编码g－蛋白质－偶联之受体的核酸及其用途的制作方法

专利名称：编码g－蛋白质－偶联之受体的核酸及其用途的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及编码GAVE6(一种迄今未知之G-蛋白质-偶联受体)之新颖核酸分子，以及该核酸分子与GAVE6之用途。
背景技术：
G蛋白偶联受体(GPCR)是参与细胞信号转导的一个大的整合膜蛋白家族。GPCR与多种胞外信号包括神经递质、激素、有味物质和光反应，并且可转导信号以启动细胞内的第二信使反应。许多治疗药物靶向GPCR，因为这些受体可介导多种生理反应，包括炎症、血管舒张、心率、支气管扩张、内分泌和蠕动。
GPCR的特征表现为胞外结构域、七个跨膜结构域和胞内结构域。此类受体的一些功能如结合配体和与G蛋白相互作用的功能与关键位置处某些氨基酸的存在有关。例如，许多研究表明GPCR中氨基酸序列的差异导致了与天然配体或小分子激动剂或拮抗剂亲和性的差异。换句话说，序列中小的差异可导致不同的结合亲和性和活性。(参见如Meng等人，生物化学杂志(J Bio Chem)(1996)271(50)32016-20；Burd等人，生物化学杂志(J Bio Chem)(1998)273(51)34488-95；和Hurley等人，神经化学杂志(JNeurochem)(1999)72(1)413-21)。具体地说，研究表明在第三个胞内结构域中氨基酸序列的差异可导致不同的活性。Myburgh等人发现促性腺素释放素受体的第3胞内环中丙氨酸261对于G蛋白偶联和受体内化是关键的(生物化学杂志(Biochem J)(1998)331(第3部分)893-6)。Wonerow等人研究了促甲状腺素受体并证明第3胞内环中的缺失可导致组成型受体活性(生物化学杂志(J Bio Chem)(1998)273(14)7900-5)。
一般而言，内源配体与受体的结合作用导致受体胞内结构域的构象改变，使得胞内结构域与胞内组分G蛋白之间可偶联。存在几种G蛋白，如Gq、Gs、Gi、Gz和Go(参见如Dessauer等人，临床科学(Clin Sci)(Colch)(1996)91(5)527-37)。受体的IC-3环及羧基末端与G蛋白相互作用(Pauwels等人，分子神经生物学(Mol Neurobiol)(1998)17(1-3)109-135和Wonerow等人，见上文)。有些GPCR相对于G蛋白而言是“泛主结合的”，即一种GPCR可与一种以上的G蛋白相互作用(参见如Kenakin，生命科学(Life Sciences)(1988)431095)。
配体激活的GPCR与G蛋白偶联起始了信号级联过程(称为“信号转导”)。此类信号转导最终导致细胞活化或细胞抑制。
在细胞膜中的GPCR以两种不同的构象平衡存在“无活性”状态和“活性”状态。处于无活性状态的受体不能与胞内信号转导途径连接来产生生物学反应(存在例外，如在转导细胞中受体过表达时，参见如www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.)。构象向活性状态的转变使得受体与转导途径(通过G蛋白)相连并产生生物学反应。
激动剂结合并使活性构象更可能产生。但有时如果在不存在任何激动剂时已有相当强的反应，则称此类受体具有组成型活性(即已处于活性构象或配体不依赖的或自主的活性状态)。当激动剂加至此类体系中时，通常可观察到增强的反应。
但是，当加入经典的拮抗剂时，此类分子的结合不产生作用。另一方面，某些拮抗剂可引起受体组成型活性的抑制，这暗示了后一类药物在技术上不是拮抗剂，而是具有负内在活性的激动剂。这些药物称为逆向激动剂(www.creighton.edu/Pharmacology/inverse.htm.)。
对受体的常规研究基于这样的设想进行首先从内源配体的鉴定开始，然后将发现继续向前推进以确定拮抗剂和其它受体效应分子。即使在首先发现了拮抗剂的情况下，教条式的反应仍是确定内源配体(WO 00/22131)。但由于活性状态对于测试筛选目的是最有用的，获得此类组成型受体尤其是组成型GPCR将允许在缺少内源配体信息时易于分离激动剂、部分激动剂、逆向激动剂和拮抗剂。而且，对于由于受体活性失调而导致的疾病，通过使用处于自主活化状态的受体进行测试更易于发现引起组成型活性抑制的药物，或更具体地降低有效活化受体浓度的药物。例如作为可被转染入患者体内用于治疗疾病的受体，此类受体的活性可用通过上述测试发现的逆向激动剂精细调节。
通常认为疾病如哮喘、慢性阻塞性肺炎和类风湿性关节炎(RA)具有炎性病因，其中涉及到T辅助细胞、单核细胞-巨噬细胞和嗜曙红细胞。当前用皮质类固醇进行的抗炎治疗对哮喘是有效的，但伴有代谢和内分泌副作用。可通过肺或鼻粘膜吸收的吸入制剂也可能如此。迄今仍缺乏令人满意的RA或COPD之口服疗法。
