专利名称：用于控制衰老和应激的药理活性的新型持久信息素化合物及分离和表征它的方法
技术领域：
本发明涉及一种新型持久信息素和它的结构测定，更具体地，涉及一种持久信息素，其可以诱导线虫(C.elegans)进入持久(dauer)幼虫期。本发明还涉及一种用于有效分离和纯化生理活性的持久信息素，和测定该物质结构的新方法。
背景技术：
信息素被定义为用于在同种物种的个体之间通讯的物质。信息素通常是通过包括有机溶剂提取和液相柱色谱法的多步分离步骤以混合物的形式获得。
在20世纪八十年代早期，报导了线虫可分泌一类信息素，称为‘持久信息素’，一种用作种群密度指示物的组成型分泌物质(Golden和Riddle1982，Golden和Riddle 1984a，Golden和Riddle 1984c)，当它们面临不利的环境条件如热，食物缺乏，和拥挤时其可以诱导线虫进入持久停滞期。尽管它的存在已经已知超过二十年，但它的结构，分子量和物理性质仍然未知(Riddle，D.L.，Science，218578-580，1982)。
按照先前研究，由线虫分泌的信息素以极低浓度存在。因为它在控制线虫衰老和应激方面的潜力，已经详尽地研究持久信息素。然而，直到现在，因为它不能以单分子形式获得，大多数研究者已经使用线虫的粗提物，其被认为包含持久信息素以及其它化合物。
因此，必须从提取物中分离纯的持久信息素和表征它的结构以研究线虫的衰老，应激和其它细胞功能。持久信息素可能通过仍未鉴定的信息素受体检测，所述信息素受体与包括daf-11的环状GMP信号途径偶联(Birnby等2000)。已经已知线虫的持久信息素是非常稳定和疏水的，并具有类似于羟基化的脂肪酸和胆汁酸的那些的色谱性能。
在本文中，我们描述线虫特异性的持久信息素的纯化，鉴定，和分子表征。
发明内容
本发明人已经进行多年详尽的研究以便分离一种新类别的持久信息素，其可以广泛用于衰老，应激，信号转导和各种生物学问题的研究。结果，本发明人已经发现从已经被作为各种疾病的良好动物模型研究的线虫获得的提取物包含一种新的持久信息素，通过逐步的分离步骤纯化该提取物产生纯的持久信息素。基于该发现，可能提供一种新的持久信息素。
因此本发明的一个目的是提供一种新的持久信息素，其包含使用一种或多种选自水，醇，和乙酸乙酯的溶剂提取线虫和使用各种溶剂作为洗脱剂色谱分离。
本发明的另一个目的是提供6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其盐，其可以由如下阐明的式I表示。
结构式I 本发明还有另一个目的是提供一种用于持久诱导活性的组合物，其包含6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其盐，和药用载体。
本发明还有另一个目的是提供一种药物组合物，其用于诱导线虫的持久态或控制动物的衰老态。
本发明还有另一个目的是提供一种使用几个色谱程序分离和纯化持久信息素的方法。
该方法包括以下步骤1)乙醇提取线虫，所述线虫已经在S.basal液体培养基上通过喂饲大肠杆菌培养；2)乙酸乙酯提取在步骤1中制备的乙醇提取物；3)通过硅胶吸附色谱从乙酸乙酯级分中有效去除杂质；4)通过使用各种胺柱的高效液相色谱(HPLC)分离和纯化持久信息素。
通过本说明书的剩余部分本发明的另外的目的和优势将变得明显。
前面已经概述本发明的更多有关目的中的一些。这些目的应当被认为是仅仅举例说明本发明更多有关特征和应用中的一些。通过以不同方式应用本公开的发明或在本公开范围内修改本发明可以获得许多其它有益的结果。因此，通过参考除了由权利要求限定的本发明范围以外的优选实施方案的详细描述，可以提供本发明的其它目的和更透彻的理解。
附图简述
图1是示意图，其举例说明用于从线虫中分离和纯化发明的信息素化合物的逐步方法；图2是典型的色谱图，其举例说明通过使用以蒸馏水和异丙醇作为溶剂的梯度洗脱用胺柱通过HPLC富集活性级分；图3表示通过分子量分离的HPLC的色谱图(W251)，其在使用甲醇作为溶剂的恒溶剂洗脱的条件下运行；图4是通过使用氘甲醇(CD3OD)作为溶剂测量的氢核磁共振谱(1H-NMR)的图；图5是通过使用氘甲醇(CD3OD)作为溶剂测量的碳核磁共振谱(13C-NMR)的图；图6是举例说明使用四重(quadruple)类型的质谱仪以正模式测量的分子质谱图；图7是举例说明信息素的质谱结果的图，其是使用四重类型的质谱仪在测量过程期间在乙酸钠的存在下以正模式测量的；和图8是举例说明使用四重类型的质谱仪以负模式测量的质量结果的图。
