专利名称：减肥多肽的制作方法
技术领域：
本发明
背景技术：
1.技术领域肥胖症是各种组织中、特别是腹部脂肪组织中过量脂肪积聚所引起的病理障碍。过量高脂肪含量的食物吸收、缺乏运动、遗传、环境、和心理因素是肥胖症原因。
随着社会的发展，由于摄取食物的质和量以及遗传、环境和心理因素引起的肥胖症是一种病理障碍，其来自脂肪积聚，特别是在组织之间的脂肪组织中。肥胖症被看作是糖尿病、心血管疾病、以及缩短寿命预期、和其他疾病的直接或间接原因。预防和治疗肥胖症对于健康生活而言是一个重要的保健议题。
2.现有技术描述许多研究表明，通过饮食控制或有规律的运动来减少脂肪量可显著降低上述的健康危险。不幸的是，饮食控制和运动经常不能成功。这种失败与增加的食欲、喜欢高热量食物、减少体育活动、以及脂质生物合成有关的各种遗传因素紧密相关。尤其是，很难治疗具有高遗传危险因素的肥胖者。因此，需要新的能治疗肥胖症的治疗药剂。
虽然饮食控制和运动可预防潜在的肥胖症病人变成肥胖，但他们中的大多数最终将变成肥胖状态。因此，为了用相对简单的治疗方法来预防和治疗肥胖症，我们，在本发明中，发明了相对简单的多肽，其可以蛋白质药物或基因治疗药剂的形式用来预防或治疗肥胖症。
对于我们的生化和分子生物学研究而言，我们过去常常通过将由重组抗原和佐剂组成的悬浮液混合物对白兔进行皮下注射(4至6周，约2至4次)，并通过血清收集来制备多克隆抗体。在一个这类实验中，我们发现，特异性多肽(在下文称作“Synleptin”)诱导兔重量减轻超过20％。重量减轻的主要原因在于各种腹部区或器官、和皮下区中脂肪量的显著降低。这种多肽可用于预防或治疗肥胖症的药剂。
本发明提供生物减肥药。减肥激素、来普汀、蛋白质、饮食控制、和运动是传统的治疗肥胖症的方法。然而，本发明提供创新的减肥药，其能有效地阻遏体内脂肪或脂肪组织的形成。更具体地，本发明涉及蛋白质，当采用由72或86个氨基酸组成并与佐剂油混合的蛋白质注射进入皮下组织时，该蛋白质显著阻遏脂肪组织的产生。因为由71或86个氨基酸组成的部分Tat(HIV的转活性蛋白)多肽片段显示出减肥活性，因而由所有或部分101个氨基酸组成的Tat多肽也将具有减肥效应。本发明是基于下述新颖的发现Tat蛋白质阻遏体内脂肪生物合成。AIDS病人由于Tat蛋白质可变瘦。Tat多肽及其各种衍生物可以蛋白质药物或基因治疗药剂的形式用作预防或治疗肥胖症的药剂。
发明简述相应地，为了克服上述问题，本发明将提供用于有效预防或治疗肥胖症的生物治疗药剂。
为了完成上述目标，本发明提供多肽，以序列识别号1、2和3表示，或其药用盐。
在本发明中，序列识别号1的多肽是由101个氨基酸组成的Tat蛋白质，序列识别号2的多肽是自Tat的N末端的86个氨基酸，而序列识别号3的多肽是自Tat的N末端的71个氨基酸。然而，在本发明中，在各种组织中具有减肥活性的多肽包括上述Tat多肽和其不同的突变型多肽(存在多种类型的Tat天然或人工突变体)，包括其部分或整体。
本发明还提供具有序列识别号2和3表示的核苷酸序列的基因，其编码减肥多肽，以及pcDNA3.0 SynLeptin-1和-2或pGEX4TSynLeptin-1和-2融合基因重组质粒。
本发明的多肽可以各种蛋白质药物或基因治疗药剂的形式用作肥胖症的预防或治疗药剂。
图1说明给予Synleptin多肽所引起的重量减轻，其能够减肥和阻遏各种组织包括兔脂肪组织中的脂肪积聚。与对照组比较，SynLeptin-1多肽通过阻遏脂肪组织的形成诱导20％的重量减轻(见图3)。
图2说明当SynLeptin-1或2多肽每2周2次皮下注射12周龄的具有非功能性来普汀受体的ZFD大鼠重量减轻。大约30天后，虽然用生理盐水试验的对照组显示出8.5％的重量增加，用SynLeptin-1的治疗组显示出3.5％的重量增加，但相反地用SynLeptin-2的治疗组显示出4.3％的重量减轻。
图3表示尸体剖检结果。在图3A中，箭头表示试验兔的各种器官中脂肪组织的分布，该试验兔皮下注射SynLeptin-2多肽-佐剂混合物，每2周3次。在图3B中，箭头表示各种器官中脂肪组织的分布，皮下注射了生理盐水-佐剂混合物，每2周3次。如图3所示，本发明的多肽显著减少各种组织包括脂肪组织中的脂肪。
具体实施例方式
本发明将通过详述的示范性具体实施例，并参照附图进行说明，其仅仅是说明而不是限制本发明。
如上所述，肥胖症是各种组织中、特别是脂肪组织中过量脂肪积聚所引起的病理障碍。肥胖症是疾病如糖尿病、心血管疾病、以及缩短寿命预期、和其他疾病的直接或间接原因。据报道，如果病人可减少其体重的5％，则病人的上述疾病状态可显著改善、或甚至可以预防这些疾病。