嗜曙红细胞介导过敏及哮喘中的许多气道机能障碍。白介素5(IL-5)是一种嗜曙红细胞生长和活化细胞因子。研究已证实IL-5为组织嗜曙红细胞过多及嗜曙红细胞介导的造成气道过度反应之组织伤害所必需(Changet al.，J Allergy Clin Immunol(1996)98(5pt 1)922-931及Duez et al.，AmJ Respir Crit Care Med(2000)161(1)200-206)。于变应性哮喘中，IL-5系暴露于过敏原(例如屋尘螨抗原)后，由T-辅助细胞-2(Th2)产生。
RA被认为是由患病滑膜中活化巨噬细胞的累积所致。干扰素γ(IFNγ)为具有许多促炎性质之T-辅助细胞-1(Th1)来源的细胞因子，其是最具效力的巨噬细胞活化细胞因子，诱导MHC II类基因转录从而促成树突细胞样表型。
脂多醣(LPS)为革兰氏阴性细菌细胞壁的成分，其引起包括释放肿瘤坏死因子α(TNFα)之发炎反应。临床上已证实静脉内抗-TNFα疗法在RA中的效力。COPD亦被认为是由肺中堆积巨噬细胞所造成，巨噬细胞产生嗜中性粒细胞化学吸引剂(例如，IL-8de Boer et al.，J Pathol(2000)190(5)619-626)。巨噬细胞与嗜中性粒细胞二者均释放引致肺泡壁降解的组织蛋白酶。据信，肺上皮可能是炎性细胞化学吸引剂与其它炎性细胞活化剂之重要来源(参见，例如，Thomas et al.，J Virol (2000)74(18)8425-8433；Lamkhioued et al.，Am J Respir Crit Care Med(2000)162(2Pt.1)723-732；及Sekiya et al.，J Immunol(2000)165(4)2205-2213)。鉴于GPCR在疾病中起作用并可通过调节GPCR的活性来治疗疾病，对以前未知的GPCR的鉴定和描述可为开发新组合物和方法，用于治疗涉及GPCR活性的疾病提供条件。因此，需要发现、分离和表征编码迄今未知之GPCR的新的有用核酸分子。
业界尚需求的为利用该迄今未知之GPCR以鉴定可用作特定GPCR的潜在激动剂或拮抗剂的分子的测定法。这些分子可容易地应用作为调节体内GPCR活性之治疗剂，因此，可治疗许多与GPCR活性相关之病症。
本文对任何文献的引用均不应理解为承认该文献是本申请的“现有技术”。
发明概述本发明鉴定及表征一种新颖的组成型活性GPCR——GAVE6——的表达，并提供运用此发现鉴定与治疗相关病症的组合物与方法。
因此广言之，本发明涉及一种分离的核酸分子，其包括第1图之DNA序列(SEQ ID NO1)、还涉及其变体、其片段、或其类似物或衍生物。本发明的变体可为等位基因变体、简并变体、或于序列中产生简并变化之等位基因变体。
此外，本发明涉及在严紧杂交条件下，可与SEQ ID NO1之分离核酸分子杂交的分离核酸分子，或其变体。进一步地，本发明还涉及在严紧杂交条件下，可与SEQ ID NO1之DNA序列互补的核酸分子杂交的分离核酸分子。严紧杂交条件如下文所述。
再者，本发明还涉及一种分离核酸分子，其包括编码含有SEQ IDNO2氨基酸序列的多肽的DNA序列。
任选地，可以对如上述之本发明的分离核酸分子进行可检测标记。可应用于此处之可检测标记物的例子包括，但当然不限于酶、放射性同位素、或发荧光的化学剂。可检测标记物的特定实例如下文所述。
特定的多肽亦涵盖于本发明范围之内，例如，本发明涉及包括SEQ IDNO2之氨基酸序列的纯化的多肽、其保守变体、或其类似物或衍生物。任选地，本发明之多肽可进行可检测标记。
此外，本发明涉及以本发明多肽为免疫原而制备的抗体。这些抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。再者，抗体可为“嵌合型”，例如，其可包括于不同物种中对抗本发明纯化多肽产生的抗体之蛋白质域。于特定实施方案中，本发明抗体可予以“人源化”。当然，本发明抗体可进行可检测标记。可应用于此处之可检测标记物之特定实例如下文所述。
本发明进一步涉及表达载体，其包括可操作地与表达控制元件结合的、包含SEQ ID NO1 DNA序列、其变体、其类似物或衍生物、或其片段之核酸分子。再者，本发明之表达载体可以包括分离的核酸分子，该分离的核酸分子可操作地结合表达控制元件并可以于严紧杂交条件下与含SEQID NO1 DNA序列之分离核酸分子杂交，或可以于严紧杂交条件下与互补于含SEQ ID NO1 DNA序列之分离核酸分子的杂交探针杂交，其中该杂交探针可操作地结合表达控制元件。应用于此处之表达控制元件之特定实例为启动子。可以应用于本发明的特定启动子的实例包含，但不限于hCMV之早期启动子、SV40之早期启动子、腺病毒之早期启动子、痘苗病毒之早期启动子、多瘤病毒之早期启动子、SV40之晚期启动子、腺病毒之晚期启动子、痘苗病毒之晚期启动子、多瘤病毒之晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、λ噬菌体之主要操纵基因及启动子区域、fd外壳蛋白之控制区域、3-磷酸甘油酸激酶启动子、酸性磷酸酶启动子、或酵母α交配因子之启动子。
