免疫调节寡肽的制作方法

专利名称：：免疫调节寡肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫学领域，更具体地，涉及免疫调节寡肽。
背景技术：
：对生物活性短多肽序列(寡肽)的研究始于20世纪70年代后期，那时发现了第一个影响免疫系统的胸腺来源的肽。一种这样的肽为三肽Tyr-Gly-Gly(YGG)(还以名称Imreg而为人们所知；US4,699,898),其为一种较弱的拟胸腺素(thymomimetic)。其他的实例是促吞噬肽(Tuftsin)(也称为Tafcin)及其相近的类似物Rigin，分别具有序列Thr-Lys-Pro-Arg(TKPR)和Gly-Gln-Pro隱Arg(GQPR)，例如参见Biondietal"Int.J.PeptideProteinRes.H，112-121,1991以及Verdinietal"J.Med.Chem.M,3372-3379,1991.。促吞噬肽及其类似物是IgG的片段，例如在白细胞激肽(leukokinin)的重链中所发现的。促吞噬肽是一种众所周知的巨噬细胞激活剂，并且已知其可刺激NK活性。其他的片段是五肽胸&袈喷丁，Arg-Lys-Asp-Val-Tyr(RKDVY)或其四肽Arg-Lys-Asp-Val(RKDV)及其类似物脾喷丁(splenopentin)Arg-Lys-Glu画Val國Tyr(RKEVY)(US5,091,510;Audhyaetal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA^L2847-2849，1984)。它们是诱导T细胞表型分化并增加IL-2产生的具有较弱效力的拟胸腺素。从褐色海藻中分离到爱森肽(eisenin),L画pyroGlu-L-Gln-L-Ala(Kojimaetal"J.Immunother.11,36-42,1993)其表现出增加人外周血淋巴细胞(PBL)的天然细力包毒性的免疫活性。在US5,980,913中乂^开了根据通式X-R广R2-R3-R4-Y的寡肽，其中，X选自由H或乙酰基组成的组；R4选自由D或L-赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸和组氨酸组成的组；112选自由D或L-天冬酰胺、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸组成的组；R3选自由D-或L-脯氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬氨S臾和甘氨酸组成的组；R4选自由D或L-酪氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸组成的组；以及Y选自由OH、丽2和OC^烷基组成的组，其中特别提及了若干个包4舌序列(D，L)Lys-Asn/Gln-Pro/Gly-Tyr(K[N/Q][P/G]Y)的肽。已经表明这些肽在免疫缺陷的治疗中是有益的。另外，已经描述了二肽Glu-Trp(EW，Timogen)和三肽或四肽X-Glu-Trp-Y，其中X和Y可以基本上是全天然的氨基酸(WO89/06134;WO93/08815和US6,159,940)。由此，三肽Ile-Glu-Trp(IEW),也称为Neogen,已经被用于治疗免疫和/或造血紊乱的治疗。表1中列出了已知具有生物功能的若干寡肽。这些寡肽可以根据它们的来源分成三个主要的组1.来自胸腺、脾脏或者骨髓组织的分离物，其看上去是在免疫细胞生长和机能分化的不同阶段在免疫系统中所采用的肽。2.蛋白质降解产物(例如，来自乳酪蛋白、免疫球蛋白等)，其行^使免疫调节功能，通常与巨噬细胞的功能相关。3.神经调节肽，其通过免疫系统和神经系统之间的复杂的相互作用对生物体的免疫反应起作用。9历史上，开发这样的化合物的方向是基于、并且仍然主要地基于研究并进一步开发具有生物活性的天然存在的肽。若干研究小组尝试制成4交短的生物学肽(biologicalpeptide),试图在细月包因子、粘着蛋白和一些表面受体中识别最短的功能基序。除此之外，现在正在尝试对表现所需的生物学特性的寡肽进4亍广泛筛选。我们相信对于可替代的肽免疫调节剂仍然存在需求。
