％的容器底部面积时，用lipopectamin plus试剂(Gibco-BRL)将包含的0.6μg pHIV-LTR-荧光素酶质粒、pCMV-β半乳糖苷酶质粒、TatWt、以及一种选自由HDAC1-TatdMt、MeCP2-TatdMt、FBI-1-TatdMt、POZ-结构域-TatdMt、TatdMt-HDAC1、TatdMt-MeCP2、TatdMt-FBI-1和TatdMt-POZ-结构域组成的组的哺乳动物表达的pCDNA3.0质粒的混合物引入到细胞中。
为在HIV-LTR-CAT插入到基因组中的HeLa细胞中进行抑制基因组表达的实验，用lipopectamin plus试剂(Gibco-BRL)将包括300ng Tat表达质粒和300ng本发明的各种融合蛋白表达质粒的混合物引入到培养于具10％FBS的DMEM培养基中的细胞中。细胞培养24小时，并分析报告基因的表达。利用同时引入和表达的β-半乳糖苷酶标准化质粒引入细胞的效率和回收细胞提取物的偏差。本发明的结果显示于图2～4中。
在图2中，与TatWt融合的融合蛋白可能不在转录水平抑制HIV-LTR基因组的表达，但这些融合蛋白可通过TatWt组份被靶向到HIV LTR启动子区域，从而通过促进转录延伸而增强表达。
在图3中，与TatdMt(含有72或73个氨基酸的突变体，其中Tat蛋白的2个氨基酸序列被突变)融合的融合蛋白在存在300ng TatWt表达质粒时强有力的抑制HIV-LTR基因组的转录，从而在不存在Tat时将表达降至低水平。该结果揭示HeLa细胞中如同前病毒状态的HIV-LTR的转录通过Tat将融合蛋白靶向到TAR区域而被强有力的抑制。
在图4中，FBI-1本身不表现出转录抑制功能。TatdMt仅表现出竞争性结合于同一位点(TAR)的竞争性抑制。当提供等量的FBI-1和TatdMt时，表现出大约50％的抑制功能(b8)。但FBI-1-TatdMt在1ng时表现出抑制功能，并且在3ng时表现出50％的抑制功能。FBI-1-TatdMt在81ng时表现出与不存在TatWt时相同的抑制功能，因此完全抑制介由TatWt的转录。不过，FBI-1-TatdMt在243ng时比不存在TatWt时表现出较低水平的表达抑制。
在细胞核中，宿主细胞蛋白例如Sp1、NF-KB作用于HIV的转录调控区。结果产生短RNA链(短转录本)的病毒RNA，并且它停留在该区域附近(代表结合聚合酶II的RNA链)。如果病毒蛋白例如Tat结合TAR区域，则RNA合成被高度促进。结果大量的病毒基因组(RNA)得以产生，并且利用所生成的病毒基因组(RNA)，对于病毒复制所必需的蛋白组份也得以产生。因此，抑制病毒复制最有效的方法是调控Sp1、NF-KB、Tat的功能。
本发明提供了一种方法，通过将该蛋白与选自由抑制转录因子如Sp1、NF-κB的蛋白；辅阻遏物或与辅阻遏物相互作用的蛋白；HDAC、或与HDAC相互作用通过强有力的浓缩染色质而抑制转录活动的蛋白；以及具有病毒启动子区结合活性的蛋白例如锌指蛋白组成的组的蛋白融合，当识别HIV短转录本区域(如TAR)的蛋白被靶向到HIV转录调控启动子区域的时候，可在病毒LTR区强有力的抑制病毒RNA的产生(转录步骤)。
本发明是第一个证明通过靶向转录抑制蛋白组到HIV-LTR强有力的抑制HIV LTR转录活动的方法的研究。通过抑制病毒RNA基因组从作为前病毒状态存在于宿主细胞基因组中的DNA类型的病毒LTR(启动子)表达，本发明还基本上抑制了病毒复制所必需的成分(基因组、蛋白)的产生。因而，本发明可以基本上抑制病毒的增殖和抗性病毒的产生。特别的，HDAC-TatdMt和FBI-1-TatdMt融合蛋白完全封阻了产生病毒基因组的步骤。
所以，本发明克服常规药物的问题的艾滋病治疗制剂是治疗艾滋病有效的蛋白或基因治疗制剂。
序列表<110>许晚旭<120>HIV转录阻遏物及其方法<150>KR2001-21449<151>2001-04-20<150>KR2002-21307<151>2002-04-18<160>18<170>Kopatent In 1.71<210>1<211>73<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>73个氨基酸Tat突变体<400>1Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Leu Ile65 70<210>2
<211>72<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>72个氨基酸Tat突变体<400>2Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys Leu65 70<210>3<211>561<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>MeCP2-Tat dMt融合蛋白<400>3Met Val Ala Gly Met Leu Gly Leu Arg Glu Glu Lys Ser Glu Asp Gln1 5 10 15Asp Leu Gln Gly Leu Lys Asp Lys Pro Leu Lys Phe Lys Lys Val Lys20 25 30