使用本发明之表达载体，可转染或转化宿主细胞，并产生包括SEQ IDNO2氨基酸序列、或其变体之多肽。宿主细胞可为原核生物细胞或真核生物细胞。可应用于此处之单细胞宿主之特定实例包含大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌(Pseudonomas)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10及Sf9细胞，等等。
此外，本发明还涉及制备包括SEQ ID NO2氨基酸序列、其变体、或其片段之纯化多肽的方法。该方法包括于允许表达该纯化多肽的条件下，培养以本发明表达载体转化或转染的宿主细胞，然后自该单细胞宿主、宿主细胞周围的培养液、或自二者中回收纯化多肽。
此外，本发明涉及鉴定可调节GAVE6活性的化合物之试验。此化合物可为GAVE6之激动剂、拮抗剂或逆向激动剂。因此，本发明涉及鉴定GAVE6激动剂之方法，该方法包括使潜在激动剂与表达GAVE6的细胞于内源配体存在下接触，并测定相对于该潜在激动剂不存在时之GAVE6信号传导活性，存在该潜在激动剂时之GAVE6信号传导活性是否增加。
同样地，本发明涉及鉴定GAVE6逆向激动剂之方法。该方法包括使潜在逆向激动剂与表达GAVE6的细胞接触，并测定相对于存在内源配体或激动剂但不存在潜在逆向激动剂时之GAVE6信号传导活性，该潜在逆向激动剂及内源配体或激动剂存在下之GAVE6信号传导活性是否降低，及于内源配体或激动剂存在下是否降低。
当然，本发明亦涉及鉴定GAVE6拮抗剂之方法。该方法包括使潜在拮抗剂与表达GAVE6的细胞接触，并测定相对于内源配体或激动剂存在下之GAVE6活性，该潜在拮抗剂存在下之GAVE6信号传导活性是否降低。
因此，本发明之目的在于提供编码GAVE6蛋白质、其片段、或其变体之分离的核酸序列。
本发明之目的亦在于提供包括SEQ ID NO1 DNA序列的核酸分子的变体，或于严紧条件下可与SEQ ID NO1杂交的核酸分子的变体。
本发明之再一目的在于提供GAVE6、及其变体、其片段、或其类似物或衍生物之氨基酸序列。
本发明之又一目的在于提供包括编码GAVE6、其变体、其片段、或其类似物或衍生物的DNA序列的表达载体，其中该DNA序列可操作地结合表达控制元件。
本发明之又一目的在于提供以GAVE6、其变体、其类似物或衍生物、或其片段为免疫原之抗体。
本发明之又一目的涉及鉴定可调节GAVE6蛋白质活性的化合物的方法。此调节剂可为GAVE6之拮抗剂、GAVE6之激动剂、或GAVE6之逆向激动剂。
本发明之更进一步目的在于提供用于调节GAVE6活性之药物组合物。此调节作用可用于治疗与GAVE6活性相关的多种病症，例如各种炎症、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、及类风湿性关节炎，等等。
参照以下附图及详细说明将更了解本发明的这些和其他方面。
附图简述

图1编码GAVE6的DNA序列(SEQ ID NO1)。
图2GAVE6的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图3GAVE6的氨基酸序列(SEQ ID NO2)与HM74及GPR31的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)的比较。
图4各种组织中GAVE6转录的Northern印迹。
图5一系列人类器官/组织中GAVE6在各种组织中的表达谱。
发明详述如上述说明，本发明涉及令人惊奇且未预期地发现编码迄今未知而于本文称为GAVE6的G蛋白质-偶联受体之迄今未知的核酸分子。特别是，已经发现GAVE6在免疫组织或器官(例如肾、肝及小肠)中表达。
以下解释在整个说明书及权利要求书中用于描述本发明的各术语及短语本文所用之“调节剂”一词系指调节GAVE6活性之部分(moiety)(例如，但不限于配体及候选化合物)。本发明之调节剂可为GAVE6之激动剂、部分激动剂、拮抗剂、或逆向激动剂。
此处所用的术语“激动剂”是指当与受体结合时激活胞内反应或加强GTP与膜结合的部分(例如但不限于配体和侯选化合物)。
此处所用的术语“部分激动剂”是指当其与受体结合时，与激动剂相比只在较小程度上激活胞内反应或只在较小程度上加强GTP与膜结合的部分(例如但不限于配体和侯选化合物)。
此处所用的术语“拮抗剂”是指与激动剂在同一位点竞争性结合受体的部分(例如但不限于配体和侯选化合物)。但拮抗剂不激活由受体的活性形式启动的胞内反应，并因此可抑制激动剂或部分激动剂引起的胞内反应。在一个相关的方面，当不存在激动剂或部分激动剂时，拮抗剂不降低基线胞内反应。
此处术语“逆向激动剂”是指可结合组成型活性受体并抑制基线胞内反应的部分(例如但不限于配体和侯选化合物)。基线反应由缺乏激动剂或部分激动剂时或GTP与膜的结合降低的情况下所观察到的正常基础活性水平以下的受体活性形式启动。
