专利名称：免疫调节肽的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及免疫调节肽。在吞噬细胞如嗜中性白细胞以及单核细胞中表达的甲酰基肽受体家族(甲酰基肽受体(FPR)和类甲酰基肽受体1(FPRL1))，在宿主防御病原体感染中起重要作用(1，2)。已知该受体与百日咳毒素-敏感Gi蛋白偶联(1，2)。FPR的激活诱导Gβγ亚基从Gαi亚基上解离，并且βγ--亚基调节磷脂酶Cβ或肌醇磷脂3-激酶的激活(1，2)。这些效应分子的激活诱导复杂的下游信号传导，导致多种细胞响应，如趋化迁移、脱粒以及超氧化物的产生。
相关技术描述大多数完全激动剂诱导许多复杂的细胞信号，引起最终的复杂的免疫反应。在这些免疫反应中，许多反应是宿主细胞清除入侵的病原体的适当功能所基本必需的，但是一些反应是免疫反应中不必要的副作用。在药物发展领域，减少或消除候选药物的副作用已经成为研究的热点。为实现这一目标，许多研究组试图通过几种方法开发出特定受体的选择性免疫反应调节剂或选择性拮抗剂(3，4)。
从内源或人工合成途径，已经识别出多种FPR激动剂(1，2)。包括细菌肽类(N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸(fMLF))，HIV-包膜结构域(T20和T21)，以及宿主源性的激动剂(AnnexinI和Aβ42)(5-7)。此前，本发明的发明者报道了一种合成肽配体，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(在下文中，以＂WKYMVm＂表示)，可以刺激白细胞，如单核细胞和嗜中性白细胞(8-11)。Le等证实WKYMVm可以与甲酰基肽受体(FPR)和类甲酰基肽受体1(FPRL1)结合(12)。由于WKYMVm是一种对广谱受体有高度亲和力的短肽，因此它可以作为研究FPR-或FPRL1-介导的信号传导的有用物质。但是，对针对特定受体进形的选择性免疫调节剂或选择性拮抗剂，以及分子多样性的筛选的研究，仅由小分子化合物组成，因此非常有限，所以还需要继续识别新化合物。
发明概述本发明的第一个目标是提供新颖免疫调节肽，其氨基酸序列选自SEQID NO1～SEQ ID NO24；或衍生自肽的物质，所述肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24。
第二个目标是提供一种药物组合物，包括氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽；或衍生自肽的物质，所述肽的氨基酸序列选自SEQID NO1～SEQ ID NO24。
第三个目标是提供一种来治疗由白细胞数或活化状态改变伴随或引起的疾病(condition)的方法，所述方法包括给予所需治疗的宿主施用治疗有效量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质。
第四个目标是提供一种增加宿主白细胞数量或增强白细胞的活化状态的方法，这种方法包括给予需要更大量白细胞或更强的白细胞活化状态的宿主以治疗有效量的肽，该肽氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质。
第五个目标是为需要这样治疗的病人提供一种诱导白细胞中细胞外钙增加的方法，这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
第六个目标是为需要这种治疗的病人提供一种诱导人单核细胞或嗜中性白细胞中超氧化物产生的方法，这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
第七个目标是为需要这种治疗的病人提供一种诱导人外周血单核细胞趋化迁移的方法，这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
第八个目标是为需要这种治疗的病人提供一种诱导甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中脱粒反应的方法，这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
第九个目标是为需要这种治疗的病人提供一种分别与WKYMVm竞争结合甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞上甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1的肽的方法，这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
第十个目标是为需要这种治疗的病人提供一种刺激甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中细胞外信号调节蛋白激酶或甲酰基肽(peptiin)的方法，这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
第十一个目标是为需要这样治疗的病人提供一种刺激甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中Akt的方法，这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
第十二个目标是提供一种分离的核苷酸，所述核苷酸编码氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽。
第十三个目标是提供一种包含分离核苷酸的载体，所述核苷酸编码氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽。
本发明其它的特点及优点，结合下文描述以及附图将可以明显地看出，其中在附图中类似的参考字符表示相同的或相似的部分。
附图简述附图，引入到并构成说明书的一部分，举例说明了本发明的实施方案，并与说明书一起，共同解释本发明的原理。
图1显示WKYMVm、本发明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)或fMLF对FPR-表达的RBL-2H3细胞(A)或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞(B)中的[Ca2+]i的效果；图2显示WKYMVm、本发明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)以及fMLF对结合到FPR或FPRL1上的1251-标记的WKYMVm置换；图3显示WKYMVm、本发明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)、fMLF以及wkymvm，对FPR-或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞中ERK磷酸化的的影响；图4显示WKYMVm、本发明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)、fMLF以及wkymvm，对FPR-或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞中Akt磷酸化的的影响；图5显示WKYMVm通过细胞内钙增加刺激FPR-或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞的细胞外分泌；图6显示WKYMVm、本发明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)、fMLF以及wkymvm，对N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯基丙氨酸(fMLF)的细胞外分泌效果、对肽-诱导的[Ca2+]增加的影响。