发明内容在筛选方案进4亍过程中，目前本发明人已经发现一类新的免疫活性寡肽。因此，本发明涉及一种寡肽，其为具有通式X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽，其中X可以选自由Ile(I)、Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)组成的组，其中所有的氨基酸可以是D或L构型。尤其优选寡肽I-P-Y。在另一种实施方式中，本发明涉及一种在N端包括上述三肽的寡肽。具体地，本发明涉及选自由以下组成的组中的寡肽IPYKTTKS、KTTKSIPY、IPYVGVAPG、VGVAPGIPY、IPYVGV、VGVIPY、IPYIEW、IEWIPY、EWIPY、IPYKE、KEIPY、IPYKPR、KPRIPY、IPYTEPR、TEPRIPY、IPYKD、KDIPY、IPYKNPY、KNPYIPY、IPYKNPW、KNPWIPY、IPYTKPR、IPYGQPR、IPYTAEEK、IPYALTTE、IPYRKEVY、GPAIPY、KDIPIPY、TQPIPY、GQPIPY、TAEIPY、ALTIPY、RKEIPY、IPYEKXiEKXJPY、IPYX!EKX，EKIPY、IPYEWX^EWXJPYIPYX!VY、X!VYIPY、IPYX^Y、X^YIPY、IPYPRXi和PRXJPY,其中Xi选自由A、V、G、I、P、W、F、N、Q、T、R、K、E、D和Y组成的组。尤其优选寡肽IEWIPY。在另一种实施方式中，上述寡肽N端被乙酰化、与棕榈酸结合(或辄合，conjugate)或者是所述寡肽的棕榈酸(盐)。根据本发明的上述寡肽或根据本发明的结合物(或轭合物)在治疗中是有益的，优选在激活T细胞和/或诱导细胞因子释放和/或提高T细胞依赖性体液和/或细胞免疫应答和/或抑制自身免疫应答中。另一种实施方式是一种药物组合物，包括根据本发明的寡肽或结合物以及药用载体。这种药用化合物可用于上述相同的治疗目的。可替代地，本发明包括根据本发明的寡肽或结合物在制备用作免疫调节剂、优选用于激活T细胞和/或诱导细胞因子释放和/或提高T细胞依赖性体液和/或细胞免疫应答和/或抑制自身免疫应答的药物中的应用。本发明还包括一种包括本发明的寡肽或结合物的疫苗。此外，本发明的一部分为一种通过将本发明的药物组合物加入所述疫苗中来提高疫苗的免疫原性的方法。本发明的另一部分为一种利用根据本发明的药物组合物来治疗哺乳动物的方法，其中所述哺乳动物优选地选自由人、牛、猪、羊、《句、3苗和动4勿园动4勿(zooanimal)纟且成的纟且。在另一种实施方式中，本发明包括一种方法，通过将肽与本发明的肽融合(fusing)乂人而j3武予所述肽免疫反应性或^是高所述肽的免疫反应性。图l示出了在免疫作用后，与对照(黑色线)相比，B134(三肽Ile-Pro-Tyr;深灰色线)以及B211(寡肽IEWIPY，浅灰色线)对小鼠血清中免疫球蛋白浓度(分别对IgGl、IgG2a、IgG2b和IgM)的影响。图2示出了共接种疫苗(covaccination)B134(深灰色柱状)或B211(浅灰色柱状)导致的免疫应答相关基因(白细胞介素、细胞因子和细胞因子受体)表达的改变。将对照组表达设定为0。具体实施例方式才艮据本发明的寡肽是由氨基酸构成的化合物，其通过肽4建连接，最大长度为9个氨基酸。寡肽可由天然存在的氨基酸(参见表2的列表)或非天然存在的氨基酸组成，非天然存在的氨基酸例如正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、抑胃酶氨酸(statine)、锁链(赖氨)素、GABA、肌氨酸、异锁链(赖氨)素、别异亮氨酸、p-丙氨酸以及它们的衍生物，如2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸(piperidinicacid)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、2,2，-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天门冬酰胺、别羟赖氨酸(all-hydroxylysine)、羟赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、N-曱基异亮氨酸、6-N-曱基赖氨酸、N-甲基缬氨酸及其他(参见其他实例，如Hunt,S.,Thenon-proteinaminoacids.发表在ChemistryandBiochemistryoftheAminoAcids.Barrett,G.C.(ed.)，Chapmanand12Hall，伦敦，1985)。另外，寡肽可以全部是L氨基酸，或全部是D氨基酸或它们的组合。还包括寡肽的盐，尤其是棕榈酸盐，并进一步包括寡肽与棕榈酸的结合物。在本申请中，肽是根据以下表格通过三字母代码或他们的单一字母IUPAC代码而标明的表2天然存在的氨基酸列表丙氨酸AlaA精氨酸ArgR天门冬酰胺AsnN天门冬氨酸AspD半胱氨酸CysC谷氨酰胺GinQ谷氨酸GluE甘氨酸GlyG组氨酸HisH异亮氨酸lieI亮氨酸Leu赖氨酸LysK蛋氨酸MetM苯丙氨酸PheF脯氨酸ProP丝氨酸SerS苏氨酸ThrT色氨酸TrpW酪氨酸TyrY缬氨酸ValV当指出为D-或L-同分立体异构体(isostereomer)时，它们具有特定的含义，如果未指出，则氨基酸可以是L-或D-异构体。13人们发现具有通式X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽具有免疫调节特性，其中X可以选自由Ile(I)、Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)纟且成的组，并且其中所有的氨基酸可以各自是D或L构型。