此处的术语“侯选化合物”是指易接受筛选技术处理的部分(例如但不限于化学化合物)。在一个实施方案中，该术语不包括公知的选自GAVE6之激动剂、部分激动剂、逆向激动剂或拮抗剂的化合物。那些化合物是通过传统的药物开发方法鉴定的，所述方法涉及受体特异的内源配体的鉴定和/或相对于受体的候选化合物的筛选，其中此筛选需用竞争试验来评估功效。
此处所用术语“组成型活化受体”或“自主活化受体”可互换，是指在不存在配体时被活化的受体。此类组成型活化受体可为内源的(例如，GAVE6)或非内源的，即可通过重组方法改变GPCR，以产生野生型GPCR的突变组成型(参见如EP 1071701；WO 00/22129；WO 00/22131；以及美国专利号6,150,393和6,140,509，此处完整引用作为参考)。
此处所用术语“组成型受体活化”是指采用使受体与内源配体或其化学等同物结合以外的方式使受体稳定在活性状态。
此处术语“配体”是指结合另一分子的部分，其中所述部分包括，但当然不限于激素或神经递质，且进一步地其中所述部分立体选择性地与受体结合。
当谈到本发明的蛋白质和核酸分子时术语“家族”是指两种或多种具有表面上共同的结构域并具有此处所定义的足够的氨基酸或核苷酸序列同一性的蛋白质或核酸分子。此类家族成员可天然存在并可来自相同或不同的物种。例如，一个家族可包含人源的第一种蛋白质和鼠源的该蛋白质的同系物(homolgue)，以及人源的第二种不同的蛋白质和该第二种蛋白质的鼠源同系物。家族成员也可具有共同的功能特征。
此处可互换的“GAVE6活性”、“GAVE6的生物活性”或“GAVE6的功能活性”是指根据标准技术在体内或体外测得的由GAVE6蛋白质、多肽或核酸分子对GAVE6效应细胞产生的活性。GAVE6活性可为直接活性或间接活性，其中所述直接活性如与第二蛋白质的结合活性或对第二蛋白质的酶活性，其中所述间接活性如由GAVE6蛋白质与第二蛋白质相互作用介导的细胞信号活性。在一个特定的实施方案中，GAVE6活性包括但不限于至少一种或多种下列活性(i)与GAVE6信号途径中的蛋白质相互作用的能力；(ii)与GAVE6配体相互作用的能力；和(iii)与胞内靶蛋白质相互作用的能力。
再者，根据本发明，可运用本领域技术人员能力范围内的常规分子生物学、微生物学、及重组DNA技术。该等技术于文献上有充分的说明。参见，例如，Sambrook，Fritsch & Maniatis，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(下文称为“Sambrook etal.，1989”)；DNA CloningA Practical Approach，卷I和II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic AcidHybridization[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；Transcription AndTranslation[B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，ed.(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A.Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，Inc.(1994)。
因此，于本文出现时，下述术语具有下文陈述的定义。
“载体”为复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，其可连接另一DNA片段以引起该连接片段之复制。“复制子”为具有体内DNA复制自主单元的功能(亦即，能于自身控制下进行复制)的任何遗传元件(例如，质粒、染色体、病毒)。载体之特定实例叙述于下文。
“盒子”系指可插入载体的特定限制性切割位点之DNA片段。此DNA片段编码目的多肽，盒子与限制性切割位点则经设计以确保盒子插入正确的读框中以供转录及翻译。
当外源或异源DNA被引入细胞内部时，则称细胞被该DNA”转染”。当转染的DNA引起表型变化时，则称细胞被外源或异源DNA”转化”。优选地，转化DNA整合入(共价连接于)组成细胞基因组的染色体DNA中。
“异源”DNA系指不是天然存在于细胞中或细胞的染色体部位中之DNA。优选地，异源DNA包括对细胞而言外来的基因。
“同源重组”系指于染色体中插入载体的外来DNA序列。具体地，载体导向特定的染色体位点，以进行同源重组。对于特异性同源重组，载体含有足够长的与染色体序列同源之区域以容许载体互补结合并整合入染色体中。同源区域越长，且序列相似性程度越高，则可增加同源重组的效率。
