一种il-12检测试剂盒的制作方法

文档序号:8297983阅读:857来源:国知局
一种il-12检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种与复发性流产相关的IL-12检测试剂 盒。所述试剂盒属于Alphalisa-均相化学发光检测技术,本发明的检测试剂盒可以反映体 机细胞免疫功能状态,用于复发性自然流产病因筛查,辅助诊断复发性自然流产,以及复发 性自然流产免疫调节治疗中的治疗反应性监测等,作为个体化综合治疗中关键循证医学依 据。
【背景技术】
[0002] 复发性自然流产(recurrentspontaneousabortion,RSA)是指连续发生2次或2 次以上自然流产者,发病率约占妊娠总数的1-5%,严重影响人类生殖健康。RSA的病因复 杂,约50%与染色体异常、生殖系统解剖结构异常、内分泌失调及感染等因素有关,另50% 左右原因不明,而经过近20年的发展,逐渐明确80%以上所谓的原因不明RSA都与免疫因 素相关,免疫因素参与人类生殖各阶段的功能调控,包括受精、胚胎植入、胎盘形成、胎儿发 育及分娩等。
[0003] 妊娠被视为一种独特的半同种异体移植过程,成功妊娠意味着母体免疫系统对胚 胎抗原的免疫耐受:调节性T细胞(regulatoryTcells,Treg)扩增;母体Th2型免疫优 势;滋养细胞Fas配体(FasL)丰度表达;抑制性信号(PD-Ll,Stat3和TGF-0)和协同刺激 分子(CD80和CD86)之间的平衡;一氧化氮(N0),乳糖凝集素(galectin-1)和吲哚胺双加 氧酶(indoleamine2,3_dioxygenase,ID0);滋养细胞高表达HLA-G;此外,B细胞、Thl7 细 胞及存在于外周血与子宫内膜的自然杀伤细胞(naturalkillercells,NK)功能调控等均 是母胎免疫耐受及成功妊娠的关键。这种耐受机制的失调可导致母体对胚胎的免疫排斥, 在临床上主要表现为反复胚胎移植失败(recurrentimplantationfailure,RIF)、RSA、胎 儿宫内发育迟缓(intrauterinegrowthretardation,IUGR)和子痫等病理妊娠。
[0004] IL- 12是细胞介导免疫中非常重要的细胞因子。其主要免疫调节作用是诱导早 期辅助性T母细胞(Thnaive)分化为Thl细胞,并促进Thl细胞的发育和增殖。辅助性T细 胞(helperTcell,Th)是细胞介导免疫应答和B淋巴细胞产生抗体所必需的,可分为Thl 和Th2两个亚群。前者产生IL-2、IL-3、IFN-丫和淋巴毒素及粒细胞2巨噬细胞集落刺激 因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM_CSF)等,参与细胞免疫; 而后者则产生IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等细胞因子,辅助B细胞产生抗体,参与体液免 疫。IL一 12能促进T细胞和NK细胞的增殖。对外周血分离T细胞、培养T细胞克隆、CTL 细胞系和TIL细胞都有启动生长增殖效应,IL一 12还可刺激⑶4+和⑶8+的TCR-a0+T 细胞或TCR-yS+淋巴母细胞的增殖,而IL-2抗体或受体不能抑制其增殖,因此这一效应 不依赖于IL-2。说明IL一 12效应独立于IL-2。。IL一 12还可刺激NK细胞和T细胞产生 IFN-y,发挥免疫调节功能。
[0005] IL-12在正常人体内含量极低(小于100ng/L),目前市场上的检测方法均为ELISA 法,比如R&D公司的IL-12ELISA试剂盒检测灵敏度为15ng/L,线性区间为31. 2-2, 000ng/ L,批内CV%大于5. 5。对于低于31. 2ng/L和高于2,OOOng/L的患者难以准确测定,需要建 立一种高灵敏宽检测区间的IL-12的检测方法。
[0006] Alphalisa是以纳米级高分子微球为基础的新一代化学发光技术,该项技术将被 广泛地应用于研宄生物分子的相互作用。其主要原理是由光激发产生的均相化学发光技 术。它具有快速、均相(免冲洗)、高灵敏和操作简单的特点。Alphalisa试剂由含有感光 化合物的供体微球和含有发光化合物的受体微球组成,微球直径约188nm表面覆盖多糖水 凝胶。水凝胶能减少非特异性结合,同时,增加微球的悬浮性。微球通过水凝胶表面的功能 团与生物分子共价连接。纳米级微球大大增加了反应的表面积,每个微球的表面包被着成 百上千个生物分子,可捕获目标分子。
[0007] AlphaLISA技术主要依赖于Alpha供体微珠和受体微珠的相互作用。当生物反应 使供体微珠和受体微珠相互接近时,激光激发级联反应,从而产生极大放大的信号。具体 来说,在680nm的激光照射下,供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃 的单体氧。单体氧扩散至受体微珠,产生一系列的化学发光反应,最后将能量传递到铕,发 射波长为615nm。在生物分子不存在特异的互相作用时,单体氧无法扩散到受体微珠,则不 会有信号的产生。