图7显示WKYMVm通过P13K和MEK的活性，刺激FPR-或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞的趋化迁移；以及图8显示WKYMVm、本发明的肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)、fMLF以及wkymvm对趋化性的影响。
优选实施方案的详细描述甲酰基肽受体(FPR)和类甲酰基肽受体1(FPRL1)在免疫反应中发挥重要作用。本发明提供衍生自WKYMVm的肽类。许多肽可以刺激FPR或FPRL1导致钙的增加，但是本发明的肽，如WKGMVm、WKRMVm和6thD-Met替代的肽只使FPRL1-表达的细胞中的钙增加，而不会使FPR-表达的细胞中的钙增加。应用125I-WKYMVm的竞争实验表明许多肽不但使FPR-表达的细胞中的钙增加，而且WKGMVm、WKRMVm以及6thD-Met替代的肽也可以与125I-WKYMVm竞争结合FPR。与磷脂酶C-调节的钙增加不同，WKGMVm、WKRMVm和6thD-Met替代的肽可以刺激FPR-表达的细胞中的细胞外调节蛋白激酶(ERK)和Akt激活。WKYMVm的功能性结果是，该肽通过Ca2+和ERK通路，可以分别刺激FPR细胞中的脱粒作用和细胞的趋化作用。肽类，如WKGMVm、WKRMVm和6thD-Met替代的肽，只是通过诱导趋化迁移刺激FPR细胞，但是没有脱粒作用。综合来看，本发明第一次证实了，作为重要趋化物化学引诱受体，FPR可以按照配体-特异的方式被不同的肽配体进行差异调节。
根据本发明第一优选实施方案，本发明的肽包括选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的氨基酸序列或衍生自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质。SEQ ID NO1～SEQ ID NO24如下所述Trp-Lys-Gly-Met-Val-D-Met-NH2(WKGMVm；SEQ ID NO1)，Trp-Lys-Tyr-Met-Gly-D-Met-NH2(WKYMGm；SEQ ID NO2)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Gly-NH2(WKYMVG；SEQ ID NO3)，Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WRYMVm；SEQ ID NO4)，Trp-Glu-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WEYMVm；SEQ ID NO5)，Trp-His-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WHYMVm；SEQ ID NO6)，Trp-Asp-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WDYMVm；SEQ ID NO7)，Trp-Lys-His-Met-Val-D-Met-NH2(WKHMVm；SEQ ID NO8)，Trp-Lys-Glu-Met-Val-D-Met-NH2(WKEMVm；SEQ ID NO9)，Trp-Lys-Trp-Met-Val-D-Met-NH2(WKWMVm；SEQ ID NO10)，Trp-Lys-Arg-Met-Val-D-Met-NH2(WKRMVm；SEQ ID NO11)，Trp-Lys-Asp-Met-Val-D-Met-NH2(WKDMVm；SEQ ID NO12)，Trp-Lys-Phe-Met-Val-D-Met-NH2(WKFMVm；SEQ ID NO13)，Trp-Lys-Tyr-Met-Tyr-D-Met-NH2(WKYMYm；SEQ ID NO14)，Trp-Lys-Tyr-Met-(Phe/Trp)-D-Met-NH2(WKYM(F/W)m；SEQ ID NO15)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Glu-NH2(WKYMVE；SEQ ID NO16)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Val-NH2(WKYMW；SEQ ID NO17)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Arg-NH2(WKYMVR；SEQ ID NO18)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Trp-NH2(WKYMVW；SEQID NO19)，Trp-Lys-Tyr-Met-Val-NH2(WKYMV；SEQ ID NO20)，Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(KYMVm；SEQID NO21)，
Lys-Tyr-Met-Val-NH2(KYMV；SEQ ID NO22)，Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(YMVm；SEQ ID NO23)，以及Met-Val-D-Met-NH2(MVm；SEQ ID NO24).
SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽类以分离和基本上纯净的形式存在。
所述肽包括任选在羧基上被-NH2取代的氨基酸残基。
本发明的肽至少有一种以下特性(a)由人单核细胞或嗜中性白细胞诱导超氧化物的产生；(b)由人外周血单核细胞或嗜中性白细胞诱导的细胞内钙增加；(c)与甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1结合；(d)体外诱导人单核细胞或嗜中性白细胞的趋化迁移；(e)诱导甲酰基肽受体表达的细胞或类甲酰基肽受体1表达的细胞的脱粒作用；(f)通过激活甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1刺激细胞外信号-调节蛋白激酶磷酸化；以及(g)通过激活甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1刺激Akt磷酸化。
根据本发明第二优选实施方案，本发明提供了一种药物组合物，包括氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质。
包括作为活性成分的肽或物质的所述组合物，可以包括超过一种药用稀释剂，选自盐水、缓冲盐、葡萄糖、水、甘油或乙醇，而且稀释剂不限于这些。
组合物可以按照疾病和剂量，有不同的应用。应该理解活性成分的实际用量应该考虑相关因素来决定，包括治疗的疾病、病人症状的严重程度、与其它药物组合应用(例如，化疗药物)、年龄、性别、病人的体重、饮食、给药时间、选择的给药途径以及组合物的比例。即使给药剂量和途径根据疾病的类型和严重程度进行调整，每天组合物仍可以单剂量或分为1-3次剂量给药。
包含本发明肽或物质的组合物可以经口服或胃肠外途径给药。胃肠外给药是指经除口外的其它途径给药，包括经直肠、静脉、腹膜内和肌肉、动脉内、皮肤、鼻腔、吸入、经眼以及皮下导入给药。
包含肽或物质的药物制剂可以制成任何形式，如口服剂型、注射溶液或局部给药剂型。
药物剂型优选制成口服和可注射给药的形式(真溶液、混悬剂或乳剂)以及最优选的口服形式，如片剂、胶囊、软胶囊、水剂、药丸、颗粒等。
