蛋白质的电泳方法

专利名称：蛋白质的电泳方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的快速且高灵敏度的电泳方法。
背景技术：
蛋白质一般是根据SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)法进行大小分离和检测。将其用于毛细管电泳即为SDS-CGE(毛细管凝胶电泳)，作为将其进一步应用于微芯片型电泳的方法，可以例举通过使用Protein 200试剂盒的Agilent 2100 Bioanalyzer(AgilentTechnologies公司生产)进行的分析。蛋白质在天然状态下带有各种电荷，认为带正电荷的蛋白质在正电场下不发生移动。因此，按照上述现有方法，通常必须进行蛋白质的热变性处理作为预处理，使全部被测蛋白质带负电荷。热变性处理通常通过下述方法实现将蛋白质置于表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)溶液和2-巯基乙醇或二硫苏糖醇等还原剂中，在95～100℃下加热数分钟。2-巯基乙醇或二硫苏糖醇用来切断S-S键，且SDS用来使所有蛋白质的电荷都变为负电荷。
因此，即使通过微芯片型电泳能够使分析步骤快速化，也不能缩短SDS-PAGE法和SDS-CGE法等现有方法中该预处理步骤的时间，存在操作烦锁的缺点。因此，期望有更快速的蛋白质电泳方法。而且，在解析生物样品的场合，必须对试样中非常微量的蛋白质进行解析，所以希望有灵敏度更高的电泳方法。
发明公开本发明的目的在于提供一种不必进行热变性的预处理步骤，就能够在天然状态下对蛋白质进行快速解析，而且具有更高灵敏度的电泳方法。
亦即，本发明的要点是涉及[1]一种电泳方法，其特征在于，不进行热变性处理，就将蛋白质供于大小分离的电泳；[2]上述[1]所述的电泳方法，其特征在于，将溶解于水的蛋白质供于电泳； 上述[1]或[2]所述的电泳方法，其特征在于，将2个或2个以上的分子量标记与蛋白质一起供于电泳，至少该标记之一与标准浓度相比为低浓度；[4]上述[1]～[3]中任意一项所述的电冰方法，其特征在于，将2个或2个以上的分子量标记与蛋白质一起供于电泳，该标记之一的浓度为被测蛋白质浓度的1/10～10倍；[5]上述[1]～[4]中任意一项所述的电冰方法，其特征在于，电泳的方式选自毛细管电泳法、微芯片型电泳法和纳米通道型电泳法。
附图的简要说明

图1表示在微芯片型电泳中对电泳条件进行研究的结果。
图2表示在微芯片型电泳中对电泳条件进行研究的结果。
图3表示在微芯片型电泳中对电泳条件进行研究的结果。
图4表示在微芯片型电泳中对电泳条件进行研究的结果。
图5表示在微芯片型电泳中对电泳条件进行研究的结果。
图6表示在微芯片型电泳中对电泳条件进行研究的结果。
图7表示在微芯片型电泳中对电泳条件进行研究的结果。
发明的最佳实施方式本发明的蛋白质电泳方法的一个重要特征在于，不进行热变性处理即可将蛋白质供于以大小分离为目的的电泳。本发明的电泳方法因其不进行热变性处理，具有可以缩短电泳的分析时间，简化操作的优点。
在本说明书中，蛋白质是指多个氨基酸通过肽键连接而成的化合物，这意味着天然来源物、合成物和短链的肽都包括在内。
作为本发明的电泳方法中能够解析的蛋白质，没有特别的限定，可以对天然来源物、合成物和含有氨基酸以外的构成成分的核蛋白、糖蛋白、脂蛋白质等进行解析，但特别适用于水溶性蛋白质。关于能够测定的分子大小，通过适当设定标记，所有大小的蛋白质都可以进行解析，但特别适合解析6kDa～210kDa的蛋白质。另外，膜结合的蛋白质优选在溶解后用于本发明的电泳方法中。该溶解处理可以通过盐溶液或EDTA等螯合剂的处理、超声波等的机械处理、或者用表面活性剂的处理等实现。