高等脊椎动物精确地通过关节(articulate)激素系统来调节其脂肪组织的大小。与增加的体重(由于脂肪组织的扩大)成比例，调节体重或脂肪组织量的来普汀激素的浓度在血液中增加，并且来普汀结合于在脑的丘脑下部的受体。通过激素-受体相互作用会发生降低体重的一系列调节过程。该相互作用促进促黑素细胞激素的分泌并且还增加黑皮质素-4受体(melanocortin-4 receptor)的数目。通过降低食欲、增加体能发射、和刺激交感神经系统，这些过程导致食物吸收的降低。反之，与降低的体重(由于脂肪组织的减少)成比例，在血液中来普汀激素的量减少，并且脑的丘脑下部感觉到这种状态。感觉来普汀的低浓度的许多调节过程可通过增加神经肽Y浓度和Y-受体数目来增加体重。这些过程通过增加食欲、减少体能消耗、降低生殖能力和体温、以及增加副交感神经系统的刺激来导致食物吸收的增加。因此，如上所述，该精确的反馈调节机制调节脂肪组织的量和体重。
在调节体重方面具有主要作用的激素基因包括ob基因、db基因、和agouti基因。具体地，ob是16kDa多肽(称作来普汀)，其是在脂肪组织中合成并传输到血流中。如果引入突变，如编码多肽的基因的异常表达和功能、或细胞表面激素受体的数目和功能发生差错，则脂肪组织的大小会显著增加，并且体重也会增加。
先前的研究已表明，注射进血液的ob多肽(来普汀)对实验动物的肥胖症治疗具有明显的效果。应用于人的临床试验正在进行中。临床结果表明，在来普汀治疗后，一些肥胖者减掉7.1kg的体重，而其他人则没有减轻重量。进一步的研究表明，肥胖症生物学是复杂的，并由各种基因缺乏引起，包括ob受体(db)和ob基因。
利用大鼠进行的实验表明，ob多肽可通过增加葡萄糖代谢来治疗II型糖尿病，而与体重无关。
本发明的一个目标是通过阻遏脂肪在各种组织中的积聚来有效预防或治疗引起各种难治疾病的肥胖症。本发明的蛋白质对于来普汀有耐药性的肥胖病人可能具有治疗效应。来普汀通过结合于它的受体施加其生物功能，但由于SynLeptin-1和-2具有细胞膜可通透PTD(蛋白质转导域)，这些多肽可阻遏脂肪组织的产生而不管来普汀受体的数目和功能的变化。确实，用具有非功能性ob受体(db)的ZDF大鼠进行的动物实验表明，在用Synleptin多肽治疗后体重减少(图2)。因此，本发明的多肽对于来普汀有耐药性的肥胖病人可能具有治疗效应。
此外，虽然来普汀必须每日注射入血流以达到明显的重量减轻，但具有PTD域的SynLeptin-1和-2可非常容易地给予我们的身体。例如，2至3次皮下注射多肽-佐剂油混合物足以维持瘦状态150天以上。
虽然人们进行各种努力如饮食控制、严酷的运动、和化学治疗来预防和治疗肥胖症，但当他们停止那些努力时容易反弹到肥胖状态。为克服上述问题，提供本发明的Synleptin多肽，从而通过有力地阻遏脂肪在各种组织中的积聚或产生，以预防和治疗肥胖症。
实施例1制备pGEX4T-3-SynLeptin-1和-2表达质粒和生产SynLeptin-1和-2多肽对SynLeptin-1的PCR反应是利用有义引物(GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTAAATCCTAGCCTAG)和反义引物(GATCGAATTCCTTTGATAGAGAAACTTGATG)进行。PCR条件如下。Tat cDNA在94℃变性5分钟后，进行30个循环的扩增反应(94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒)并在72℃进行最终反应5分钟。从2.0％的琼脂糖胶分离PCR产物，纯化，然后用限制性内切酶BamH1和EcoR1进行消化。pGEX4T-3(Pharmacia公司)表达载体用相同的限制性内切酶(BamH1和EcoR1)进行消化，然后利用T4 DNA连接酶将经消化的载体连接于Synleptin-1 cDNA/BamH1-EcoR1片段。连接的混合物通过转化作用被引入表达宿主大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)。
为了制备pGEX4T-3-SynLeptin-2表达质粒(含有86个氨基酸的Tat多肽)，以及生产SynLeptin-2蛋白质，PCR反应是利用有义引物(GATCGGATCCACCATGGAGCCAGTACCTAGACTAGAGC)、反义引物(GATCGAATTCTTCCTTCGGGCCTGTCGGGTCCCCT)、以及Tat cDNA作为模板进行。制备pGEX4T-3-SynLeptin-2的PCR条件和方法与上述条件和方法相同。