在剂型制备中，肽可以直接加入软胶囊而没有任何赋型剂，或与载体混合或稀释之后制成适当的剂型。合适的载体的实例有淀粉、水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖等。
根据本发明第三优选实施方案，提供了治疗白细胞数量或活化状态改变伴随或导致的疾病的方法。所述方法包括对需要此种治疗的宿主，施用治疗有效量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24序肽的物质。疾病状况可以是细菌、支原体、酵母、真菌、病毒感染或炎症反应。
根据本发明第四优选实施方案，提供了一种增加白细胞数量或提高白细胞活性状态的方法。所述方法包括对需要更大量或更强活性白细胞的宿主给药，施用治疗有效量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24序肽的物质。
根据本发明第五优选实施方案，为需要这样治疗的病人提供一种诱导白细胞中细胞外钙增加的方法。这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
根据本发明第六优选实施方案，为需要这种治疗的病人提供一种诱导人单核细胞或嗜中性白细胞中超氧化物产生的方法。这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
根据本发明第七优选实施方案，为需要这种治疗的病人提供一种诱导人外周血单核细胞趋化迁移的方法。这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
根据本发明第八优选实施方案，为需要这种治疗的病人提供一种诱导甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中脱粒反应的方法。这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ IDNO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
根据本发明第九优选实施方案，为需要这种治疗的病人提供一种分别与WKYMVm竞争结合甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞上甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1的肽的方法。这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
根据本发明第十优选实施方案，为需要这种治疗的病人提供一种刺激甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中细胞外信号调节蛋白激酶的方法。这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ IDNO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
根据本发明第十一优选实施方案，为需要这样治疗的病人提供一种刺激甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中Akt的方法，这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ IDNO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
在上述第三到十一优选实施方案中，被治疗的宿主或病人可能受到由于感染所致疾病的侵扰，特别是巨细胞病毒感染、类风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗(adoptive immune therapy)、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
本发明提供了分离的核苷酸，所述核苷酸编码具有包括SEQ ID NO1～SEQ ID NO24氨基酸序列的肽。
本发明提供了包含分离的核苷酸的载体，所述核苷酸编码包括SEQ IDNO1～SEQ ID NO24氨基酸序列的肽。
本发明提供了包含选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24氨基酸序列的多肽。
本发明将参考下列实施例进行更详细的解释。但是，这些例子在任何意义上都不能被解释为本发明范围的限制。
实施例中所用的材料Fmoc(保护的)氨基酸来自Millipore(Bedford，MA)。Rapidamide树脂购自Dupont(Boston，MA)。外周血单核细胞(PBMC)分离培养基(Histopaque-1077)、细胞色素c和fMLF购自Sigma(St.Louis，MO)。Fura-2五乙酰氧基甲酯(fura-2/AM)购自Molecular Probes(Eugene，OR)。RPMI1640来自Life Technologies(Grand Island，NY)。已透析的胎牛血清和补充的牛血清购自Hyclone Laboratories Inc.(Logen，UT)。PTX、GF109203X和PD98059购自Calbiochem(San Diego，CA)。LY294002购自BIOMOLresearch laboratories，Inc.(Polymouth Meeting，PA)。
用上面描述的固相方法合成肽(8，9)。简而言之，肽在rapidamide支撑树脂上合成，并在酸敏感连接基上按照标准的Fmoc/叔丁基方法进行合成。通过前述(8)氨基酸分析确定肽的组成。
按照上述方法(13)，用补加20％FBS和200g/ml的G418的DMEM来进行RBL-2H3、FPR-表达的RBL-2H3和FPRL1-表达的RBL-2H3细胞的培养。
实施例1嗜中性白细胞分离浓缩外周血白细胞由Ulsan Red Cross Blood Center(Ulsan，Korea)赠送。根据上述(9)的葡聚糖沉淀、红细胞低渗性裂解以及淋巴细胞梯度介质分离的标准方法分离出人嗜中性白细胞。分离的人嗜中性白细胞立即应用。
实例2肽对人嗜中性白细胞中超氧化物产生的影响测定了肽WKYMVm、SEQ ID NOs1～24的肽以及wkymvm对人嗜中性白细胞中超氧化物产生的活性。通过利用微量滴定96-孔板ELISA读板器(Bio-Tekinstruments，EL312e，Winooski，VT)测定细胞色素c的减少，从而量化超氧化物阴离子的产生，方法如(14)中描述。人嗜中性白细胞(96-孔板每孔中含1×106细胞/100μl的RPMI1640培养基)与50μM细胞色素c在37℃预温育1分钟，然后与指定浓度的肽一起温育。通过测定550nm处光吸收的变化进行超氧化物产生的测量，1分钟间隔测定一次，测定5分钟。每一位置上至少进行四个独立实验选择有活性的氨基酸肽类。这些结果显示在表I中。
用不同浓度的肽刺激嗜中性白细胞，发现WKYMVm以浓度依赖方式引起超氧化物的产生，用100nM的肽时活性最大(数据没有显示)。当一些肽，如WRYMVm、WEYMVm、WKFMVm以及KYMVm刺激细胞内超氧化物产生时，许多肽在用100nM的浓度时产生超氧化物的活性活性较弱。
表I.肽对人嗜中性白细胞中超氧化物产生的影响a
a通过监测细胞色素c的减少测量超氧化物产生。
b处理肽的浓度为100nM。
也测量了浓度为10μM的肽对超氧化物产生的影响。结果显示在表II中。除wkymvm外，所有的肽在10μM浓度时刺激超氧化物产生的活性与WKYMVm一样强。其中WKWMVm、WKFMV以及WKYMVW显示出比WKYMVm更强的活性。
表II.肽对人嗜中性白细胞中超氧化物产生的影响a