作为本发明的电泳方法所使用的分离用载体，没有特别的限定，可以例举通常的毛细管凝胶电泳或微芯片型凝胶电泳等中蛋白质的分子大小分离用的聚丙烯酰胺、聚丙烯酰胺凝胶、羟丙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、β-环糊精、α-环糊精、γ-环糊精等分离用载体，此外，也可以适用WO 02/097421记载的含有β-1，3葡聚糖结构的cardran、昆布糖和海藻提取物等。作为分离用载体的添加剂，可以例举十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X-100、ε-氨基己酸、3-[(3-胆酰胺(colamide)丙基)-二甲氨基]-1-丙烷、CHAPS、6～8M尿素、四甲基乙二胺(TEMED)、溴化己基三甲基铵(HTAB)、溴化十二烷基三甲基铵(DTAB)等。
作为电泳用缓冲液，可以例举Tris-甘氨酸缓冲液、Tris-硼酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、Tris-Tricine缓冲液、Tris-磷酸二氢钠酸缓冲液等，以及一般作为蛋白质的电泳用缓冲液所使用的缓冲液，市售的蛋白质电泳用试剂盒中提供的缓冲液等也可以使用。上述电泳用缓冲液能够以一般作为蛋白质电泳用缓冲液使用的浓度使用。
电泳用缓冲液也可以含有上述分离用载体。通过将分离用载体加入电泳用缓冲液中，可使操作变得简便，从而能够以更快的速度进行解析。
从合适的渗透电流和适合于蛋白质的电泳的观点考虑，电泳用缓冲液的pH优选为2.0～9.0，更优选为6.8～8.6。
作为制备试样用的溶液，可以使用水、SDS溶液、或者在SDS-Tris硼酸溶液等中添加了2-巯基乙醇或二硫苏糖醇的溶液。从提高峰强度、提高峰分离度、提高检测限、提高测定精度的观点出发，特别优选水。
作为水，可以使用超纯水、去离子水、MilliQ水等在蛋白质电泳中通常使用的水，特别优选MilliQ水。
另外，水作为制备试样用的溶液使用时，从增强峰强度、提高检测限的观点考虑，优选用水使蛋白质溶解。
从测定精度的观点考虑，作为试样溶液中蛋白质的浓度，优选为0.05～2000ng/μl，更优选为0.1～2000ng/μl，特别优选为0.5～200ng/μl。
作为能够使用本发明的电泳方法的优选方式，可以例举毛细管电泳、微芯片型电泳、和纳米通道型电泳。
毛细管电泳通常是在内径为100μm以下的毛细管内充填电泳用缓冲液，将试样导入一端后，在两端施加高电压，使被测蛋白质在毛细管内展开。作为毛细管，通常使用火成(fumed)二氧化硅毛细管，可以使用其内壁无涂层的毛细管，也可以使用内壁有涂层的毛细管(50％苯甲基聚硅氧烷、聚乙二醇、聚胺等)。另外，也可以使用用PEO(聚环氧乙烷)对无涂层的毛细管进行处理后的毛细管。
采用毛细管电泳的方式，本发明的电泳方法具体通过包括下述步骤的方法进行，不对含有蛋白质的试样进行热变性，将试样注入毛细管内，使蛋白质移动至能够进行蛋白质分离的泳动电场下的步骤；以及利用泳动电场使蛋白质电泳的步骤。
将试样注入毛细管内，使蛋白质移动至能够进行蛋白质分离的泳动电场下的步骤，更具体地说，是通过电压法、加压法、落差法进行，可以根据装置的种类、毛细管的粗细(内径)和长度等适当决定电压或施加的压力的大小以及供压的时间。而且，也可以应用WO02/097421记载的方法。
对于在毛细管电泳中使用的毛细管，内径、外径、全长、有效长度都没有特别的限定，可以使用通常使用的尺寸的毛细管。关于有效长度，从能够快速解析的观点考虑，可以使用有效长度短的毛细管。其中，所谓毛细管的有效长度，是指从试样注入口至检测部分的距离。
从获得良好的分离能力、缩短移动时间的观点出发，毛细管电泳中的泳动电场优选为20V/cm～10kV/cm，更优选为50V/cm～5kV/cm，特别优选100V/cm～1kV/cm。