实施本发明的最佳方式以下，将更详细地举例说明本申请。
为了本发明的目的分离的信息素是6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其盐，其可以通过以下式I表示。式I的化合物显著诱导蠕虫进入持久期。
结构式I 式I的化合物可以和药用受体或载体一起被配制成药物组合物。特别是，可以理想地将组合物用作各种实验试剂，用于控制动物的持久期和研究衰老，应激，信号转导，神经疾病和代谢病的机理。
新型信息素化合物或它的盐，是一种生理活性物质，当将该纯信息素加到培养基上时其实际上能够诱导线虫进入持久幼虫期。发现这是一种新型信息素化合物，其具有上述结构式I，它的化学式是6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸。
本发明的第一个目的是大量制备高度纯化的线虫的单分子持久信息素，其可以用于衰老，信号转导，代谢调节和应激的研究。第二个目的是使用各种分析技术和生物测定来表征它的化学结构和证实分离的纯持久信息素是否是新的和包含生物学功能的持久诱导化合物。
信息素化合物或它的盐，其通过本发明分离和表征，是从线虫中分泌的化合物，显示持久信息素活性。
当前被许多研究人员用于研究衰老，信号转导和应激的信息素活性级分是通过乙醇提取培养的线虫制备的粗提物。因此，由于纯的持久信息素的可用性，现在研究与持久信息素有关的衰老，信号转导和应激是可能的。
结合后附的表和图将更详细地描述本发明的优选实施方案。
尽管在上文已经详细描述本发明的优选实施方案，应当清楚地理解可适用于本领域技术人员的本文教导的基本发明概念的许多变化和/或改进将仍属于如后附权利要求所定义的本发明的精神和范围以内。
实施方案在S.basal液体培养基上在20℃的温度下通过喂饲大肠杆菌(OP50)培养线虫5天后，通过另外给料将它们进一步培养10多天。
在70％以上的蠕虫进入持久幼虫期后进行离心分离以获得肉汤。使用0.45μm的膜滤器通过膜式过滤去除蠕虫和大肠杆菌获得培养基的液相。
通过真空蒸发器使培养基完全脱水可以获得粉末态的纯培养基。
将乙醇加入粉末形式的培养基并进行使用乙醇的该溶液的提取。重复该过程3次。
为了检验该乙醇提取物(A)是否能诱导持久幼虫期，在已经在S培养基中生长的蠕虫上进行持久试验。
表1显示A的持久诱导活性。一旦A显示持久诱导活性，用乙酸乙酯进一步提取它。简短地，将干燥的A溶解在重蒸馏水中并用等体积的乙酸乙酯提取。重复该提取步骤5次。
表2显示乙酸乙酯提取物(B)对线虫的持久诱导活性的测定结果。在证实B的持久诱导活性以后，将通过上述方法获得的提取物加样到已经用己烷∶乙酸乙酯∶甲醇＝7∶7∶1平衡的硅胶吸附柱上。用甲醇洗脱吸附在柱上的活性形式持久信息素(C)。
表3概括显示使用从硅胶柱获得的级分(C)的持久诱导测定的结果。为了进一步纯化C，使用胺柱进行HPLC分离。简短地，将级分C溶解在甲醇中并用重蒸馏水稀释(MeOH∶ddH2O＝1∶1)。将包含C的该溶液加样到用异丙醇溶液(异丙醇∶水＝1∶1)平衡的胺柱上。用相同溶剂的梯度溶液洗脱与柱结合的持久信息素级分(级分D)。表4显示从胺柱色谱获得的与时间的洗脱曲线的模式。
表5概述使用来自胺柱色谱的活性级分D的持久诱导测定的结果。最后，通过使用甲醇作为洗脱溶液的尺寸排阻柱色谱法完全分离和纯化精制持久信息素(E)。
表6概述纯化的持久信息素的持久诱导活性测定结果。通过上述方法表征的纯持久信息素被确定为结构式I，它的化学式是6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其钠盐。
6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸可以与碱反应以制备它的盐形式。该碱可以是药物可适用的碱金属或碱土金属盐的一种。例如，可以将钠，钾，镁，或钙用作碱。
纯持久信息素，6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸的分子量为276道尔顿，其分子式为C13H24O6。然而，它分离形式的分子量证明是299道尔顿，因为1分子钠与它通过非共价键结合以便显示生物活性。