【发明内容】

[0008] 鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种与复发性流产相关的 IL-12检测试剂盒及其使用方法和用途,用于解决现有技术中的问题。
[0009] 为实现上述目的及其他相关目的,本发明第一方面提供一种与复发性流产相关的 IL-12检测试剂盒,包括抗IL-12抗体包被的受体微球、生物素标记的抗IL-12抗体和亲和 素包被的供体微球。
[0010] 优选的,所述检测试剂盒还包括IL-12抗原标准品。
[0011] 更优选的,所述IL-12抗原标准品为冻干品。在使用时加入分析缓冲液,配置成对 应的浓度范围。
[0012] 更优选的,所述IL-12抗原标准品的浓度范围为0-2000ng/L。
[0013] 本发明一优选实施例中,分析缓冲液的配置为:pH7.4的25mMHEPES,0. 5% TritonX-100,0? 1 %干酷素,lmg/mL葡聚糖 500。
[0014] 在本发明一优选实施例中,IL-12抗原标准品共6瓶,IL-12浓度分别为:0ng/L, lng/L,25ng/L,50ng/L,1000ng/L,2000ng/L。
[0015] 优选的,所述检测试剂盒还包括微孔板。
[0016] 更优选的,所述微孔板为白色不透明微孔板。
[0017] 优选的,所述检测试剂盒还包括分析缓冲液。
[0018] 优选的,所述抗IL-12抗体包被的受体微球中,受体微球为Alpha受体微球,IL-12 抗体与受体微球按重量比1 :45-55进行包被。即抗IL-12抗体包被的受体微球的制备过程 中,所加入的IL-12抗体与受体微球的重量比为1 :45-55。
[0019] 更优选的,所述Alpha受体微球直径为166-210nm,表面覆盖多糖水凝胶。
[0020] 在本发明一优选实施例中,所述Alpha受体微球由perkinelmer公司 (Massachusetts,USA)提供。
[0021] 微球表面的水凝胶能减少非特异性结合,同时,增加微球的悬浮性。微球通过水凝 胶表面的功能团与生物分子共价连接。纳米级微球大大增加了反应的表面积,每个微球的 表面包被着成百上千个生物分子,可捕获目标分子。
[0022] 优选的,所述抗IL-12抗体包被的受体微球的制备方法,包括如下步骤:
[0023] 1)将洗涤后的Alpha受体微球5mg和抗IL-12抗体0?lmg混合,加入适量的磷酸 缓冲溶液,使最终反应量达到200yL;适量吐温20水溶液和NaBH3CN水溶液;
[0024] 2)在 35-39°C下孵育 18-24 小时;
[0025] 3)在反应体系中加入封闭液封闭未反应的位点,在35_39°C下孵育,孵育时间多1 小时;
[0026] 4)离心去除上清液,将微球溶于Tris-HCl溶液中;
[0027] 5)离心之后即得所述抗IL-12抗体包被的受体微球。
[0028] 将所得抗IL-12抗体包被的受体微球溶于储存缓冲溶液中,并对微球溶液进行涡 流和超声后,即得抗IL-12抗体的受体微球溶液,置于4°C下保存。
[0029] 在本发明一优选实施例中,微球以5mg/mL溶于储存缓冲溶液中,所述储存缓冲溶 液为PBS缓冲液,所述P
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