在微芯片型电泳中，使用的微芯片具备加样通道和与该加样通道交叉的分离用通道，而且在该加样通道的一端配置了试样储存器，在该加样通道的另一端配置了出口。
采用微芯片型电泳的方式，本发明的电泳方法具体通过包括下述步骤的方法进行，不对含有蛋白质的试样进行热变性，将试样供给试样储存器的步骤；将该试料储存器中的试料导入分离用通道中的步骤；以及在分离用通道中使试样电泳的步骤。
将试样供给试样储存器的步骤，更具体地说，是通过在加样通道一端的试样储存器和另一端的出口施加电压而实现。电压的强度根据装置不同而异，用SV1100(日立电子公司生产)的场合，施加50～800V的电压，通常施加300V的电压。利用该方法将试样供给加样通道和分离用通道的交叉部位。另一方面，也可以适用WO 02/097421记载的方法。
将试料储存器中的试料导入分离用通道的步骤，更具体地说，是同时实现以下两个步骤在加样通道一端的试样储存器和另一端的出口施加挤压电压，剩余的试样从试样储存器和另一端的出口侧排出的步骤；以及在分离用通道的出口侧及其相反一侧施加分离电压的步骤。电压的强度可以根据装置适当选择，用SV1100(日立电子公司生产)的场合，前者在130V左右，后者在700～900V下完成。另一方面，也可适用WO02/097421记载的方法。
作为微芯片的材质，可以例举石英玻璃、硼硅酸玻璃、钠玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、二甲基硅氧烷等。其中，从吸附试样少，芯片加工容易的观点考虑，希望使用玻璃、或聚甲基丙烯酸甲酯。此外，也可以与毛细管同样使用进行了内壁加工处理的微芯片。
在微芯片型电泳中，微芯片的大小，例如可以是长10～120mm、宽10～120mm、厚500～5000μm。
微芯片中的加样通道和分离用通道的形状均无特殊的限定。另外，也可以使用在一片芯片上设置3～96条上述通道，可同时进行多通道解析的芯片。多通道的排列方式有平行、放射线状、圆形等，对其形状没有特别的限定。
上述通道的宽可根据微芯片的大小、使用目的等适当设定。具体而言，从获得足够的解析灵敏度的观点考虑，希望通道的宽度为0.1μm以上，优选10μm以上；从获得足够的解析精度的观点考虑，希望通道的宽度为100μm以下，优选50μm以下。此外，上述通道的深度可以根据微芯片的大小、使用目的等适当设定。具体而言，从获得足够的解析灵敏度的观点考虑，希望为0.1μm以上，优选10μm以上；从获得足够的解析精度的观点考虑，希望为100μm以下，优选50μm以下。而且，上述分离用通道的长度可以根据微芯片的大小、解析对象化合物适当选择，但希望有较长的有效长度。有效长度是指从通道交叉部位到高分子化合物的检测点(配置在分离用通道上)的距离。从获得足够的分离能力的观点考虑，希望为0.1mm以上，优选10mm以上；从快速分离的观点考虑，希望为100mm以下，优选50mm以下。
另外，上述储存器的大小可以根据试样的容量适当设定。具体而言，从试样导入的操作和电极的粗细的观点考虑，希望直径为0.05mm以上，优选3mm以下。
从得到良好的分离能力、缩短移动时间的观点考虑，微芯片型电泳的泳动电场希望为20V/cm～50kV/cm，优选50V/cm～20kV/cm，更优选为100V/cm～10kV/cm。
所谓纳米通道型电泳，是指采用形成了通道宽度为纳米尺寸，即1nm～1μm，优选10～500nm，更优选50～100nm的流路的芯片所进行的电泳。其中包括上述记载的纳米尺寸的结构体形成了微米尺寸的通道的结构。纳米尺寸的结构体的形状没有特别的限定，例如可以使用四边形、圆形、三角形等的结构体，结构体的设置间隔也没有特别的限定。使用由这些结构体形成的纳米通道芯片。与毛细管电泳的情况相同，纳米通道型电泳也包括能够同时进行多通道解析的芯片。