本发明之分离核酸分子一方面，本发明涉及分离之核酸分子，其包括第1图之DNA序列(SEQID NO1)、其变体、其片段、或其类似物或衍生物。
“核酸分子”系指单链或双股螺旋形式之核糖核苷(腺嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺嘌呤核苷、脱氧鸟嘌呤核苷、脱氧胸腺嘧啶核苷或脱氧胞嘧啶核苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯及硫酯。双链DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋均可行。核酸分子一词，尤其是DNA或RNA分子，仅指分子的一级与二级结构，而不限制于任何特定三级结构。因此，此术语包括可以存在于例如线性或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒及染色体中的双链DNA分子。在讨论特定双链DNA分子之结构时，本文中序列可依照正常惯例予以叙述，仅给出沿着DNA非转录链(亦即，该链具有与mRNA同源之序列)以5’至3’之方向的序列。”重组DNA分子”为已进行分子生物学操作之DNA分子。
“分离的”核酸分子是与存在于该核酸的天然源中的其它核酸分子相分离的核酸分子。特别地，“分离的”核酸没有该核酸所来自的生物体的基因组DNA中编码GAVE6的核酸的天然侧翼序列(即位于该核酸5′和3′端的序列)。在不同的实施方案中，分离的GAVE6核酸分子可包含该核酸所来自的细胞基因组DNA中天然存在于该核酸分子侧翼的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。而且，当通过重组技术产生时，“分离的”核酸分子如cDNA分子可基本上不含有其它细胞材料或培养基，或当通过化学合成产生时，“分离的”核酸分子如cDNA分子可基本上不含有化学前体或其它化学物质。
本发明的核酸分子，如具有SEQ ID NO1核苷酸序列或该核苷酸序列的任一个片段或互补体的核酸分子或其类似物或衍生物，可应用标准的分子生物学技术以及此处提供的序列信息进行分离。通过标准的杂交和克隆技术(如Sambrook等人所描述技术)，用SEQ ID NO1的全部或部分核酸序列作为杂交探针，可将GAVE6核酸分子分离。
用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，并使用合适的寡核苷酸引物，按照标准的PCR扩增技术，可扩增本发明的核酸分子。该引物可使用SEQ ID NO1叙述之信息及例行实验室技术轻易地制造。可将扩增的核酸克隆入合适的载体并通过DNA序列分析表征。而且，对应于GAVE6核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准的合成技术如通过DNA自动合成仪制备。
可与GAVE6 DNA杂交之分离核酸分子本发明进一步涉及可与GAVE6 DNA杂交、可与严紧杂交条件下互补于GAVE6 DNA的杂交探针杂交、或可与二者于严紧杂交条件下杂交之分离核酸分子。详言之，本发明涉及于严紧杂交条件下，可与含有SEQ IDNO1 DNA序列的核酸分子、或互补于含有SEQ ID NO1 DNA序列的分离核酸分子的探针进行杂交之分离核酸分子。
于适当温度与溶液离子强度条件(参见Sambrook et al.，文献同前)下，当单链形式的核酸分子可与另一核酸分子(例如cDNA、基因组DNA、或RNA)退火时，则称该核酸分子与该另一核酸分子“可杂交”。温度与离子强度条件决定杂交的“严紧性”。初步筛检同源核酸时，可使用相当于55℃Tm之低严紧杂交条件(例如，5x SSC、0.1％ SDS、0.25％奶、不含甲酰胺；或30％甲酰胺、5x SSC、0.5％ SDS)。中度严紧杂交条件相当于较高之Tm，例如，40％甲酰胺，以及5x或6x SSC。高严紧杂交条件相当于最高Tm，例如，50％甲酰胺，5x或6x SSC。杂交需要两个核酸含有互补序列，但视杂交之严紧性，可以有碱基之间错配。核酸杂交之适当严紧性取决于核酸的长度与互补的程度，彼等为本领域中悉知之变量。两个核苷酸序列间相似或同源的程度愈高，具有这些序列的核酸杂交之Tm值愈大。核酸杂交之相对稳定性(相当于较高之Tm值)依下述顺序递减RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂合体，已获得其Tm计算等式(参见Sambrook et al.，文献同前，9.50-0.51)。较短的核酸(亦即，寡核苷酸)之杂交，错配的位置变得更重要，该寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrook et al.，文献同前，11.7-11.8)。对于可杂交的核酸分子，其最小长度为至少约20个核苷酸；特别是至少约30个核苷酸；更特别是至少约40个核苷酸；甚至更特别是约50个核苷酸；更特别是至少约60个核苷酸。于本发明之特定实施方案中，可杂交的本发明核酸分子，其长度为至少300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900、1000或1100个核苷酸，并且可以于严紧条件下杂交于包括SEQ ID NO1之核苷酸序列(优选地编码序列)、其互补物、或其片段之核酸分子。