可优选地，该三肽是IPY，其已得到广泛的验证(参见实验部分)。令人惊讶的是，人们已经发现当将该三肽与另一种肽连接时，无i仑另一种肽是否也具有免疫调节活性，该三肽仍保持其免疫调节活性。如果它具有免疫刺;敫活性(如肽IEW)，则六肽IEWIPY或IPYIEW相对于母体化合物IEW将表现增强的免疫活性。不论IPY三肽位于其所连4妾的肽的N端还是C端，并没有表现出4艮大的差别。然而，优选的组是在其N端具有IPY的肽的组。这在本发明中非常复杂，该三肽无需位于其所结合的肽的末端，而是同样可以在肽序列内设计该三肽，条件是其位于一个能够暴露在环境中并由此发挥其功能的位置。同样，当然，如果需要的话，在其他肽中引入该三肽应该-使其他肽的原始功能保持完好。当连接至肽抗原或抗原决定簇(epitope)时，其将促进免疫系统开始向所述抗原或抗原决定簇增殖抗体。因此，三肽是一种用于推动对疫苗接种的免疫应答、以及用于方便给药和稳定性的理想佐剂(adjuvans)，如果该三肽是蛋白质性质的，则它可以,皮连4妄至抗原/抗原决定蔟。包4舌本发明的三肽的寡肽的具体实例是IPYKTTKS、KTTKSIPY、IPYVGVAPG、VGVAPGIPY、IPYVGV、VGVIPY、IPYIEW、IEWIPY、EWIPY、IPYKE、KEIPY、IPYKPR、KPRIPY、IPYTEPR、TEPRIPY、IPYKD、KDIPY、IPYKNPY、KNPYIPY、IPYKNPW、KNPWIPY、IPYTKPR、IPYGQPR、IPYTAEEK、IPYALTTE、IPYRKEVY、GPAIPY、KDIPIPY、TQPIPY、GQPIPY、TAEIPY、ALTIPY、RKEIPY、IPYEKX!EKXJPY、IPYXfKXjEKIPY、IPYEWX^EWXJPYIPYXiVY、X!VYIPY、IPYX^Y、XiPYIPY、IPYPRXi和PRX!IPY，其中Xi选自由A、V、G、I、P、W、F、N、Q、T、R、K、E、D和Y组成的组。本领域的才支术人员将会注意到，许多列举出的寡聚物(主要为六肽)出现在表l的列表中，即，它们是已经被证明具有免疫效应的已知寡肽。尽管上述列表仅仅提到了具有IPY的组合，但通常，其中的IPY被本发明的三肽取代的所有组合都具有免疫调节特性，所述三肽即为那些具有通式X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽，其中X可以选自由Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)组成的组，并且其中所有的氨基酸可以分别是D或L构型。在这些组合肽的情况中，得到的肽不需要是寡肽。可以想象，尤其是在将三肽连接到抗原的情况下，得到的肽可以具有任意长度。地方通过常规的方法来进行重组制备。在以下的实-验部分中详细才皮露了寡肽的具体实施方式。优选地，本发明的寡肽是通过已知的化学合成才支术，例如由Merrifield(J.Am.Chem.Soc(1963)85:2149-2154)所披露的，进行常规合成的。可替代地，本发明的(寡)肽可以通过重组DNA技术，通过在宿主樣i生物或细胞内克隆并表达携带有编码上述肽中的一种的核酸序列的DNA片段而进行制备。核酸编码序列可以合成制备，或者可以通过定向i秀变(site-directedmutagenesis)由王见有的才亥酸序列衍生得到。然后可将这些核酸序列在合适的表达载体中克隆并转化或转染到合适的宿主细胞中，如大肠杆菌(￡.co//)、杆菌属(5ac/〃ws)、享'L(酸)才干菌属(i^"o6ac/〃ws)、链霉菌属(5^e/tom;;c^)、哺乳动物细月包(如CHO、HEK或COS-l细月包)、酵母(^口酵母菌(Sacc/^row;;ce51)、裂命笞菌(Sc/n'zo//^〃wm))、昆虫细胞或病毒表达系统中，如杆状病毒系统。本领域的技术人员应知晓构建核酸序列的技术以及提供使该核酸序列能够表达的手段的技术。通过基因工程技术，在肽中包括非天然存在的氨基酸(如D-氨基酸)也是可能的。这已经在Norenetal.，Science244:182(1989)和Ellmanetal.Meth.Enzvmol.202:301(1991)中进4亍了广泛描述。随后，可以将肽从宿主细胞的培养物中分离出来。这可以通过本领域可用的常用蛋白质纯化和分离技术而获得。这种技术可以包括如免疫吸附或色谱法。也可以在合成过程中为肽提供标签(如组氨酸标签)，其允许快速结合和纯化，然后，通过酶促去除标签而获得活性肽。如果肽本身不能被编码或表达，但其与可以被编码或表达的肽非常相似，则可以釆用该方法来制备与该肽相似的肽，然后利用一个或多个步骤来制备最终的肽，在这些步骤中通过化学或酶促技术(enzymatictechnique)对所述狀进行修饰。寡肽也可通过利用蛋白水解酶(如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶(papaine)等)乂人4交大的肽上切割(cleave)下寡肽而获得。