纳米通道型电泳的通道可以设计成具有尺寸为纳米这一特征的，通道的形状弯曲成带有曲率的形状，如蛇行状、锯齿状或它们的组合等各种形状。据此可以在微小的尺寸内形成多个通道。另外，据此可以一次处理多个样品，从而有可能实现高生产率。另外，纳米尺寸的结构体形成微米尺寸的通道的场合，具有可自由地改变其形状，其设置间隔也可自由改变的优点。可以同时进行多道通的测定。
纳米通道型电泳和微芯片型电泳一样，也包括配置了加样通道、与该加样通道交叉的分离用通道、在该加样通道的一端设置的试样储存器、在该加样通道的另一端设置的出口的结构，但形状没有特别的限定。
作为纳米通道型电泳中所用的纳米通道的材质，可以使用与微芯片相同的材质。例如，石英玻璃、硼硅酸玻璃、钠玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、二甲基硅氧烷等。
纳米通道型电泳中纳米通道芯片的大小适用与微芯片相同的大小。例如，长为10～120mm、宽为10～120mm、厚度为500～5000μm。纳米通道芯片的通道深度、通道的长度、储存器的大小等参照微芯片。
本发明的蛋白质的电泳方法中，可将分子量标记与蛋白质试样一起供于电泳。作为分子量标记，可以使用Agilent TechnologiesNo.5065-4430的分子大小6kDa、分子大小210kDa的Myosin、HMW、LMW标记试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech公司)等蛋白质电泳中通常使用的市售的分子量标记，或者使用含有市售的分子量和浓度已知的标准试样的蛋白质或含有由生物试样精制和/或定量的蛋白质的分子量标记。也可以将这些分子量标记组合使用。
本发明的蛋白质的电泳方法中，作为分子量标记，也可以使用相对于被测蛋白质在可以测定的范围内处于低分子量侧和高分子量侧的2种分子量标记。据此可以更好地调整移动时间并进行定量。本说明书中，低分子量侧的分子量标记称为“下标记(Lower marker)”，高分子量侧的分子量标记称为“上标记(Upper marker)”。
作为下标记，例如分子大小为6kDa的Agilent TechnologiesNo.5065-4430。作为上标记，例如分子大小为210kDa的Myosin。
本发明的蛋白质电泳方法中，还可以将其他分子量标记与下标记和上标记组合使用。
作为分子量标记的用量，可采用蛋白质电泳中一般使用的量。生产者或一般实验方案根据装置的种类、该装置的检测限、检测灵敏度、测定精度等推荐的试样溶液中的分子量标记的浓度，在本说明书中作为蛋白质电泳中通常使用的浓度，称为“标准浓度”。例如，对Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies公司生产)来说，从被测浓度、检测灵敏度、测定精度的观点考虑，特别优选在试样溶液中为74ng/ml左右，该浓度为标准浓度。
本发明的蛋白质电泳方法中，使用2种以上分子量标记的场合，通过使用至少1个浓度比标准浓度低的分子量标记，优选为标准浓度的1/30～1/2，更优选为1/15～1/3，特别优选为1/10～2/7，可以提高分析对象蛋白质的检测灵敏度。这是因为通过扩大低浓度范围的刻度，检测灵敏度超过检测精度的原因。而且，使用稀释标记，可以稀释原有标记溶液中的离子。另一方面，由于泳动中的离子强度越低灵敏度越高，最终可以使灵敏度提高。
上述方案中，也可以使用低于标准浓度的下标记和/或上标记。在使用低于标准浓度的下标记的场合，优选使用的浓度为标准浓度的1/30～1/2，更优选为1/15～1/3，特别优选为1/10～2/7；另一方面，使用低于标准浓度的上标记的场合，优选使用的浓度为标准浓度的1/20～2/3，更优选为1/15～1/3，特别优选为1/10～2/7，这样，可以提高分析对象蛋白质的检测灵敏度。另外，也可以使用浓度都低于标准浓度的下标记和/或上标记，并进一步组合使用其他标记。