通过分析四重串联质谱仪发现纯的形式和分离形式之间的分子量差异，从中1分子钠与酸性形式非共价结合。另外，纯化的信息素化合物，6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸，也可变成铵盐形式，其导致证实它的分子量276道尔顿。
为了测定具有式I的本发明信息素的化学结构，使用氘甲醇(CD3OD)作为溶剂分析氢核磁共振谱(1H-NMR)。使用氘甲醇(CD3OD)作为溶剂还可分析碳核磁共振谱(13C-NMR)。
以ppm单位设置化学位移。通过使用二维NMR技术如1H-1HDQF-COSY谱，13C-1H HMBC获得确定的1H-和13C-NMR化学位移。结果在表7中显示。即，持久信息素的1H NMR(MHz)，13C NMR(MHz)的谱分析结果证实它的分子式是6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸。
工业适用性如上所述，从本发明，我们能够从线虫中获得新的持久信息素和测定它的化学结构为6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸，其可以作为它的各种盐形式存在。现在我们的发明可以导致对衰老，信号转导，应激，代谢，肥胖症，和神经疾病的研究。本发明进一步引导我们针对广泛类型的多种疾病开发药理有效的药物候选分子。
表1
表2
表3
表4
表5
表6
表7
权利要求
1.一种持久信息素化合物或其盐，其由下列结构式I表示，结构式I
2.权利要求1的持久信息素化合物或其盐，其中所述信息素化合物是6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸。
3.权利要求1的持久信息素化合物或其盐，其中所述盐是6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸钠盐。
4.权利要求1的持久信息素化合物或其盐，其中通过使6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸与碱金属或碱土金属盐碱反应另外形成加成盐。
5.权利要求1的持久信息素化合物或其盐，其中所述持久信息素包含用一种或多种选自水，醇类，和乙酸乙酯的溶剂提取线虫和用各种溶剂作为洗脱剂的色谱分离。
6.一种适于持久诱导活性的药物组合物，其包含6-(3，5-二羟基-6-甲基-四氢-吡喃-2-基氧基)-庚酸或其盐，和药用载体。
7.权利要求6的药物组合物，其中所述组合物诱导线虫的持久态或控制动物的衰老态。
8.一种用于分离和表征由下列结构式I表示的持久信息素化合物或其盐的方法，其包含以下步骤用乙醇提取线虫的总培养肉汤(级分A)；在将所述乙醇提取物溶解于水中以后用乙酸乙酯提取级分A以制备级分B；通过硅胶吸附色谱法从所述级分B中去除杂质(级分C)；通过使用胺柱的HPLC分离和纯化级分C以制备级分D；和通过使用分子大小排阻柱的另外的HPLC完全纯化级分D以制备纯的持久信息素化合物，结构式I
9.权利要求8的方法，其中所述去除步骤包含以下步骤通过在用己烷∶乙酸乙酯∶甲醇＝7∶7∶1平衡的硅胶吸附柱色谱上流动去除杂质，和然后通过用甲醇洗脱的硅胶吸附柱色谱洗脱部分纯化的信息素级分。
10.权利要求9的方法，其中通过使用胺柱的HPLC，通过使用异丙醇和蒸馏水的溶液组合物的梯度洗脱方法，分离和纯化所述部分纯化的信息素级分来获得信息素级分。
11.权利要求10的方法，其中通过使用柱(W251)的HPLC分离生物活性的信息素化合物，所述柱通过使用甲醇溶剂的恒溶剂洗脱通过分子量分离所述信息素级分。
12.持久信息素化合物或其盐用于研究衰老，信号转导和应激的应用，所述持久信息素或其盐由下列结构式I表示，结构式I
全文摘要
本发明公开一种用于有效分离和纯化与线虫的衰老和应激有关的、具有下列结构式I的生理活性的持久信息素化合物和测定该物质的结构的方法。首先，在S.basal液体培养基上培养线虫以后通过用乙醇完全浓缩液体培养基制备乙醇提取物，然后用乙酸乙酯进一步提取该乙醇级分。然后，通过硅胶吸附色谱法从乙酸乙酯提取物中去除杂质，通过使用各种溶剂作为洗脱剂的胺柱色谱法程序分离和纯化信息素提取物。最后，通过尺寸排阻HPLC完全分离和表征具有结构式I的信息素化合物。
文档编号C07D309/12GK1692107SQ03801482
公开日2005年11月2日 申请日期2003年10月7日 优先权日2002年11月14日
发明者白融基, 郑钣泳 申请人:白融基, Kdr生物技术有限公司