此处所用术语“在严紧条件下杂交”是对杂交和洗涤条件的描述，在此条件下，当核苷酸序列相互间具有至少55％，60％，65％，70％和优选地75％或更高互补性时一般仍保持杂交。此类严紧条件为本领域技术人员公知，并可在“分子生物学最新技术”(“Current Protocols in MolecularBiology”)，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6一书中找到。严紧杂交条件的一个优选的非限制性实例为在约45℃，于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在50-65℃，于0.2X SSC，0.1％ SDS中洗一次或多次。优选地，在严紧条件下与SEQ ID NO1的序列或其互补序列杂交的本发明分离核酸分子对应于天然存在的核酸分子。此处所用“天然存在的”核酸分子是指具有自然界中存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(如编码天然蛋白质)。熟练的技术人员能理解可根据序列特异性变量(如长度、G-C丰度等)修正条件。
本发明考虑包括这样的GAVE6核酸片段，其可用于诊断具有相似特性的GAVE6样分子。诊断片段可来自GAVE6基因的任一部分，包括侧翼序列。片段可用作实践公知方法的文库探针。
而且，本发明的核酸分子可仅包含编码GAVE6的核酸序列的一部分，如可用作探针或引物的片段或编码GAVE6生物活性部分的片段。例如，此片段可包括但不限于编码SEQ ID NO2氨基酸残基的约第1位至约14位的区域。从克隆人GAVE6基因而确定的核苷酸序列使得可以产生探针和引物，用于鉴定和/或克隆其它细胞类型(如来自其它组织)中的GAVE6同系物以及来自其它哺乳动物的GAVE6同系物。探针/引物一般包含基本纯化的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含这样的核苷酸序列区域，该区域在严紧条件下可杂交至SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的天然突变体的有义或反义序列中的至少约12个，优选地约25个，更优选地约50个，75个，100个，125个，150个，175个，200个，250个，300个，350个或400个连续的核苷酸上。基于人GAVE6核苷酸序列的探针可用于检测编码相似或相同蛋白质的转录本或基因组序列。
本文所用本发明分离核酸分子之”片段”或”部分”含有至少12个，特别是约25个，更特别是约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400个连续核苷酸。因此，本发明分离核酸分子之”片段”不只是1或2个核苷酸。
同样地，本发明多肽之”片段”或”部分”含有至少9个连续氨基酸残基。本发明多肽片段之特定实例包括与GAVE6抗体或其片段结合之抗原决定部位。
编码“GAVE6的生物活性部分”的核酸片段可通过分离SEQ ID NO1的编码具有GAVE6生物活性的多肽的部分、表达此GAVE6蛋白质的编码部分(如体外重组表达)并评估GAVE6的该编码部分的活性而制备。本发明还包括这样的核酸分子，其由于遗传密码的简并性而不同于SEQ IDNO1核苷酸序列并因此与SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列编码相同的GAVE6蛋白质。
同源核酸分子本发明进一步涉及与GAVE6 DNA分子同源(例如，与具有SEQ IDNO1 DNA序列之分离核酸分子同源)的分离核酸分子。两个DNA序列于限定的长度上有至少约50％(优选地至少约75％，及最优选为至少约90或95％)核苷酸匹配时，则称此二DNA序列”实质上同源”或”实质上类似”。实质上同源之序列可通过利用序列数据库中可用之标准软件在默认参数下比较序列来鉴定，或可以在Southern杂交实验中使用例如，限定用于该特定系统之严紧条件予以鉴定。适当杂交条件的定义乃属本领域技术人员之范围内。参见，例如，Maniatis et al.，文献同前；DNA Cloning，Vols.I &II，文献同前；Nucleic Acid Hybridization，文献同前。此外，具有与人类GAVE6不同的核苷酸序列之编码其它物种的GAVE6蛋白质(GAVE6同源物)之核酸分子意欲涵盖于本发明范围之内。
本发明分离核酸分子之变体本发明进一步涉及包含SEQ ID NO1 DNA序列的分离核酸分子之变体。此变体可为简并变体、等位基因变体、或其组合。