Lys Asp Lys Lys Glu Glu Lys Glu Gly Lys His Glu Pro Val Gln Pro35 40 45Ser Ala His His Ser Ala Glu Pro Ala Glu Ala Gly Lys Ala Glu Thr50 55 60Ser Glu Gly Ser Gly Ser Ala Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ala Ser65 70 75 80Pro Lys Gln Arg Arg Ser Ile Ile Arg Asp Arg Gly Pro Met Tyr Asp85 90 95Asp Pro Thr Leu Pro Glu Gly Trp Thr Arg Lys Leu Lys Gln Arg Lys100 105 110Ser Gly Arg Ser Ala Gly Lys Tyr Asp Val Tyr Leu Ile Asn Pro Gln115 120 125Gly Lys Ala Phe Arg Ser Lys Val Glu Leu Ile Ala Tyr Phe Glu Lys130 135 140Val Gly Asp Thr Ser Leu Asp Pro Asn Asp Phe Asp Phe Thr Val Thr145 150 155 160Gly Arg Gly Ser Pro Ser Arg Arg Glu Gln Lys Pro Pro Lys Lys Pro165 170 175Lys Ser Pro Lys Ala Pro Gly Thr Gly Arg Gly Arg Gly Arg Pro Lys180 185 190Gly Ser Gly Thr Thr Arg Pro Lys Ala Ala Thr Ser Glu Gly Val Gln195 200 205Val Lys Arg Val Leu Glu Lys Ser Pro Gly Lys Leu Leu Val Lys Met210 215 220Pro Phe Gln Thr Ser Pro Gly Gly Lys Ala Glu Gly Gly Gly Ala Thr225 230 235 240Thr Ser Thr Gln Val Met Val Ile Lys Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys245 250 255
Ala Glu Ala Asp Pro Gln Ala Ile Pro Lys Lys Arg Gly Arg Lys Pro260 265 270Gly Ser Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Lys Lys Ala Val275 280 285Lys Glu Ser Ser Ile Arg Ser Val Gln Glu Thr Val Leu Pro Ile Lys290 295 300Lys Arg Lys Thr Arg Glu Thr Val Ser Ile Glu Val Lys Glu Val Val305 310 315 320Lys Pro Leu Leu Val Ser Thr Leu Gly Glu Lys Ser Gly Lys Gly Leu325 330 335Lys Thr Cys Lys Ser Pro Gly Arg Lys Ser Lys Glu Ser Ser Pro Lys340 345 350Gly Arg Ser Ser Ser Ala Ser Ser Pro Pro Lys Lys Glu His His His355 360 365His His His His Ser Glu Ser Pro Lys Ala Pro Val Pro Leu Leu Pro370 375 380Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Glu Pro Glu Ser Ser Glu Asp Pro Thr385 390 395 400Ser Pro Pro Glu Pro Gln Asp Leu Ser Ser Ser Val Cys Lys Glu Glu405 410 415Lys Met Pro Arg Gly Gly Ser Leu Glu Ser Asp Gly Cys Pro Lys Glu420 425 430Pro Ala Lys Thr Gln Pro Ala Val Ala Thr Ala Ala Thr Ala Ala Glu435 440 445Lys Tyr Lys His Arg Gly Glu Gly Glu Arg Lys Asp Ile Val Ser Ser450 455 460Ser Met Pro Arg Pro Asn Arg Glu Glu Pro Val Asp Ser Arg Thr Pro
465 470 475 480Val Thr Glu Arg Val Ser Glu Phe Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu485 490 495Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn500 505 510Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr515 520 525Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg530 535 540Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr His Gln Val Ser Leu Ser Lys Leu545 550 555 560Ile<210>4<211>557<212>PRT<213>人造序列<220>