关于可应用于肽制备中的方法的一些更加全面的概括在以下文件中得到描述W.F.Anderson,Nature392Supp.，30April1998，p.25-30;PharmaceuticalBiotechnology,Ed.D.J.A.CrommelinandR.D.Sindelar，HarwoodAcademicPublishers,1997,p.53-70，167-180，123-152,8-20;ProteinSynthesis:MethodsandProtocols,Ed.R.Martin,HumanaPress,1998,p.1-442;Solid-PhasePeptideSynthesis,Ed.G.B.Fields,AcademicPress,1997，p.1-780;AminoAcidandPeptideSynthesis,OxfordUniversityPress,1997，p.1-89.。本领域的技术人员能够容易地制备根据权利要求1-3中任一项所述的新型肽。本发明的一种具体实施方式是形成本发明的任何寡肽与棕榈酸(十六烷酸，C16H3202)的结合物(或轭合物)或者由通过寡肽与棕榈酸反应而形成的盐形成。这种结合(或轭合)使得本发明的肽更好地渗透过皮肤和其他上皮组织。类似地，在N端的氨基酸可以-波乙酰化。因此，本发明的又一个优选部分是三肽IPY，其中异亮氨酸部分被乙酰化，或者其中所述肽与椋榈酸结合(或辄合)或该肽为棕榈酸盐的形式。本发明的药物组合物包括治疗有岁文量的一种或多种本发明的寡肽或结合物。本发明的药物组合物一旦配制成，就可以直4妾将其以治疗有效量给药至需要其的对象。该组合物的直4妄递送通常可通过局部应用或其^f也纟会药形式，口服、肠胃外、皮下、舌下、鼻内、损伤内(intralesionally)、腹膜内、静月永内或月几肉内、肺内给药，或递送到组织的细月包间隙(interstitialspace)中而实施。药物组合物还可以包括合适的药用载体或稀释剂并且可以以月交嚢、片剂、4定剂(lozenge)、泮唐4t剂(dragee)、丸剂、滴剂、才全剂、粉剂、喷雾剂、疫苗、软膏剂、糊剂、乳剂、吸入剂、贴剂、气雾剂等形式存在。作为药用载体，可以使用任何最适用于特定的剂型并可与肽或肽结合物相容(compatible)的溶剂、稀释剂或其4也液体贝武形剂、分散剂或;昆悬-力剂(suspensionaid)、表面;舌'性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂，成胶嚢剂、固体粘合剂或润滑剂。因此药物组合物可含有药用载体。术语"药用载体"也包括用于对治疗剂，如抗体或多肽、基因和其他治疗剂进行给药的载体。该术语是指本身并不具有任何免疫效应，并且其^皮给药而不产生过度毒性的任何药用载体。适合的载体可以是较大的、緩慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸(polymericaminoacid)、氨基酸共聚物，以及无活性的病毒颗粒。这样的载体对于本领域的普通技术人员而言是已经熟知的。寡肽或结合物的盐可通过已知的方法制备，其通常包括将肽或结合物与药用酸混合来形成酸加成盐，或与药用石咸混合来形成石威加成盐。在考虑到化合物具体的预期应用之后，本领域技术人员能够容易地确定酸或石咸是否是药用可4妄受的。例如，不是所有可4妄受用于体外应用(exvivoapplication)的酸和石咸老卩可以用于治疗性《且合物，并且不是所有适合局部使用的酸和碱都可以进行肠胃外使用。取决于预期的应用，药用酸包括有机和无机酸，如曱酸、乙酸、丙酸、乳酸、羟基乙酸、草酸、丙酮酸、琥珀酸、马来酸、丙二酸、肉桂酸、石克酸、盐酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸，以及硫氰酸，其与肽和结合物的游离氨基形成铵盐。因此，尤其优选的是与本发明的寡肽制成盐的棕榈酸。与肽和功能性等同^,^R物(functionalequivalent)的游离羧基形成羧酸盐的药用碱包括乙胺、曱胺、二甲胺、三乙胺、异丙胺、二异丙胺，以及其他单-、二-和三烷基胺，以及芳香胺。ot匕外，也可包4舌药用溶剂4b物(solvate)。可以将药用盐用于，例如，无才几酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、石粦酸盐、碌L酸盐等；以及有才几酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯曱酸盐等之中。关于药用赋形剂的详尽讨论可以在雷明顿药学大全(Remington'sPharmaceuticalSciences)(MackPub.Co.,N丄1991)中获得。治疗性组合物中的药用载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这样的赋形剂中可以存在辅助性物质，如湿润剂或乳化剂、pH緩冲物质等。