另外，本发明的蛋白质电泳方法中，使用2种以上标记的场合，使其中之一的浓度与测定试样中被测蛋白质的浓度实质上相同或近似，可以提高被测蛋白质的检测灵敏度。其原因是通过将分子量标记的浓度设定为与被测蛋白质实质上相同或近似的浓度，并在标记的刻度附近进行测定，能够以高的精度进行测定。所谓与被测蛋白质的浓度实质上相同或近似的浓度，具体而言，优选为测定试样中被测蛋白质浓度的1/10～10倍，更优选为1/5～5倍，特别优选为1/2～2倍。
上述方案中，也可以将下标记或上标记进一步组合使用。另外，也可以使用浓度与被测蛋白质的浓度相同或近似的下标记或上标记。另外，也能够以与被测蛋白质相同或近似的浓度使用下标记或上标记，进一步与其他分子量标记组合使用。
作为供于电泳的蛋白质的检测方法，例如通过UV波长光的吸收、荧光、激光、灯、LED等进行的检测、电化学检测、化学发光检测等。具体而言，在蛋白质或肽的场合，可以通过测定200nm处的吸收；使SYPRO Orange与蛋白质或肽反应，在460～550nmm激发，在550～650nm处测定荧光；或者使蛋白质与荧光标记(Agilent TechnologiesNo.5065-4430)反应，在630～650nm激发，在670～700nm处测定荧光；以及电化学测定、化学发光测定等，对蛋白质或肽进行检测。
毛细管电泳中，例如，可以在毛细管的出口设置能够发射UV波长光的装置和该UV波长光的检测器，或者也可以设置能够发射荧光波长的装置和能够检测该荧光波长的检测器。
微芯片型电泳中，例如，可以在分离用通道上设置的检测点设置UV波长光的检测器，或者也可以设置能够发射荧光波长的装置和能够检测该荧光波长的检测器。另外，可以同时检测多通道。
纳米通道型电泳中，可以适用与微芯片型电泳的场合同样的检测器、检测方法。而且，纳米通道型电泳中，同时检测多通道时，与微芯片型电泳的场合相比，可以同时检测更多的样品。
检测时，对蛋白质、肽、氨基酸等进行鉴定的场合，可以通过UV吸收、分子量标记、与标准样品的移动时间的比较、质谱解析等进行。
以下，结合实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
在实施例中，蛋白质的电泳全部用Agilent Technologies公司的微芯片型电泳装置Agilent 2100 Bioanalyzer和该公司的Protein 200试剂盒进行。现有方法采用Agilent Technologies推荐的实验方案进行。具体包括下述1～7的步骤。
1、在3μl的上标记中，加入90μl的变性处理用缓冲液和3μl的100mM二硫苏糖醇，涡流混合5秒钟。
2、取下标记15μl的原液，与1.0ml的milliQ水混合。
3、取3μl梯形(ladder)液以及另外2μl上述1、制备的变性处理用缓冲液的混合物和4μl被测蛋白质样品，涡流混合后，在1000×g下离心5秒钟。
4、将上述3的样品在100℃下加热5分钟。
5、加热结束后放冷1～2分钟。
6、在加热和放冷处理后的梯形液和被测蛋白质液中，分别加入84μl上述2、制备的下标记液并混合。
7、取上述6的制备物各6μl作为被测样品进行电泳。
另外，为了将本发明的蛋白质电泳方法与现有方法相比较，在上述Agilent Technologies推荐的实验方案基础上，补充各实施例中所记载的变更点进行蛋白质的电泳。
作为下标记，使用分子大小为6kDa的Agilent TechnologiesNo.5065-4430，作为上标记，使用分子大小为210kDa的肌球蛋白。
另外，所谓梯形液，是用于确定分子大小的分子量已知的标准样品，分别含有74ng/ml的以下物质溶菌酶(14.3kDa)、β-乳球蛋白(18.4kDa)、碳酸酐酶(29.0kDa)、脱辅白蛋白(43.0kDa)、血清白蛋白(68.0kDa)、磷酸化酶B(97.4kDa)、肌球蛋白(210kDa)。