经pGEX4T-3-SynLeptin-1或-2转染表达宿主细菌(大肠杆菌BL21 DE3)接种于含有100μg/ml的氨苄西林的TY液体培养基上，并培养过夜。将1ml过夜细菌培养物加入含有100μg/ml的氨苄西林的100ml的TY液体培养基中，然后培养1.5小时。融合蛋白的合成是在30℃用0.2mM IPTG诱导10小时。SynLetin-l和-2蛋白质是用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析法进行纯化。
pcDNA3.0 SynLeptin-1和-2哺乳动物表达载体是用下述方法进行制备。pcDNA3.0(Clontech，克隆技术)质粒用限制性内切酶BamH1和EcoR1进行消化。上述Synleptin cDNA-1或-2基因(大约220个碱基对)的BamH1-EcoR1片段和经消化的质粒用T4 DNA连接酶进行连接，然后通过转染法引入大肠杆菌DH5α。重组质粒是用碱性溶胞作用法进行制备。
实施例2通过阻遏脂肪组织的积聚来降低体重的动物实验将具有1.2kg体重的4只白兔分成对照组和实验组，每组分别有2只兔。纯化的SynLeptin-1或-2蛋白质(500-700μg)或生理盐水与2ml佐剂(Sigma)进行混合，然后皮下注射兔的4个不同部位。2周后，注射相同量的蛋白质-佐剂混合物，然后在2周后进行第3次注射。其后，在10天后测量体重减少。结果如下。用SynLeptin-1治疗的实验组的体重分别是1.8kg和2.08kg(平均1.94kg)，而对照组的体重分别是2.5kg和2.45kg(平均2.48kg)。与对照组比较，实验组显示大约减少22％的体重(见图1)。我们还用SynLeptin-1或-2多肽治疗具有非功能性来普汀受体基因的ZDF大鼠30天(图2)。用SynLeptin-1治疗的实验组显示3.5％的体重增加。相反，对照组显示8.5％的体重增加。特别是，与对照组相比较，用SynLeptin-2治疗的实验组反而显示4.3％的体重下降(图2)。
实施例3实验动物的尸体剖检通过尸体剖检和病理检查，我们分析了体重下降的原因。在尸体剖检前，对照和实验组的兔均显示出正常的活动或行为。当处死兔并进行尸体剖检时，在它们的器官中未观察到病理异常。然而，不仅在腹部和皮下脂肪组织中，而且在各种器官周围的组织中，脂肪量的显著减少是明显的。特别地，腹部脂肪组织的尺寸显著减小(图3)。
本发明的蛋白质通过阻遏各种动物组织中脂肪组织的形成对预防和治疗肥胖症具有强效应。因此，本发明的蛋白质可以蛋白质药物或基因治疗药剂的形式用作减肥药。
序列表<110>许晚旭<120>减肥多肽<150>KR2001-21450<151>2001-04-20<160>6<170>Kopatentln 1.71<210>1<211>101<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>101个氨基酸Tat蛋白<400>1Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Met Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr50 55 60His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu Gln Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu85 90 95Thr Asp Pro Phe Asp
100<210>2<211>86<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>86个氨基酸Tat突变异种<400>2Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Met Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr50 55 60His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Thr Ser Gln Ser Arg Gly Asp65 70 75 80Pro Thr Gly Pro Lys Glu85<210>3<211>71<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>71个氨基酸Tat突变异种