通常，肠胃外治疗性组合物可被制成血管注射剂，如液体溶液或混悬液；也可以^皮制成在注射之前适合在液体赋形剂中形成溶液、或混悬液的固体形式。脂质体包括在药用载体的定义内。对于治疗性处理，可如上所述制备寡肽或结合物并将其应用至需要其的对象中。肽或肽-结合物可通过任何适合的途径，优选以适合于这种途径的药物组合物的形式并以对于预期处理有效的剂量，给药至对象。本发明的药物组合物可包括其他活性剂，如抗原或抗原决定簇(如用于常用疫苗中的)或其他免疫活性化合物，如表l中的任何肽。具有抗病毒剂(如AZT)、抗贫血药物(如GM-CSFEPO)的组合也在本发明的考虑中。最优选地，将本发明的肽与疫苗进行联合给药(co-administrate)。如上所述，肽也可以是结合物或者以其他方式与上述免疫活性化合物结合。本领域的技术人员可以容易地确定用于引起人或动物对象体内的免疫调节反应所需的肽或肽结合物的治疗有效剂量，例如通过利用动物^t型。本文使用的术语"治疗有效量"是指治疗性的，即根据本发明的寡肽或肽-结合物，表现出免疫调节反应的量。如在本实施例中说明的，本领域的技术人员将能够通过确定体液免疫应答、或激活各种基因的细^J敫活作用，来确定表现免疫调节作用所需要的肽的量。对于受治疗者的准确有效量将取决于受治疗者的体型和健康状况、病情的性质和程度，以及选择用于给药的疗法或疗法的组合。因此，事先指定一个精确的有效量是不实用的。然而，对于给定情19况的有效量则可以通过常规的实验来确定并且在临床医生或实验员的判断范围内。特别是，本发明的组合物可用于通过激活T细胞和/或谈导细胞因子的释放和/或提高T细胞依赖性体液和/或细胞免疫应答和/或减少免疫反应(例如，通过抑制自身免疫应答)，来增强哺乳动物，优选人、或家畜(如狗、猫、猪、牛等)中的免疫反应。临床医生建立初始剂量的方法在本领域中是已知的。确定进行给药的剂量必须是安全并有效的。出于本发明的目的，在进行给药的个体或动物中，有效剂量是从约0.01(ig/kg至50mg/kg，优选0.5吗/kg至约10mg/kg的寡肽或肽-结合物。本领域的技术人员可以容易地确定本文中描述的用于获得药物组合物的治疗效果的剂量。仍然在另一种可^齐代的实施方式中，本发明的寡肽或肽-结合物或组合物可以由引入受治疗者体内的受控释放或持续释放的基质(matrix)进行给药。以经粘膜(transmucosal)的剂型给药本发明的化合物也可以是有利的。该给药途径是非侵入性的并且是患者-友好型的(patient-friendly);并且特别是在对伤口和溃疡(sore)的治疗中，与口服给药相比，特别是如果化合物在消化系统的流体中不稳定，或者如果化合物太大以致不能从消化道中有效地被吸收时，可以提高该化合物的生物利用度。经粘膜给药是可能的，例如，经由鼻中、口含、舌下、牙龈、或阴道剂型，但是在这种应用中尤其考虑的是给药至开方文性创伤以改善伤口愈合效果。这些剂型可通过已知4支术制备；它们可以被配制为代表性的滴鼻剂或喷雾剂、插入物(insert)、膜、贴片(patches)、凝胶剂、寿欠膏剂，或片剂。优选地，用于经粘膜剂型的赋形剂包括一种或多种提供粘膜粘附(mucoadhesion)的物质，因此延长剂型与吸收位置的接触时间并从而潜在地提高吸收程度。20在另一种实施方式中，利用定量吸入器(metereddoseinhaler)、雾化器、喷雾器(aerosolspray)或干粉吸入器，经由肺部途径对化合物进行给药。这些种类的剂量给药形式非常适用于疫苗接种的情况。合适的配方(formulation)可以通过已^口的方法和才支术制备。经皮、直肠、或眼部给药在一些情况下也是可^f亍的。利用先进的药物递送或輩巴向方法(targetingmethod)更力口有戋文地递送本发明的化合物是有利的。例如，如果选择非-肠胃外给药途径，则合适的剂型可包括生物利用度增强剂，其可以是提高化合物的生物利用度的任何物质或物质的混合物。这可以通过，例如，保护化合物防止其降解(如通过酶抑制剂或抗氧化剂)来实现。更优选地，增强剂通过提高吸收屏障(通常是粘膜)的渗透性而提高化合物的生物利用度。渗透增强剂可通过各种机制起作用一些是提高粘膜的流动性，而其他的则打开或拓宽粘膜细胞之间的间隙连接。另外还有其他降低覆盖粘膜细胞层的粘液的粘度。优选的生物利用度增强剂是两性物质，如胆酸衍生物、磷脂、乙醇、脂肪酸、油酸、月旨肪酸书f生物、EDTA、卡波姆(carbomer)、聚卡波非(polycarbophil)和壳聚糖。如在实施例中所示，可以发现本发明的寡肽具有很强的与免疫系统激活有关的免疫调节活性，通过激活对T-协助细月包(T-hdpercell)依赖性抗原的免疫应答正常过程的相关基因来提高体液免疫应答的水平。因此，这意p木着本发明的寡肽^皮可以应用到T细胞的激活中，从而诱导细胞因子的释放，由此影响其他免疫性和非免疫性细胞群的活性。特别是，可以发现本发明的寡肽可以刺激免疫细胞群的增殖、分化和;敫活。应用之一(其中，该寡肽可进行治疗性使用)是对处于上皮组织中的T细胞的效应，其中这些T细胞影响着诸如上皮细胞生长、伤口愈合以及头发生长的多种过程。