实施例1图1的A～D是现有方法中，进行了蛋白质的预处理(热变性处理)后，进行微芯片型电泳时的电泳图谱；图1的E～M是不进行热变性处理的场合。使用1μg/μl的牛血清白蛋白(BSA)(SIGMA)作为蛋白质。
移动时间20s左右的2个峰来源于下标记，40s附近的1个峰来源于上标记。BSA的峰在25s～30s。
现有方法按照常规方法(Agilent Technologies推荐的方法)得到的结果如图1A所示。与此相对，图1B是热变性处理时未添加二硫苏糖醇的结果。另外，图1C是热变性处理时，用无SDS的去离子水(ICN Biomedicals，Inc.公司生产)代替样品缓冲液(AgilentTechnologies试剂盒内的缓冲液，认为是含有SDS的缓冲液)的结果，图1D是使用去离子水，不添加二硫苏糖醇的体系。
其结果可以确认，由于使用去离子水而降低了强度。与此相对，在不进行热变性处理的场合，添加规定的样品缓冲液和二硫苏糖醇，强度比图1提高(图1E)。但这不是由二硫苏糖醇引起的(图1F)。
另一方面，不经过热变性处理，用去离子水代替样品缓冲液，使蛋白质溶解，添加二硫苏糖醇，表现出强度急剧增加(1图G)。在无二硫苏糖醇的情况下，其结果也一样(1图H)。使用2倍浓度的上标记的场合，其结果也完全相同(图1L)。此外，不进行热变性处理，使用去离子水的体系的强度再现性良好(图1M)。
根据这些结果，不进行热变性处理，蛋白质不用缓冲液溶解，而是用水溶解的场合，光谱的强度可以提高8～10倍。
实施例2图2是在进行热变性处理(现有方法)和不进行热变性处理(实施例1E记载)的情况下，比较光谱强度的浓度变化的结果。图2A～J是进行热变性处理的结果；图2K～S是不进行热变性处理，使用实施例1记载的水，无二硫苏糖醇的结果。被测蛋白质BSA的浓度为，图2A、K5μg/μl，B、L2μg/μl，C、M1μg/μl，D、N0.5μg/μl，E0.2μg/μl，F、O0.1μg/μl，G、P0.05μg/μl，H、Q0.02μg/μl，I、R0.01μg/μl，J、S0.005μg/μl。
根据这些结果，确认在现有方法(进行反应)的体系中，检测限为0.05μg/μl，与此相对，本发明的方法(不进行反应)为0.005μg/μl，灵敏度提高10倍。
实施例3
图3是针对实施例2的光谱强度的浓度变化，对进行热变性处理(现有方法)的再现性研究的结果。被测蛋白质BSA的浓度为，图3A～A5μg/μl，B～B2μg/μl，C～C1μg/μl，D～D0.5μg/μl，E～E0.2μg/μl，F～F0.1μg/μl，G～G0.05μg/μl，H～H0.02μg/μl，I～I0.01μg/μl，J～J0.005μg/μl。
由这些结果可知，现有方法(进行反应)的体系的再现性高，检测限为0.05～0.02μg/μl。
实施例4图4是针对实施例2的光谱强度的浓度变化，对不进行热变性处理(使用实施例1E记载的水，没有二硫苏糖醇)的再现性研究的结果。图4A～A为BSA 5μg/μl，B～B为2μg/μl，C～C为1μg/μl，D～D为0.5μg/μl，F～F为0.1μg/μl，G～G为0.05μg/μl，H～H为0.02μg/μl，I、I’、I”为0.01μg/μl，J～J为0.005μg/μl。
由这些结果可知，不进行热变性处理的体系的再现性高，检测限为0.01～0.005μg/μl。
实施例5图5表示在低浓度下的检测。图5A-C所用的方法是用实施例1记载的本发明方法的水，无二硫苏糖醇，而且下标记或上标记任意一种标记采用低于标准浓度的浓度。图5ABSA浓度为0.01gμ/μl，下标记为常规的浓度，图5BBSA 0.005μg/μl，下标记浓度用现有方法的1/2，图5CBSA 0.001μg/μl，下标记浓度为现有方法的1/2，而且上标记浓度为现有方法的1/10。