<223>HDAC1-TAT dMt融合蛋白<400>4Met Ala Gln Thr Gln Gly Thr Arg Arg Lys Val Cys Tyr Tyr Tyr Asp1 5 10 15Gly Asp Val Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Pro Met Lys Pro20 25 30His Arg Ile Arg Met Thr His Asn Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr35 40 45Arg Lys Met Glu Ile Tyr Arg Pro His Lys Ala Asn Ala Glu Glu Met
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<220>
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<223>TAT dMt-FBI-1融合蛋白
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<223>MeCP2-TAT dMt融合蛋白的碱基序列<400>11atggtagctg ggatgttagg gctcagggaa gaaaagtcag aagaccagga cctccagggc60ctcaaggaca aacccctcaa gtttaaaaag gtgaagaaag ataagaaaga agagaaagag 120ggcaagcatg agcccgtgca gccatcagcc caccactctg ctgagcccgc agaggcaggc 180aaagcagaga catcagaagg gtcaggctcc gccccggctg tgccggaagc ttctgcctcc 240cccaaacagc ggcgctccat catccgtgac cggggaccca tgtatgatga ccccaccctg 300cctgaaggct ggacacggaa gcttaagcaa aggaaatctg gccgctctgc tgggaagtat 360gatgtgtatt tgatcaatcc ccagggaaaa gcctttcgct ctaaagtgga gttgattgcg 420tacttcgaaa aggtaggcga cacatccctg gaccctaatg attttgactt cacggtaact 480gggagaggga gcccctcccg gcgagagcag aaaccaccta agaagcccaa atctcccaaa 540gctccaggaa ctggcagagg ccggggacgc cccaaaggga gcggcaccac gagacccaag 600gcggccacgt cagagggtgt gcaggtgaaa agggtcctgg agaaaagtcc tgggaagctc 660cttgtcaaga tgccttttca aacttcgcca gggggcaagg ctgagggggg tggggccacc 720acatccaccc aggtcatggt gatcaaacgc cccggcagga agcgaaaagc tgaagctgac 780
cctcaggcca ttcccaagaa acggggccga aagccgggga gtgtggtggc agccgctgcc840gccgaggcca aaaagaaagc cgtgaaggag tcttctatcc gatctgtgca ggagaccgta900ctccccatca agaagcgcaa gacccgggag acggtcagca tcgaggtcaa ggaagtggtg960aagcccctgc tggtgtccac cctcggtgag aagagcggga aaggactgaa gacctgtaag 1020agccctgggc ggaaaagcaa ggagagcagc cccaaggggc gcagcagcag cgcctcctca 1080ccccccaaga aggagcacca ccaccatcac caccactcag agtccccaaa ggcccccgtg 1140ccactgctcc cacccctgcc cccacctcca cctgagcccg agagctccga ggaccccacc 1200agcccccctg agccccagga cttgagcagc agcgtctgca aagaggagaa gatgcccaga 1260ggaggctcac tggagagcga cggctgcccc aaggagccag ctaagactca gcccgcggtt 1320gccaccgccg ccacggccgc agaaaagtac aaacaccgag gggagggaga gcgcaaagac 1380attgtttcat cctccatgcc aaggccaaac agagaggagc ctgtggacag ccggacgccc 1440gtgaccgaga gagttagcga attcatggag ccagtaaatc ctagcctaga gccctggaag 1500catccaggaa gtcagcctaa aactgcttgt accaattgct attgtgcaaa gtgttgcttt 1560cattgccaag tttgtttcat aacaaaagcc ttaggcatct cctatggcag ggcaaagcgg 1620agacagcgac gaagacctcc tcaaggcagt cagactcatc aagtttctct atcaaagctg 1680atctag 1686<210>12<211>1674<212>DNA<213>人造序列<220>