另一种应用是对T细胞应用该效应，以促进只于夕卜部4元原(externalantigen)的体、液和细月包免疫应答。这意p木着寡肽可用作疫苗中的佐剂以增加免疫应答。因此，本发明的肽可以用于所有的细菌和/或病毒感染中。这种应用可以是治疗性的，但也可以考虑本发明的肽的预防性给药(prophylacticadministration)。在后一种的情况中，将会带来免疫抗性的一般性增长。因为肽能够刺激免疫系统，所以在包括人的哺乳动物中是有用的。在兽医应用中，尤其用于家畜，如猪、牛、猫、狗、马和动物园动物中。此外，本发明的寡肽可以在自身免疫疾病的治疗中起到作用。现在将以以下的非限制性实施例来说明本发明。实施例实施例1.在小鼠中，B134和B211对T细胞依赖性抗原的体液免疫应答的效应肽Ile-Pro-Tyr(IPY，B134)和IEWIPY(B211)作为由本申"i青所覆盖的肽家族的有关生物活性的实例。为了研究B134(XPY家族的代表)的效应，用KLH(—种T细月包依赖性抗原)免疫近亲繁殖的SPF小鼠(Balb/c^w7VO/,7至8周龄，查尔斯河实-验室(CharlesRiverLaboratories)GmbH,德国)。每组3只小鼠，在完全弗罗因德佐剂(水油乳剂佐剂，Freundadjuvant)(50/50v/v)的存在下进行皮下注射。将抗原(在100^1中20pg)与佐剂(Sigma,#F-5881)的混合物乳化并注射到颈部区i或。在同一天，20pg免疫调节剂B134或B211在200[J的PBS中进行腹膜内注射。在第7、14、21和28天从小鼠的腿静脉收集血液样品(50-70jil)。通过以下程序来制备血清在37。C下凝结血液2小时，然后置于8°C下18小时，并在Eppendrof之类(Eppendrof-like)的离心才几中以10,000rpm进4亍离心。用抗体穂、定剂(SkyTecABB500)稀释血清并储存在4°C下，并同时进行ELISA分析。为了后面的分析，用在磷酸緩冲溶液(PBS)中的KLH(可溶性的，SigmaH7017)包被96孑LELISA板(Greiner,#655061)，0.2pg/孑L，在4。C下过夜。在室温下用抗原(200ng/孑L)培养稀释的血清1小时，然后用PBS/0.l%Tween-20清洗。利用与HRP(SouthernBiotechnologyLtd.,抗小鼠IgM#1021-05、抗小鼠IgGl#1070-05、抗小鼠IgG2a弁1080-05、抗小鼠IgG2b#1090-05)结合的同型特异性抗小鼠免疫球蛋白(isotypespecificanti-mouseimmunoglobulin)，根据生产商的说明书，检测小鼠抗体与KLH的结合。用TMB作为底物。在Bio-Rad孩M反读凄t才莫型(MicroplateReaderModel)550上分析结果，在595nm下测量光密度。图1中示出的结果表示从实验小鼠中得到的血清的滴定斜率(titrationslope)。所使用的血清的稀释度是从1/300至1/20,000，1/2级(stepof1/2)(分别在X轴以1至6示出)。血清的反应性可表示为ELISA中的样品示出的O.D值。点代表3个血清样品的平均反应性(来自每种条件下的3只小鼠)。变分柱图(variationbar)表示95%的置信区间。可以,人图1中看出，在单次注射(singleinjection)特异性抗体后，在第28天，用免疫调节剂免疫的小鼠和未用免疫调节剂免疫的小鼠的滴定度显著不同。因此，在存在B211下免疫的小鼠的血23清中特异性IgGl的滴定度与4又用抗原免疫的对照小鼠相比大约高16倍，IgG2a和IgG2b的滴定度与仅仅用抗原免疫的对照小鼠相比高4倍。对于B134，对于分析的每种同种型，差异为大约高2倍。实施例2利用PCR分析来测定B134对小鼠脾细胞中的基因表达的效应。用抗原或肽或二者的组合对近亲繁殖的SPFBalb/c小鼠(雌性，12周龄)进行注射。作为注射物，将25昭的肽溶解在250(il的无菌PBS中。用胰岛素针在颈部区域实施皮下注射。对照小鼠仅注射PBS。对于抗原注射将250^1无菌绵羊红血J求悬浮液(SRBC来自QuadFiveInc.,Cat#643-100)从侧腹进行腹膜内注射。将悬浮液制备成2ml的初始悬浮液，用PBS清洗2次(1500rpm，5分钟)并重新悬浮在2ml中。将10(xl的50%悬浮液用250plPBS稀释并进行注射。48小时后，处死小鼠，分离它们的脾，分离后立即浸入到RNALater(AmbinoInc.,Cat#7021)中。^!寻RNALater中的才羊品立即在-70。C下冷冻并4呆持在该温度直到RNA分离。RNA分离和PCR分冲斤是由SuperArrayInc才艮才居4也4门建立的方案(www.superarry.com)来提供服务而实施的。结果。根据PCR的数据，发现如果与对照的表达水平相比，差异超过3倍(增大或降低)，则mRAN表达中的改变是统计学显著的。从84个基因的表达分析中，所有样品中的75%至85%的基因水平与对照样品(用PBS注射代替用抗原和免疫调节剂注射的小鼠的脾)(未示出)不存在统计学上的差异。