a通过监测细胞色素c的减少测量超氧化物产生。
b处理肽的浓度为10μM。
实施例3肽对FPR-或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞中[Ca2+]i增加的影响测量了FPR-表达的RBL-2H3细胞中肽WKYMVm、序列为SEQ IDNOs1～24的肽以及wkymvm对[Ca2+]i增加的活性。用10μM的每种肽刺激FPR-表达的RBL-2H3细胞，然后测量[Ca2+]i。[Ca2+]i的水平利用Grynkiewicz的荧光方法用fura-2/AM测量(15)。简而言之，制备的细胞用3μMfura-2/AM在新鲜无血清的RPMI1640培养基中37℃温育50分钟，持续摇动。每一个分析中，将2×106细胞等分到无Ca2+的Locke′s溶液(154mMNaCl，5.6mM KCl，1.2mM MgCl2，5mM HEPES，pH7.3，10mM葡萄糖，以及0.2mM EGTA)中。测量在双激发波长340nm和380nm以及500nm发射波长处的荧光变化，并将校正后的荧光比转化为[Ca2+]i。监测增加的[Ca2+]i的峰水平。结果显示在表III和图1A中。数据为三个独立实验的代表。
表III.肽对FPR-表达的RBL-2H3细胞中细胞内钙增加的影响a
a从负载了fura-2的细胞上监测细胞内钙的增加。
在FPR-表达的RBL-2H3细胞中，WKYMVm肽以浓度依赖的方式诱导[Ca2+]i的增加，最大活性浓度约为300nM(数据未显示)。WKYMVm对FPR细胞中[Ca2+]i的增加活性的EC50为47nM(表III)。在本发明的肽中，尽管WHYMVm、WKWMVm以及WKFMVm与肽WKYMVm相比，显示出对FPR更高的亲和力，其它肽显示出的活性不如WKYMVm(表III)。尤其是，WKGMVm、WKYMGm以及6thD-Met置换的肽没有产生[Ca2+]i的增加，直到用20μM的浓度处理FPRL1-表达RBL-2H3细胞(表III和图1A)。N-端和C-端截短的肽对FPR中的[Ca2+]i增加也无活性(表III)。这些结果表明Tyr3和D-Met6对[Ca2+]i增加中的FPR激活至关重要。
在FPRL1-表达的RBL-2H3细胞中，检测了肽WKYMVm、序列为SEQID NOs1～24的肽以及wkymvm对[Ca2+]i增加的影响。FPRL1-表达的RBL-2H3细胞用10μM的各肽刺激，并测定了[Ca2+]i。[Ca2+]i的水平用上述同样的方法进行测定。检测[Ca2+]i的峰水平。结果显示在表IV和图1B中。数据为三个独立实验的代表。
在FPRL1-表达RBL-2H3细胞中，10μM浓度的WKYMVm显示出了最大活性(数据未显示)。WKYMVm对FPRL1细胞中[Ca2+]i增加活性的EC50为0.6nM(表IV)。与FPR细胞中不一样的是，所有的肽对FPRL1细胞中[Ca2+]i的增加都是有活性的(表IV)。一些肽，如WRYMVm、WKWMVm、WKFMVm、WKYMYm以及WKYM(F/W)M对FPRL1显示出高亲和力(表IV)。在FPR细胞中不影响[Ca2+]i增加的WKGMVm、WKYMGm以及6thD-Met置换的肽，在FPRL1细胞中也显示出[Ca2+]i增加的活性，具有对FPRL1较低的亲和力(表IV和图1B)。N-端和C-端截短的肽也刺激FPRL1中的[Ca2+]i增加(表IV)。这些结果表明，相对于FPR的激活而言，Tyr3和D-Met6对[Ca2+]i增加中的FPRL1激活的重要性要差一些。
表IV.肽对FPRL1-表达的RBL-2H3细胞中中细胞内钙增加的影响a
a从负载了fura-2的细胞上监测细胞内钙的增加。
实施例4肽对[125I]WKYMVm与FPR或FPRL1结合的影响基于一些肽(WKGMVm、WKRMVm、D-Met6置换肽)不能诱导胞质钙增加的发现，需要进一步判断肽是否能与FPR结合。检测了肽对结合到FPR或FPRL1的125I-标记WKYMVm的置换情况。FPR-表达RBL-2H3细胞与[125I]WKYMVm，在无或有递增量的未标记WKYMVm或SEQ ID NOs1～24肽存在下一起温育。
配体结合分析按照前述报导的改良方法进行(16)。放射碘标记的WKYMVm(125I-标记)购自NEN Lifesciences(Boston，MA)。简言之，FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞按照每孔1×105细胞分配到24-孔板中，并培养过夜。用阻断缓冲液(33mM HEPES，pH7.5，0.1％BSA的RPMI)对细胞阻断2小时后，在有或无50μM未标记肽存在下，将单浓度的125I-标记的WKYMVm与结合缓冲液(含0.1％BSA的PBS)一起加到细胞中，并在持续振荡状况下4℃温育3小时。然后将样品用冰冷的结合缓冲液洗涤5次，并向每孔中加入200μl的裂解缓冲液(20mM Tris，pH7.5，1％Triton X-100)。室温裂解20分钟后，收集裂解液。用γ-线记数器测量结合的125I-标记WKYMVm的放射活性。
配体结合分析结果显示在图2中。如图2中所示，不仅未标记的WKYMVm而且WKGMVm、WKRMVm以及D-Met6置换肽的WKYMVm以浓度依赖的方式，抑制[125I]WKYMVm的结合。这些结果表明，尽管WKGMVm、WKRMVm、或WKYMVm的D-Met6-置换肽能结合到FPR，所有的肽不能诱导FPR-表达RBL细胞中的胞质钙增加。
实施例5肽对FPR或RPRL1表达RBL-2H3细胞中ERK磷酸化的影响i)用肽刺激细胞培养的RBL-2H3细胞等分成2×106细胞，并用标明浓度的WKYMVm和本发明的肽刺激指定长的时间。FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞用1μM的WKYMVm刺激不同的时间(图3A)。在用1μM的WKYMVm处理之前，两种细胞用下列溶液进行预温育，用溶媒(vehicle)或100ng/ml的PTX(24小时)、50μM的LY294002(15分钟)、5μM的GFX(15分钟)、10μMBAPTA/AM(60分钟)或50μMPD98059(60分钟)(图3B)。FPR-或FPRL1-表达的RBL2H3细胞分别用10μM的本发明肽刺激2分钟或5分钟(图3C)。
刺激后，用无血清的RPMI洗涤细胞，并用裂解缓冲液(20mM Hepes，pH7.2，10％甘油、150mM NaCl，1％ Triton X-100，50mM NaF，1mMNa3VO4，10μg/ml亮抑酶肽，10μg/ml抑蛋白酶肽，以及1mM苯甲基磺酰氟)进行裂解。离心沉淀去垢剂不溶物(12,000Xg，15分钟，4℃)，并且将溶解的上清级分移出，并在-80℃储存或立即使用。裂解液中的蛋白质浓度用Bradford蛋白质分析试剂进行测定。
ii)电泳及免疫印迹分析将每个样本(含30g蛋白质)进行10％SDS-PAGE分离，并且磷酸化ERK用抗-磷酸-ERK抗体通过免疫印迹分析进行测定。通过利用浓缩样本缓冲液，进行电泳，制备蛋白质样品。样品中的部分然后用Laemmli描述的缓冲系统，通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行分离(17)。
电泳后，用抗-ERK2抗体进行蛋白印迹分析以确证在实验中所用的样品量相同。然后将蛋白质印迹到硝酸纤维素膜上。然后通过用含5％脱脂奶粉TBS(Tris-缓冲盐溶液，0.05％Tween-20)温育，封闭硝化纤维膜。随后，膜的抗-磷酸-ERK抗体、抗-磷酸-Akt抗体或抗-Akt抗体进行温育，用TBS洗涤。进行PKC转位(translocation)分析的时候，用PKC同工酶特异的抗体进行温育。抗原-抗体复合物通过下列方式显色，将膜与1∶5000稀释的偶联到辣根过氧化酶的山羊抗-兔IgG或山羊抗-小鼠IgG抗体进行温育，并用增强的化学发光检测体系进行。