<223>HDAC1-TAT dMt融合蛋白的碱基序列
<400>12atggcgcaga cgcagggcac ccggaggaaa gtctgttact actacgacgg ggatgttgga 60aattactatt atggacaagg ccacccaatg aagcctcacc gaatccgcat gactcataat 120ttgctgctca actatggtct ctaccgaaaa atggaaatct atcgccctca caaagccaat 180gctgaggaga tgaccaagta ccacagcgat gactacatta aattcttgcg ctccatccgt 240ccagataaca tgtcggagta cagcaagcag atgcagagat tcaacgttgg tgaggactgt 300ccagtattcg atggcctgtt tgagttctgt cagttgtcta ctggtggttc tgtggcaagt 360gctgtgaaac ttaataagca gcagacggac atcgctgtga attgggctgg gggcctgcac 420catgcaaaga agtccgaggc atctggcttc tgttacgtca atgatatcgt cttggccatc 480ctggaactgc taaagtatca ccagagggtg ctgtacattg acattgatat tcaccatggt 540gacggcgtgg aagaggcctt ctacaccacg gaccgggtca tgactgtgtc ctttcataag 600tatggagagt acttcccagg aactggggac ctacgggata tcggggctgg caaaggcaag 660tattatgctg ttaactaccc gctccgagac gggattgatg acgagtccta tgaggccatt 720ttcaagccgg tcatgtccaa agtaatggag atgttccagc ctagtgcggt ggtcttacag 780tgtggctcag actccctatc tggggatcgg ttaggttgct tcaatctaac tatcaaagga 840cacgccaagt gtgtggaatt tgtcaagagc tttaacctgc ctatgctgat gctgggaggc 900ggtggttaca ccattcgtaa cgttgcccgg tgctggacat atgagacagc tgtggccctg 960gatacggaga tccctaatga gcttccatac aatgactact ttgaatactt tggaccagat1020ttcaagctcc acatcagtcc ttccaatatg actaaccaga acacgaatga gtacctggag1080aagatcaaac agcgactgtt tgagaacct tagaatgctgc cgcacgcacc tggggtccaa1140atgcaggcga ttcctgagga cgccatccct gaggagagtg gcgatgagga cgaagacgac1200
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<223>POZ-TAT dMt融合蛋白的碱基序列<400>13atggccggcg gcgtggacgg ccccatcggg atcccgttcc ccgaccacag cagcgacatc 60ctgagtgggc tgaacgagca gcggacgcag ggcctgctgt gcgacgtggt gatcctggtg120gagggccgcg agttccccac gcaccgctcg gtgctggccg cctgcagcca gtacttcaag180aagctgttca cgtcgggcgc cgtggtggac cagcagaacg tgtacgagat cgacttcgtc240agcgccgagg cgctcaccgc gctcatggac ttcgcctaca cggccacgct caccgtcagc300acagccaacg tgggtgacat cctcagcgcc gcccgcctgc tggagatccc cgccgtgagc360cacgtgtgcg ccgacctcct ggaccggcag gaattcatgg agccagtaaa tcctagccta420
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<223>FBI-1-TAT dMt融合蛋白的碱基序列<400>14atggccggcg gcgtggacgg ccccatcggg atcccgttcc ccgaccacag cagcgacatc 60ctgagtgggc tgaacgagca gcggacgcag ggcctgctgt gcgacgtggt gatcctggtg120gagggccgcg agttccccac gcaccgctcg gtgctggccg cctgcagcca gtacttcaag180aagctgttca cgtcgggcgc cgtggtggac cagcagaacg tgtacgagat cgacttcgtc240agcgccgagg cgctcaccgc gctcatggac ttcgcctaca cggccacgct caccgtcagc300acagccaacg tgggtgacat cctcagcgcc gcccgcctgc tggagatccc cgccgtgagc360cacgtgtgcg ccgacctcct ggaccggcag atcctggcgg ccgacgcggg cgccgacgcc420gggcagctgg accttgtaga tcaaattgat cagcgcaacc tcctccgcgc caaggagtac480ctcgagttct tccagagcaa ccccatgaac agcctgcccc ccgcggccgc cgccgccgct540gccagcttcc cgtggtccgc ctttggggcg tccgatgatg acctggatgc caccaaggag600gccgtggccg ccgctgtggc cgccgtggcc gcgggcgact gcaacggctt agacttctat660