对于许多细胞因子和趋化因子，以及各自的受体IL-4、IL-ll、Sppl、IL-10RA,并且在较小程度上对于IL-l伤、IL-13、IL-17b、IL-20、IL-6和IL-1R1，观察到清晰的统计学显著差异。表l:已^p的肽<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>权利要求1.一种寡肽在医药中的应用，所述寡肽选自由以下组成的组a)具有通式X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽，其中X可以选自由Ile(I)、Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)组成的组，其中所有的氨基酸可以分别是D或L构型；b)在N端包括所述三肽的寡肽；以及c)选自由IPYKTTKS、KTTKSIPY、IPYVGVAPG、VGVAPGIPY、IPYVGV、VGVIPY、IPYIEW、IEWIPY、EWIPY、IPYKE、KEIPY、IPYKPR、KPRIPY、IPYTEPR、TEPRIPY、IPYKD、KDIPY、IPYKNPY、KNPYIPY、IPYKNPW、KNPWIPY、IPYTKPR、IPYGQPR、IPYTAEEK、IPYALTTE、IPYRKEVY、GPAIPY、KDIPIPY、TQPIPY、GQPIPY、TAEIPY、ALTIPY、RKEIPY、IPYEKX1EKX1IPY、IPYX1EKX1EKIPY、IPYEWX1、EWX1IPYIPYX1VY、X1VYIPY、IPYX1PY、X1PYIPY、IPYPRX1和PRX1IPY组成的组中的寡肽，其中X1选自由A、V、G、I、P、W、F、N、Q、T、R、K、E、D和Y组成的组。2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述寡肽用作免疫调节剂，疫应答的抑制剂。3.—种寡肽在制备用作免疫调节剂的药物中的应用，优选用于激活T细胞和/或诱导细胞因子的释放和/或提高T细胞依赖性体液和/或细胞免疫应答和/或抑制自身免疫应答，所述寡肽选自由以下组成的组a)具有通式X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽，其中X可以选自由Ile(I)、Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)组成的组，其中所有的氨基酸可以分别是D或L构型；b)在N端包4舌所述三肽的寡肽；以及c)选自由IPYKTTKS、KTTKSIPY、IPYVGVAPG、VGVAPGIPY、IPYVGV、VGVIPY、IPYIEW、IEWIPY、EWIPY、IPYKE、KEIPY、IPYKPR、KPRIPY、IPYTEPR、TEPRIPY、IPYKD、KDIPY、IPYKNPY、KNPYIPY、IPYKNPW、KNPWIPY、IPYTKPR、IPYGQPR、IPYTAEEK、IPYALTTE、IPYRKEVY、GPAIPY、KDIPIPY、TQPIPY、GQPIPY、TAEIPY、ALTIPY、RKEIPY、IPYEKX!EKXJPY、IPYXpKX巡IPY、IPYEWXi、EWX!IPYIPYXWY、XiVYIPY、IPYX^Y、XjPYIPY、IPYPIOd和PRXJPY组成的组中的寡肽，其中Xj选自由A、V、G、I、P、W、F、N、Q、T、R、K、E、D和Y组成的组。4.根据权利要求1-3所述的应用，其中，所述寡肽是椋榈酸盐或所述寡肽是经-f奮饰的，并且其中所述》f饰选自由与棕榈酸结合以及N端乙酰^f匕所组成的组。5.—种具有通式X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽，其中，X可以选自由Ile(I)、Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)组成的组，并且其中所述氨基酸中的至少一种是D构型。6.三肽Ile-Pro-Tyr,其中，N端异亮氨酸可选地:帔乙酰化或其中4壬意氨基酸可选地与棕榈酸结合，或者是所述三肽的棕榈酸盐JULo7.在N端包括通式为X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽的寡肽，其中，X可以选自由Ile(I)、Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)组成的组，其中所有的氨基酸可以分别是D或L构型。8.