对应于本发明GAVE6 cDNA的天然等位基因变体和同系物的核酸分子可基于与此处公开的人GAVE6核酸的同一性，使用人cDNA或其一部分作为杂交探针，按照标准的杂交技术在严紧的杂交条件下分离。
本文所用之“对应于”一词系指类似或同源序列，而不管确切位置和用于测定类似性或同源性的分子相同与否。因此，“对应于”一词系指序列类似性，而不是氨基酸残基或核苷酸碱基之编号。
此外，由于遗传密码中密码子之简并性质，本发明之GAVE6蛋白质可由许多分离核酸分子所编码。”简并性质”系指依照遗传密码使用不同的三字母密码子规定特定的氨基酸。本领域中已悉知下述密码子可交换使用以编码各特定氨基酸苯丙氨酸(Phe或F)UUU或UUC亮氨酸(Leu或L) UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG异亮氨酸(Ile或I)AUU或AUC或AUA甲硫氨酸(Met或M)AUG缬氨酸(Val或V) GUU或GUC或GUA或GUG丝氨酸(Ser或S) UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC脯氨酸(Pro或P) CCU或CCC或CCA或CCG苏氨酸(Thr或T) ACU或ACC或ACA或ACG丙氨酸(Ala或A) GCU或GCG或GCA或GCG酪氨酸(Tyr或Y) UAU或UAC组氨酸(His或H) CAU或CAC谷氨酰胺(Gln或Q)CAA或CAG天冬酰胺(Asn或N)AAU或AAC赖氨酸(Lys或K) AAA或AAG天冬氨酸(Asp或D)GAU或GAC谷氨酸(Glu或E) GAA或GAG半胱氨酸(Cys或C)UGU或UGC精氨酸(Arg或R) CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG
甘氨酸(Gly或G)GGU或GGC或GGA或GGG色氨酸(Trp或W)UGG终止密码子UAA(赭石)或UAG(琥珀)或UGA(乳白)应了解的是，上文指明之密码子系用于RNA序列。用于DNA之对应密码子以T取代U。
除了在SEQ ID NO1中所示的GAVE6核苷酸序列外，本领域技术人员能理解在群体(如人群)中存在导致GAVE6氨基酸序列变化的DNA序列多态性。由于天然的等位基因变异，在群体中的个体之间存在GAVE6基因的此类遗传多态性。一个等位基因是在特定基因座处可选择存在的一组基因中的一个。此处所用术语“基因”和“重组基因”是指包含编码GAVE6蛋白质，优选地编码哺乳动物GAVE6蛋白质的开放读码框的核酸分子。此处所用短语“等位基因变体”是指位于GAVE6基因座的核苷酸序列或指由该核苷酸序列编码的多肽。可选择的等位基因能通过对一些不同个体进行目的基因测序而鉴定。这可以通过在多个个体中使用杂交探针鉴定相同的基因座容易地实施。GAVE6中的源于天然等位基因变异且不改变GAVE6功能活性的任一及所有此类核苷酸变异和所导致的氨基酸多态性或变异均包括在本发明的范围内。
此外，本发明分离核酸分子之变体可由本领域技术人员使用例行实验室技术，例如，定点诱变，容易地予以制造。
反义核苷酸序列本发明还涉及反义核酸分子，即与编码蛋白质的有义核酸互补的分子，如与双链cDNA分子的编码链或与mRNA序列互补的分子。因此反义核酸可通过氢键结合有义核酸。反义核酸可与全长GAVE6编码链或仅与其一部分互补，如与该蛋白质编码区域(或开放读码框)的全部或部分互补。反义核酸分子可与编码GAVE6的核苷酸序列所在的编码链的非编码区反义。非编码区(“5′和3′非翻译区”)是在编码区侧翼的5′和3′序列，不被翻译为氨基酸。
基于此处公开的编码GAVE6的编码链序列(例如，SEQ ID NO1)，本发明的反义核酸可根据Watson和Crick碱基配对原则设计。反义核酸分子可与GAVE6 mRNA的全长编码区互补，但更优选地为仅与GAVE6mRNA的编码区或非编码区的一部分反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸可与GAVE6 mRNA翻译起始位点附近的区域互补。反义寡核苷酸可长例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸。本发明的反义核酸可通过本领域公知的方法用化学合成和酶连接反应产生。例如可用天然存在的核苷酸或多种经化学修饰的核苷酸来化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，其中所述经修饰的核苷酸被设计用来增加分子的生物稳定性或增加反义和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性，如可使用硫代磷酸酯衍生物、磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。