iii)结果评价了肽对FPR-或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞中，通过FPR或RPRL1的细胞转导的影响，结果在图3中显示。图3的结果是3个独立实验的代表。
既然，尽管一些肽能与FPR结合，它们不能刺激PLC-介导的钙增加，考察了它们对一些GPCRs下游的其它信号传导(ERKs和Akt)的影响，所述的其它信号传导独立于PLC。用1μM WKYMVm刺激FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞，诱导瞬时的ERKs激活，表明用肽处理后，分别在2分钟或5分钟出现最大活性(图3A)。当在用WKYMVm刺激之前，用数种抑制剂对FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞进行预处理，WKYMVm-诱导ERKs激活对PTX和PD98059敏感，表明该事件是PTX-敏感的G-蛋白质并且是MEK-依赖性的(图3B)。P13K抑制剂(LY294002)、PKC抑制剂(GF109203X或Ro-31-8220)或钙螯和剂(BAPTA/AM)的预处理不能产生WKYMVm-诱导的ERK激活(图3B)。这表明该事件独立于P13K、Ca2+和PKC激活。因此看来WKYMVm通过独立信号传导途径诱导[Ca2+]i增加和ERK激活。用抗-磷酸-ERKs抗体通过蛋白印迹分析考察了本发明的肽对ERK激活的影响。与胞质钙增加活性不一样的是，肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVR和WKYMVE)刺激FPR-表达RBL-2H3细胞中的ERKs磷酸化(图3C)。应该注意地是这些肽不能影响PLC-介导的[Ca2+]i增加活性，这是一个非常有趣的结果。当FPRL1-表达RBL-2H3细胞用WKYMVm和本发明的肽进行刺激的时候，大多数所述肽也引起FPRL1细胞中的ERKs磷酸化(图3C)。该结果与前述结果相关，所有的肽能刺激FPRL1-表达细胞中的胞质钙增加(图1B)。
实施例6肽对FPR-或RPRL1-表达RBL-2H3细胞中Akt磷酸化的影响众所周知，激活的趋化物受体经P13K诱导Akt的激活(19)。用肽刺激细胞，按照实施例5中同样的方法进行电泳和免疫印迹分析。
FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞用1μM WKYMVm刺激不同的时间(图4A)。在用1μM的WKYMVm处理之前，两种细胞用溶媒或100ng/ml的PTX(24hr)、50μM的LY294002(15分钟)、5μM的GFX(15分钟)、10μM的BAPTA/AM(60分钟)或50μMPD98059(60分钟)进行预温育(图4B)。FPR-和FPRL1-表达RBL2H3细胞用10μM的WKYMVm和本发明的肽分别刺激2分钟或5分钟(图4C)。将每一种样品(30μg的蛋白质)进行10％SDS-PAGE，并抗-磷酸-Akt抗体通过免疫印迹分析对磷酸化Akt进行测定。通过用抗-Akt抗体进行的蛋白印迹分析来确证用于实验中同样量的样品。结果显示在图4中。图4的结果为3个独立实验的代表。
观察到在FPR-和FPRL1-表达RBL-2H3细胞中，WKYMVm刺激诱导的Akt磷酸化是时间依赖方式的(图4A)。WKYMVm-诱导Akt磷酸化对PTX、LY294002敏感，但对GFX和BAPTA/AM不敏感，表明该事件为PTX-敏感性的G-蛋白质以及P13K-依赖性(图4B)。不仅用WKYMVm而且用本发明肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE和WKYMVR)对FPR-表达RBL-2H3细胞进行刺激，可以引起Akt磷酸化(图4C)。WKYMVm和本发明肽也可以刺激FPRL1-表达RBL-2H3细胞中的Akt磷酸化(图4C)。这些结果与肽在两种细胞中的ERKs磷酸化相关联(图3C)。由于WKYMVm-诱导的ERKs和Akt激活通过P13K激活而介导，似乎WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE和WKYMVR成功地诱导FPR下游的P13K-介导的信号传导。
实施例7肽对胞吐作用(exocytosis)的影响颗粒分泌是肥大细胞最重要的功能之一(20)。通过按照上述方法(18)检测β-氨基己糖苷酶分泌，考察WKYMVm对颗粒分泌的影响。简言之，表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞(2×105/well)在24-孔组织培养板中培养过夜。将细胞用Tyrode′s缓冲液(137Mm NaCl，12mM NaHO3，5.6mM葡萄糖，2.7mM KCl，1Mm CaCl2，0.5mM MgCl2，0.4Mm NaH2PO4，0.1g/100ml BSA以及25mM HEPES，pH7.4)洗涤，并用各种肽进行刺激。用各种浓度的WKYMVm处理FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞(图5A)。在有或无10μMBAPTA/AM存在的条件下，用1μM的WKYMVm刺激两种细胞系(图5B)。该反应刺激20分钟后，通过将其置于冰上进行终止。分泌到培养基中的β氨基己糖苷酶按照下列方法测定，将50μl上清液或细胞裂解液与25μl的5mM对硝基苯基-N-乙酰基-对-D-葡糖胺的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3.8)在37℃温育2小时。在温育结束时，加入50μl的0.4M的Na2CO3。测量405nm处的吸光度。结果显示在图5中。数据为三重实验的平均值±S.E.。数值(平均值±S.E.)表示为细胞中总β-氨基己糖苷酶的百分比。
多种浓度WKYMVm对FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞进行刺激的时候，所引起的β-氨基己糖苷酶释放是以浓度依赖的方式进行的(图5A)。在FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞中，用100nM或10nM肽刺激时，分别可以显示出最大活性(图5A)。已经有报道指出胞质钙增加对肥大细胞如RBL-2H3中颗粒分泌非常关键(18，20)。也证实了，用肽刺激之前，通过BAPTA/AM处理的细胞内钙螯合几乎完全抑制WKYMVm-诱导的颗粒分泌(图5B)。
从这些新发现可知，WKYMVm和许多WKYMVm的置换肽可诱导胞质钙释放，但一些却不能(WKGMVm、WKRMVm、D-Met6置换肽)，考察了RBL细胞中这些肽对颗粒分泌的影响。用10μM的各肽处理FPR-(图6A)或FPRL1-表达RBL-2H3细胞(图6B)。按照上述方法测定肽-诱导β-氨基己糖苷酶的分泌。数据为三重实验的平均值±S.E.。
当用肽(WKYMVm、WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)刺激FPR细胞时，可以观察到一些置换肽的颗粒分泌作用，但WKGMVm-、WKRMVm-以及D-Mets-置换肽除外(图6A)。WKGMVm-、WKRMVm-以及D-Met6-置换肽不能影响FPR-表达RBL-2H3细胞中的颗粒分泌(图6A)。这些结果与前述结果完全关联，WKGMVm-、WKRMVm-以及D-Met6-置换肽不能诱导胞质钙释放(图1A)。与FPR-表达RBL-2H3细胞中不一样的情况是，所有肽(WKYMVm、WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE、WKYMVR)，但不包括fMLF或wkymvm，刺激FPRL1-表达RBL-2H3细胞中的颗粒分泌(图6B)。该结果也与前述结果良好关联，肽刺激FPRL1-表达RBL-2H3细胞中的胞质钙增加(图1B)。