寡肽，选自由IPYKTTKS、KTTKSIPY、IPYVGVAPG、VGVAPGIPY、IPYVGV、VGVIPY、IPYIEW、IEWIPY、EWIPY、IPYKE、KEIPY、IPYKPR、KPRIPY、IPYTEPR、TEPRIPY、IPYKD、KDIPY、IPYKNPY、KNPYIPY、IPYKNPW、KNPWIPY、IPYTKPR、IPYGQPR、IPYTAEEK、IPYALTTE、IPYRKEVY、GPAIPY、KDIPIPY、TQPIPY、GQPIPY、TAEIPY、ALTIPY、RKEIPY、IPYEKX!EKXJPY、IPYX孤X巡IPY、IPYEWXi、EWXJPYIPYXtVY、XiVYIPY、IPYX^Y、XjPYIPY、IPYPRX!和PRXJPY组成的组，其中X！选自由A、V、G、I、P、W、F、N、Q、T、R、K、E、D和Y组成的组。9.寡肽IEWIPY。10.根据权利要求7-9中任一项所述的寡肽，其中，N端氨基酸被乙酰化或者其中任意氨基酸与棕榈酸结合，或者是所述寡肽的棕榈酸盐。11.药物组合物，包括一种寡肽以及药用载体，其中，所述寡肽是a)具有通式X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽，其中X可以选自由Ile(I)、Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)组成的组，其中所有的氨基酸可以分别是D或L构型；b)在N端包括所述三肽的寡肽；或者c)选自由IPYKTTKS、KTTKSIPY、IPYVGVAPG、VGVAPGIPY、IPYVGV、VGVIPY、IPYIEW、IEWIPY、EWIPY、IPYKE、KEIPY、IPYKPR、KPRIPY、IPYTEPR、TEPRIPY、IPYKD、KDIPY、IPYKNPY、KNPYIPY、IPYKNPW、KNPWIPY、IPYTKPR、IPYGQPR、IPYTAEEK、IPYALTTE、IPYRKEVY、GPAIPY、KDIPIPY、TQPIPY、GQPIPY、TAEIPY、ALTIPY、RKEIPY、IPYEIOdEKXJPY、IPYXEKXiEKIPY、IPYEWXi、EWX丄IPYIPYXtVY、XiVYIPY、IPYX^Y、XjPYIPY、IPYPRX,和PRXJPY组成的组中的寡肽，其中Xi选自由A、V、G、I、P、W、F、N、Q、T、R、K、E、D和Y组成的组；或者d)在a)、b)和c)中列出的所述寡肽中的任一种的棕榈酸盐；或者e)在a)、b)或c)中列出的一种寡肽，其是经^f奮饰的并且其中所述修饰选自由与棕榈酸结合以及N端乙酰化所组成的组。12.药物组合物，包4舌三肽IPY和药用载体。13.药物组合物，包4舌寡肽IEWIPY和药用载体。14.疫苗，包括根据权利要求11-13中任一项所述的药用化合物。15.用于增强哺乳动物的免疫系统的方法，包括给予根据权利要求11-13中4壬一项所述的药物《且合物。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物选自由人、牛、猪、羊、狗、猫和动物园动物组成的组。17.提高疫苗组合物的免疫原性活性的方法，所述方法是通过将根才居片又利要求11-13中4壬一项所述的药物组合物加入所述疫苗ia合物中。18.通过将肽与一种寡肽融合^^人而f武予所述肽免疫反应性或增强所述肽的免疫反应性的方法，所述寡肽选自由以下组成的组a)具有通式X-Pro-Tyr(X-P-Y)的三肽，其中X可以选自由Ile(I)、Val(V)、Ala(A)、Trp(W)、Pro(P)、Leu(L)、Phe(F)、Gly(G)、Glu(E)和Asn(N)组成的组，其中所有的氨基酸可以分别是D或L构型；b)在N端包括所述三肽的寡肽；或者c)选自由IPYKTTKS、KTTKSIPY、IPYVGVAPG、VGVAPGIPY、IPYVGV、VGVIPY、IPYIEW、IEWIPY、EWIPY、IPYKE、KEIPY、IPYKPR、KPRIPY、IPYTEPR、TEPRIPY、IPYKD、KDIPY、IPYKNPY、KNPYIPY、IPYKNPW、KNPWIPY、IPYTKPR、IPYGQPR、IPYTAEEK、IPYALTTE、IPYRKEVY、GPAIPY、KDIPIPY、TQPIPY、GQPIPY、TAEIPY、ALTIPY、RKEIPY、IPYEKX!EKXJPY、IPYXpKXpKIPY、IPYEWXi、EWX!IPYIPYXiVY、X!VYIPY、IPYX!PY、XtPYIPY、IPYPRXi和PRXiIPY组成的组中的寡肽，其中X！选自由A、V、G、I、P、W、F、N、Q、T、R、K、E、D和Y组成的组；d)在a)、b)和c)中列出的所述寡肽中的任一种的棕榈酸盐；以及e)在a)、b)或c)中列出的一种寡肽，其是经修饰的并且其中所述修饰选自由与棕榈酸结合以及N端乙酰化所组成的组；并且其中优选地，所述肽的N端与所述寡肽的C端融合。全文摘要本发明提供了通式为X-P-Y、优选I-P-Y的免疫调节肽，和/或包括该氨基酸序列的寡肽和/或与这些肽的结合物。本发明还提供了具有这些肽和结合物的药物组合物。文档编号C07K5/08GK101448850SQ200780017969公开日2009年6月3日申请日期2007年3月29日优先权日2006年3月29日发明者谢尔盖·V·利特维诺夫申请人:谢尔盖·V·利特维诺夫