图5D-J是对下标记为规定的1/4，再添加与被测蛋白质浓度相同的胰岛素(来源于牛胰脏，SIGMA)作为下标记所得的结果。D0.5μg/μl，E0.05μg/μl，F0.01μg/μl，G0.005μg/μl，H0.001μg/μl，I0.0005μg/μl，J0.0001μg/μl。按照该方法，BSA的检测限可达到0.0005μg/μl。
实施例6与实施例5同样对其他蛋白质的检测限进行研究。图6A-J是用现有方法(进行热变性处理)的肌红蛋白(来源于马骨骼肌，SIGMA)。图6B’、E’、H’、I’观察到同样的再现性。图6K-O是用现有方法的胰蛋白酶(I型，来源于牛胰脏，SIGMA)。浓度分别为A、K5μg/μl，B、B’2μg/μl，C1μg/μl，D、L0.5μg/μl，E、E’0.2μg/μl，F0.1μg/μl，M0.05μg/μl，H、H’、N0.02μg/μl，I、I’、O0.01μg/μl，J0.005μg/μl。按照该方法，肌红蛋白、胰蛋白酶的检测限都为0.05～0.02μg/μl。该结果与BSA的场合一致。
实施例7针对肌红蛋白和BSA，对进行热变性处理的体系的现有方法以及采用与被测蛋白质实质上相同或近似量的标记(为方便起见，在这里称为可变浓度标记)作为下标记的方法进行比较。
图7A～I是用现有方法(进行热变性处理)的肌红蛋白。图7A’～I’进行热变性处理，但使用可变浓度标记。图7J-R是用现有方法(进行热变性处理)的BSA。图7J’-R’进行热变性处理，但使用可变浓度标记。均使用胰岛素作为可变浓度标记。可变浓度标记的浓度分别为A、A’、J、J’2μg/μl，B、B’、K1μg/μl，C、C’、L、L’0.5μg/μl，D、D’、M、M’0.2μg/μl，E、E’、N0.1μg/μl，F、F’、O、O’0.05μg/μl，G、G’、P、P’0.02μg/μl，H、H’、Q、Q’0.01μg/μl，I、I’、R’0.005μg/μl。
采用现有方法，肌红蛋白、BSA的检测限为0.05μg/μl，与此相对，用可变浓度标记的场合，检测限可达到0.02μg/μl，但与不进行反应的实施例6的体系相比，没有显著地提高。但是，由此可知，即使在进行反应的场合也具有可变浓度标记的效果。
工业实用性根据本发明，提供了一种不必进行热变性的预处理步骤即可在天然状态下对蛋白质进行快速解析，而且具有更高灵敏度的电泳方法。因此，本发明的蛋白质的电泳方法在蛋白体解析和医疗诊断方面有用。
权利要求
1.一种电泳方法，其特征在于，不对蛋白质进行热变性处理，就供于大小分离的电泳。
2.根据权利要求1所述的电泳方法，其特征在于，将水溶解的蛋白质供于电泳。
3.根据权利要求1或2所述的电泳方法，其特征在于，将2种或2种以上的分子量标记与蛋白质一起供于电泳，至少该标记之一与标准浓度相比为低浓度。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的电泳方法，其特征在于，将2种或2种以上的分子量标记与蛋白质一起供于电泳，该标记之一的浓度为被测蛋白质浓度的1/10～10倍。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的电泳方法，电泳的方式选自毛细管电泳法、微芯片型电泳法和纳米通道型电泳法。
全文摘要
本发明提供一种不必进行热变性的预处理步骤即能够在天然状态下对蛋白质迅速地进行解析，而且具有更高灵敏度的电泳方法。本发明的电泳方法在蛋白体解析和医疗诊断方面有用。
文档编号C07K1/26GK1608202SQ02826269
公开日2005年4月20日 申请日期2002年12月25日 优先权日2001年12月28日
发明者田渕真理, 马场嘉信 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构