实施例8肽对细胞趋化性的影响用多孔室进行趋化性分析(改进的Boyden室分析)(Neuroprobe Inc.，Gaithersburg、MD)(18)。简言之，聚碳酸酯滤器(8μm孔径)用50μg/ml的大鼠I胶原质(Collaborative Biomedicals)的HEPES-缓冲的RPMI1640培养基进行预包被。将干燥包被的滤器放置在含不同浓度肽的96-孔室中。将表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞悬浮在RPMI中，浓度为1×106细胞/ml的无血清RPMI，并将25μl的悬浮液放置于96-孔趋化性室的上层孔中。37℃温育4小时后，刮去未迁移的细胞，并将迁移过滤器的细胞进行脱水、固定、并用苏木精(Sigma，St.Louis，MO)染色。对在所述孔中的5个随机选择的高倍数视野(HPF)(400X)中的染色细胞进行计数。图7A显示了趋化性分析的结果。溶媒、50μM LY294002(15分钟)、以及50μM PD98059(60分钟)预处理的细胞，进行1μM WKYMVm处理时的趋化性分析，结果显示在图7B中。迁移细胞数通过计数高倍数视野(400x)中的细胞进行测定。数据为三个独立实验的平均值±SE，每个实验重复两次。
已有报道，WKYMVm可以诱导吞噬细胞如单核细胞和嗜中性白细胞的趋化迁移(11)。Le等证实了通过与FPR和FPRL1结合的WKYMVm-诱导细胞趋化性(12)。正如所期望的那样，在FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞中，WKYMVm显示出的趋化迁移活性具有钟(bell-)型浓度依赖性(图7A)。WKYMVm-诱导的细胞趋化性对LY294002和PD98059敏感(图7B)。该结果暗示WKYMVm-诱导的细胞趋化性为P13K-和MEK-依赖的。WKYMVm经P13K和MEK活性，刺激FPR-或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞的趋化迁移。
测量了本发明肽对FPR-或FPRL1-表达RBL-2H3细胞的细胞趋化性的影响。多种浓度的各种肽用于FPR-或FPRL1-表达的RBL-2H3细胞的趋化性分析。通过在高倍数视野(400x)对细胞进行计数，测定迁移细胞数。数据表示为两个独立实验的平均值±SE，每个实验重复两次。
在FPR-表达RBL-2H3细胞中，不仅WKYMVm而且置换肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE以及WKYMVR)诱导细胞的趋化性(图8A)。趋化性所需要的置换肽的浓度高于WKYMVm的浓度(图8B)。针对涉及置换肽-诱导趋化性信号传导途径，检验了PI-3激酶和MEK-介导信号传导的参与情况。当FPR-表达RBL细胞用LY294002或PD98059预处理的时候，WKYMVm和置换肽-诱导的RBL细胞迁移几乎完全被抑制(图7B并且数据未显示)。在FPRL1-表达RBL-2H3细胞中，WKYMVm以及肽(WKGMVm、WKRMVm、WKYMVE和WKYMVR)诱导的细胞趋化性，也显示出浓度依赖性(图8B)。
在本发明中，第一次证实了FPR可用不同的配体进行调节，导致差异的细胞信号传导和功能结果。为了证实FPR的配体-特异性调节，制备了如表I中所列出的多种肽，FPR的强活性配体。其中，WKGMVm-、WKRMVm-以及D-Met6-置换肽能结合到FPR，只诱导PI-3激酶-介导的Akt和MEK-介导的ERK激活，导致细胞的趋化迁移。这些肽不会影响胞质钙增加。由于肽WKYMVm不仅刺激ERKs激活，而且胞质钙增加，导致趋化性以及脱粒作用，因此意味着FPR可用不同的配体进行差异调节。
最近，数篇报道证实了一些GPCRs可用不同的配体进行调节(21，22)。在GPCR的配体-特异性调节中，认为不同的配体诱导受体的不同构象改变，并诱导受体与特定的效应分子或G-蛋白的选择性偶联。在表III和图1A中，证实了在FPR-表达RBL-2H3细胞中，WKGMVm、WKRMVm以及D-Met6置换肽不能刺激PLC-介导胞质钙增加。但是，这些肽刺激FPR-表达RBL-2H3细胞中的ERKs和Akt磷酸化(图3C)。在WKYMVm以及本发明肽-介导细胞信号传导中，胞质钙增加是被通过PLC-P激活的PI水解所诱导的，但是ERK和Akt磷酸化是分别通过MEK和P13的激酶的激活而介导的。基于这些结果，似乎肽配体与FPR的结合诱导FPR的构象改变，构象改变导致受体与G-蛋白质-介导PLC-β或G-蛋白质-介导PI-3激酶偶联。由于一些本发明肽不能诱导胞质钙增加(WKGMVm、WKRMVm以及D-Met6置换肽)，但可以经PI-3激酶-独立的途径刺激ERKs磷酸化，似乎肽结合到FPR并诱导了构象改变，该构象改变是PI-3激酶激活和MEK-介导的信号传导所需要的，从而导致RBL-2H3细胞的趋化迁移。
已有报道称甲酰基肽受体家族的两种不同受体，FPR和FPRL1在先天性免疫反应中发挥重要作用(1，2)。至今为止，数种不同的配体来源包括甲酰基肽lipoxin A4，已有报道可以与FPR或FPRL1结合(1)。Le等报道WKYMVm可以与FPR以及FPRL1结合(12)。
在本发明中，本发明者证实了用其它氨基酸置换Tyr3或D-Met6将失去FPR而不会失去FPRL1的PLC-介导胞质钙-增加活性(图1)。该结果表明Tyr3和D-Met6是通过FPR激活PLC的关键，但对FPRL1却不是这样。从该结果可以推导出FPR和FPRL1的配体-结合位点不同。
GPCRs包括FPR通过结合到异质-三聚G-蛋白质而诱导细胞内信号传导，许多研究组一直试图揭示涉及G-蛋白质偶联中受体的关键氨基酸残基(23，24)。对FPR而言，Miettinen等构建了35种突变FPRs并考察了突变对FPR的G-蛋白质偶联以及细胞信号传导的影响。根据该文章，S63、D71、R123以及C124/C126对G-蛋白质与FPR的偶联非常重要(24)。在这些突变体中，R123A突变体不能介导钙的转移，但能通过fMLF诱导ERKs磷酸化(24)。已经推测Asp122和Arg123，其构成了保守的(D/E)RY结构域(FPR中的DRC)，参与了稳定受体无活性形式的氢键网络(24)。在该推测中，配体结合到受体引起氢键网络的改变，并且某些氨基酸残基例如DRY结构域中的精氨酸的暴露，从而能与G-蛋白质相互作用(24)。已经发现一些肽如WKGMVm可以诱导ERKs磷酸化但不能引起钙转移。因此判断WKYMVm或WKGMVm与FPR的结合是否诱导差异的受体构象改变非常重要；即尽管WKYMVm能诱导FPR的构象改变，包括DRY结构域的氢键的改变，WKGMVm只引起了显著的受体构象改变，而没有影响DRY氢键。在FPRL1的情况下，它也包含DRY结构域(FPRL1中的DRC)，但没有考察其在G-蛋白偶联中的作用。在这些结果中，不仅WKYMVm而且WKGMVm诱导FPRL1-表达RBL细胞中的钙转移(图1B)。这些结果表明WKYMVm或WKGMVm不影响FPR或FPRL1中DRY结构域的氢键。其它结合口袋也许参与肽结合，未来的工作中，识别涉及WKYMVm或WKGMVm与FPRs的差异结合模式中的残基非常重要。
到目前为止，已经报道了一些天然配体可以差异地调节FPR。在免疫系统中，脱粒作用或趋化迁移的差异调节对更精细的调节而言是必须的。从这个角度来讲，识别如本发明中的能够差异地调节FPR配体的工作非常重要。