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<223>TAT dMt-MeCP2融合蛋白的碱基序列<400>15atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcccgaat tcatggtagc tgggatgtta 240gggctcaggg aagaaaagtc agaagaccag gacctccagg gcctcaagga caaacccctc 300aagtttaaaa aggtgaagaa agataagaaa gaagagaaag agggcaagca tgagcccgtg 360cagccatcag cccaccactc tgctgagccc gcagaggcag gcaaagcaga gacatcagaa 420gggtcaggct ccgccccggc tgtgccggaa gcttctgcct cccccaaaca gcggcgctcc 480atcatccgtg accggggacc catgtatgat gaccccaccc tgcctgaagg ctggacacgg 540aagcttaagc aaaggaaatc tggccgctct gctgggaagt atgatgtgta tttgatcaat 600ccccagggaa aagcctttcg ctctaaagtg gagttgattg cgtacttcga aaaggtaggc 660gacacatccc tggaccctaa tgattttgac ttcacggtaa ctgggagagg gagcccctcc 720
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<223>TAT dMt-HDAC1融合蛋白的碱基序列<400>16atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca120aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcccgaat tcatggcgca gacgcagggc240acccggagga aagtctgtta ctactacgac ggggatgttg gaaattacta ttatggacaa300ggccacccaa tgaagcctca ccgaatccgc atgactcata atttgctgct caactatggt360ctctaccgaa aaatggaaat ctatcgccct cacaaagcca atgctgagga gatgaccaag420taccacagcg atgactacat taaattcttg cgctccatcc gtccagataa catgtcggag480tacagcaagc agatgcagag attcaacgtt ggtgaggact gtccagtatt cgatggcctg540tttgagttct gtcagttgtc tactggtggt tctgtggcaa gtgctgtgaa acttaataag600cagcagacgg acatcgctgt gaattgggct gggggcctgc accatgcaaa gaagtccgag660gcatctggct tctgttacgt caatgatatc gtcttggcca tcctggaact gctaaagtat720caccagaggg tgctgtacat tgacattgat attcaccatg gtgacggcgt ggaagaggcc780ttctacacca cggaccgggt catgactgtg tcctttcata agtatggaga gtacttccca840ggaactgggg acctacggga tatcggggct ggcaaaggca agtattatgc tgttaactac900ccgctccgag acgggattga tgacgagtcc tatgaggcca ttttcaagcc ggtcatgtcc960aaagtaatgg agatgttcca gcctagtgcg gtggtcttac agtgtggctc agactcccta 1020tctggggatc ggttaggttg cttcaatcta actatcaaag gacacgccaa gtgtgtggaa 1080tttgtcaaga gctttaacct gcctatgctg atgctgggag gcggtggtta caccattcgt 1140