<400>3Met Glu Pro Val Asn Pro Ser Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser1 5 10 15Gln Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Ala Lys Cys Cys Phe20 25 30His Cys Gln Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly35 40 45Arg Ala Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Gly Ser Gln Thr50 55 60His Gln Val Ser Leu Ser Lys65 70<210>4<211>303<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>101个氨基酸Tat的碱基序列<400>4atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcatgaca120aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcatcag180aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcaaccca cctcccaatc ccgaggggac240ccgacaggcc cgaaggaaca gaagaagaag gtggagagag agacagagac agatccattc300gat 303
<210>5<211>258<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>86氨基酸Tat的碱基序列<400>5atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact60gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcatgaca120aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcatcag180aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcaaccca cctcccaatc ccgaggggac240ccgacaggcc cgaaggaa 258<210>6<211>213<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>71个氨基酸Tat的碱基序列<400>6atggagccag taaatcctag cctagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact60gcttgtacca attgctattg tgcaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca120aaagccttag gcatctccta tggcagggca aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa180ggcagtcaga ctcatcaagt ttctctatca aag 21权利要求
1.一种用序列识别号1表示的具有脂肪组织降低活性的多肽、或其药用盐。
2.根据权利要求1所述的具有脂肪组织降低活性的多肽，其中所述多肽是由从N末端开始的86个氨基酸组成，以序列识别号2表示，或其药用盐。
3.根据权利要求1所述的具有脂肪组织降低活性的多肽，其中所述多肽是由自N末端的71个氨基酸组成，以序列识别号3表示，或其药用盐。
4.以序列识别号4至6表示的基因，分别编码权利要求1至3所述的多肽。
5.重组质粒、pcDNA3.0 SynLeptin-1和-2、或pGEX4TSynLeptin-1和-2，包括权利要求4所述基因。
6.根据权利要求1、2、或3所述的具有脂肪组织降低活性的多肽，其中所述多肽是Tat多肽或其不同的突变或变异型，包括其部分或整体。
全文摘要
本发明涉及用于抑制体内脂肪组织产生的减肥多肽。该减肥多肽可用作肥胖症预防疫苗或治疗药剂以及用于治愈糖尿病。
文档编号C07K14/47GK1520422SQ02808528
公开日2004年8月11日 申请日期2002年4月19日 优先权日2001年4月20日
发明者许晚旭, 李东奇 申请人:延世大学校