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序列表<110>POSCO(POSCO公司)POSTECH Foundation<120>免疫调节肽<130>OPP030092KR<150>US60/352,930<151>2002-01-29<160>24<170>Kopatentin 1.71<210>1<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
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<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
<221>MOD_RES(修饰残基)<222>(6)<223>D-Met<400>2Trp-Lys-Tyr-Met-Gly-Met1 5<210>3<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<400>3Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Gly15<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
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人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
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<220>
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<223>免疫调节肽<220>
<221>MOD_RES(修饰残基)<222>(6)<223>D-Met<400>10Trp-Lys-Trp-Met-Val-Met15
<210>11<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>免疫调节肽<220>
<221>MOD_RES(修饰残基)<222>(6)<223>D-Met<400>11Trp-Lys-Arg-Met-Val-Met15<210>12<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
<221>MOD_RES(修饰残基)<222>(6)<223>D-Met<400>12Trp-Lys-Asp-Met-Val-Met1 5<210>13<211>6<212>PRT
<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
<221>MOD_RES(修饰残基)<222>(6)<223>D-Met<400>13Trp-Lys-Phe-Met-Val-Met1 5<210>14<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
<221>MOD_RES<222>(6)<223>D-Met<400>14Trp-Lys-Tyr-Met-Tyr-Met15<210>15<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
<221>MOD_RES<222>(6)<223>D-Met<400>15Trp-Lys-Tyr-Met-(Phe/Trp)-Met-1 5<210>16<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<400>16Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Glu15<210>17<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<400>17Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Val15<210>18<211>6
<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<400>18Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Arg15<210>19<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<400>19Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Trp15<210>20<211>5<212>PRT<213>A<220>
免疫调节肽<223>
<400>20Trp-Lys-Tyr-Met-Val15<210>21<211>5<212>PRT
<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
<221>MOD_RES<222>(5)<223>D-Met<400>21Lys-Tyr-Met-Val-Met15<210>22<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<400>22Lys-Tyr-Met-Val1<210>23<211>4<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
<221>MOD_RES<222>(4)
<223>D-Met<400>23Tyr-Met-Val-Met15<210>24<211>3<212>PRT<213>人工序列<220>
免疫调节肽<223>
<220>
<221>MOD_RES<222>(3)<223>D-Met<400>24Met-Val-Met权利要求
1.一种包含氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽。
2.权利要求1的肽，其中所述肽激活白细胞，并且是分离的和基本上是纯的形式。
3.一种衍生自肽的物质，所述肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQID NO24。
4.权利要求1的肽，其中所述肽具有至少一项下列性质(a)由人单核细胞或嗜中性白细胞诱导超氧化物的产生；(b)由人外周血单核细胞或嗜中性白细胞诱导细胞内钙增加；(c)与甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1结合；(d)体外诱导人单核细胞或嗜中性白细胞的趋化迁移；(e)诱导甲酰基肽受体表达的细胞或类甲酰基肽受体1表达的细胞中的脱粒作用；(f)通过激活甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1刺激细胞外信号-调节蛋白激酶磷酸化；以及(g)通过激活甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1刺激Akt磷酸化。
5.一种药物组合物，包括氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽；或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质。
6.一种治疗由改变白细胞数量或激活状态伴随或引起的疾病的方法，所述方法包括对需要这种治疗的宿主施用治疗有效量的肽，所述肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24，或衍生自氨基酸序列选自SEQ IDNO1～SEQ ID NO24肽的物质。