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<223>TAT dMt-POZ融合蛋白的碱基序列<400>17atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca120aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcccgaat tcatggccgg cggcgtggac240ggccccatcg ggatcccgtt ccccgaccac agcagcgaca tcctgagtgg gctgaacgag300cagcggacgc agggcctgct gtgcgacgtg gtgatcctgg tggagggccg cgagttcccc360
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<223>TAT dMt-FBI-1融合蛋白的碱基序列<400>18atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact60gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aagcccgaat tcatggccgg cggcgtggac 240ggccccatcg ggatcccgtt ccccgaccac agcagcgaca tcctgagtgg gctgaacgag 300cagcggacgc agggcctgct gtgcgacgtg gtgatcctgg tggagggccg cgagttcccc 360acgcaccgct cggtgctggc cgcctgcagc cagtacttca agaagctgtt cacgtcgggc 420gccgtggtgg accagcagaa cgtgtacgag atcgacttcg tcagcgccga ggcgctcacc 480gcgctcatgg acttcgccta cacggccacg ctcaccgtca gcacagccaa cgtgggtgac 540atcctcagcg ccgcccgcct gctggagatc cccgccgtga gccacgtgtg cgccgacctc 600
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1.一种抑制HIV转录的融合蛋白，包含一种选自由强有力地抑制转录因子Sp1或NF-KB活性的多肽，通过浓缩染色质抑制转录活性的多肽，以及具有启动子结合活性的多肽所组成的组的转录抑制多肽或其化合物；一种识别表达调控区附近的RNA链或病毒LTR启动子顺式作用元件的多肽或其化合物。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其中强有力地抑制转录因子Sp1或NF-KB的转录活性的多肽或其化合物，或者通过浓缩染色质抑制转录活动的多肽或其化合物是选自由a)POZ-结构域家族蛋白；b)HDAC或其具有转录抑制活性的区域；c)MeCP2或MBP-家族蛋白；d)选自由polycom家族蛋白、mSin3A、SMRT、B-CoR和N-CoR所组成的组的辅阻遏蛋白；e)Sp1、Sp2、Sp3、Sp4或NF-KB DNA结合区域的DNA的多肽；以及f)具有结合HIV启动子区域的结合活性的蛋白所组成的组的一种多肽。
3.根据权利要求1的融合蛋白，其中识别表达调控区附近的RNA链或病毒LTR启动子顺式作用元件的多肽或其化合物是Tat蛋白SEQ ID NO1或2或其突变体。
4.根据前述权利要求的任意一项的融合蛋白，其中该融合蛋白是选自由SEQ ID NO3～10所示蛋白所组成的组。
5.一种包含SEQ ID NO11～18的碱基序列的核酸，其编码SEQ ID NO3～10中所示的多肽。
6.一个或多个包含用于编码根据权利要求5的融合蛋白的基因的重组载体，其中该重组载体是选自由pcDNA3.0-TatWt、pcDNA3.0-TatMt、pcDNA3.0-FBI-1、pcDNA3.0-MeCP2-TatWt、pcDNA3.0HDAC1-TatWt、pcDNA3.0FBI-1-TatWt、pcDNA3.0-POZ-TatWt、pcDNA3.0TarWt-MeCP2、pcDNA3.0TatWt-HDAC1、pcDNA3.0TatWt-FBI-1、pcDNA3.0TatWt-POZ、pcDNA3.0-MeCP2-TatdMt、pcDNA3.0HDAC1-TatdMt、pcDNA3.0FBI-1-TatdMt、pcDNA3.0-POZ-TatdMt、pcDNA3.0TatdMt-Mecp2、pcDNA3.0TatdMt-HDAC1、pcDNA3.0TatdMt-FBI-1和pcDNA3.0TatdMt-POZ所组成的组的载体。
7.一种根据权利要求1或4的抑制HIV转录的组合物，包括部分或全部融合蛋白。
8.一种利用融合蛋白通过在病毒LTR区抑制基因组转录和继而发生的病毒复制而抑制HIV增殖的方法。
全文摘要
本发明涉及抑制获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)病毒基因组(RNA)产生的阻遏物以及抑制其转录的方法。更具体的，本发明涉及抑制艾滋病病毒基因组(RNA)的、由选自包括强有力抑制蛋白例如Spl、NF－kB的活性的蛋白、通过强有力浓缩染色质抑制转录活动的蛋白、以及能够在艾滋病病毒启动子附近结合的蛋白的组的蛋白与识别短RNA链(TAR)的蛋白(例如Tat或Tat衍生物)构成的融合蛋白，以及利用他们抑制转录的方法。所说的融合蛋白利用识别短RNA链的蛋白作为载体，通过释放阻遏蛋白如Spl、NF－kB到HIV－1LTR表现出显著的抑制HIV－1基因组(RNA)产生的效果。本发明通过靶向转录－抑制融合蛋白到HIV LTR而表现出对HIV的转录抑制效果。
文档编号C07K14/16GK1604911SQ02808525
公开日2005年4月6日 申请日期2002年4月19日 优先权日2001年4月20日
发明者许晚旭, 郑得林 申请人:延世大学校