7.权利要求14所述的方法，其中疾病为细菌、支原体、酵母、真菌或病毒感染。
8.权利要求14所述的方法，其中疾病为炎症。
9.一种增加宿主中白细胞数或提升白细胞激活状态的方法，包括向需要增加更大量白细胞数或更高白细胞激活状态宿主施用治疗有效量的肽，所述肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质。
10.一种诱导需要这种治疗的病人的白细胞细胞外钙增加方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ IDNO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对这种诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
11.一种在需要这种治疗的病人中由人单核细胞或嗜中性白细胞诱导超氧化物产生的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对这种诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
12.一种在需要这种治疗的病人中由人外周血单核细胞诱导趋化迁移的方法，所述这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ IDNO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQID NO24肽的物质，所用量为对这种诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
13.一种为需要这种治疗的病人提供诱导甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中脱粒作用的方法，所述这种方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对这种诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
14.一种为需要这种治疗的病人提供与WKYMVm竞争结合甲酰基肽受体表达细胞中甲酰基肽受体的肽的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对这种诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
15.一种为需要这种治疗的病人提供与WKYMVm竞争结合类甲酰基肽受体1表达细胞中类甲酰基肽受体1的肽的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对这种诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
16.一种为需要这种治疗的病人提供刺激甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中细胞外信号调节蛋白激酶的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对这种诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
17.一种为需要这样治疗的病人提供刺激甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中Akt的方法，所述方法包括向所述病人施用一定量的氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24的肽，或衍生自氨基酸序列选自SEQ ID NO1～SEQ ID NO24肽的物质，所用量为对这种诱导或脱敏作用的治疗或预防有效。
18.权利要求所述6的方法，其中所述宿主受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
19.权利要求9所述的方法，其中所述宿主受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
20.权利要求10所述的方法，其中所述病人受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
21.权利要求11所述的方法，其中所述病人受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球性肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
22.权利要求12所述的方法，其中所述病人受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
23.权利要求13所述的方法，其中所述病人受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
24.权利要求14所述的方法，其中所述病人受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
25.权利要求15所述的方法，其中所述病人受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
26.权利要求16所述的方法，其中所述病人受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
27.权利要求17所述的方法，其中所述病人受由下列导致的疾病侵扰，感染、风湿性关节炎、兰姆氏关节炎、痛风、脓毒症综合征、体温过高、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、巨细胞病毒、牙周疾病、肾小球肾炎、肺慢性非感染性炎症反应、结节病、吸烟者者肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥反应、移植物对宿主的疾病、慢性骨髓白血病、急性骨髓白血病、瘤形成的疾病、支气管哮喘、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、牛皮癣、慢性B淋巴细胞白血病、普通可变型免疫缺陷病、播散性血管内凝血、全身性硬皮病、脑脊髓炎、肺炎症反应、高IgE综合征、癌症转移、癌症生长、继承性免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、脓毒症、再灌注综合征、术后炎症反应、器官移植或秃头症。
28.一种分离的核苷酸，包括的碱基序列编码氨基酸序列选自SEQ IDNO1～SEQ ID NO24序列的肽。
29.包含权利要求25核苷酸的载体。
全文摘要
本发明公开了具有SEQ ID NOs 1～24的肽，所述肽能诱导人单核细胞或嗜中性白细胞产生超氧化物；能诱导人外周血单核细胞或嗜中性白细胞中细胞内钙增加；能与甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1结合；能诱导人单核细胞或嗜中性白细胞的体外趋化迁移；能诱导甲酰基肽受体表达细胞或类甲酰基肽受体1表达细胞中的脱粒作用；能经甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1的激活，从而刺激细胞外信号调节蛋白质激酶磷酸化；或能经甲酰基肽受体或类甲酰基肽受体1的激活，刺激Akt磷酸化。
文档编号C07K7/06GK1533399SQ03800414
公开日2004年9月29日 申请日期2003年1月28日 优先权日2002年1月29日
发明者柳成浩, 徐判吉, 裵外植, 宋芝英 申请人:Posco公司, 学校法人浦项工科大学校