可用于产生反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、双氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、次黄苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸，wybutoxosine，假尿嘧啶、queosine，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫脲嘧啶，2-硫脲嘧啶、4-硫脲嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、5-甲基-2-硫脲嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，可用表达载体生物学产生反义核酸，在该载体中核酸以反义方向亚克隆(即插入的核酸所转录的RNA与目的靶核酸为反义方向)。
本发明的反义核酸分子一般被施与受试者或原位产生，以便与编码GAVE6蛋白质的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而通过如抑制转录和/或翻译来抑制该蛋白质的表达。可通过常规的核苷酸互补性来杂交形成稳定的双链体，或例如当用反义核酸分子结合DNA双链体时，通过在双螺旋体大沟中的特异性相互作用来杂交，或杂交至GAVE6的调节区。
本发明反义核酸分子施用方式的例子包括在组织位点处直接注射。另外，可修饰反义核酸分子以靶向所选择的细胞，然后全身施用。例如，对于全身施用来说，可修饰反义分子，以使该分子与所选细胞表面上表达的受体或抗原特异结合，其中所述修饰如将反义核酸分子连接至可结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体上。也可用此处描述的载体将反义核酸分子递送至细胞。为了达到足够的胞内反义分子浓度，优选载体构建体中反义核酸分子置于强pol II或pol III启动子控制下。
本发明的反义核酸分子可为α-异头核酸(α-anomeric nucleic acid)分子。α-异头核酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂交体，其中的链走向相互平行(Gaultier等人，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1987)156625-6641)。反义核酸分子也可包含甲基核糖核苷酸(Inoue等人，核酸研究(1987)156131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等人，FEBS Lett(1987)215327-330)。
核酶本发明也包括核酶。核酶为具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，其可切割与该核酶杂交的单链核酸如mRNA。因此，核酶(如锤头状核酶(Haselhoff等人，在自然(Nature)(1988)334585-591)中所描述)可用于催化性切割GAVE6 mRNA转录本，由此抑制GAVE6 mRNA的翻译。可基于此处公开的GAVE6 DNA的核苷酸序列(如SEQ ID NO1)设计对编码GAVE6的核酸具特异性的核酶。例如可构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与编码GAVE6的mRNA中欲切割的核苷酸序列互补，参见如美国专利号4,987,071和5,116,742，或者，可用GAVE6mRNA从RNA分子池中选择具有特异核糖核酸酶活性的催化性RNA，参见如Bartel等人，科学(Science)(1993)2611411-1418。
本发明之三股螺旋核酸分子及肽核酸本发明还包括可形成三股螺旋结构的核酸分子。例如，GAVE6的基因表达可通过如下方式抑制，即，将核苷酸序列定向互补到GAVE6的调节区域(如GAVE6启动子和/或增强子)上以形成三股螺旋结构来防止GAVE6基因在靶细胞中转录，通常参见Helene，抗癌药物设计(AnticancerDrug Des)(1991)6(6)569；Helene Ann NY Acad Sci(1992)66027；和Maher，生物鉴定(Bioassays)(1992)14(12)807。
在优选的实施方案中，本发明的核酸分子可在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架处进行修饰，以提高如分子的稳定性、可杂交性或溶解性。例如，可修饰核酸的磷酸脱氧核糖骨架以产生肽核酸(参见Hyrup等人，Bioorganic & Medicinal Chemistry(1996)45)。此处所用术语“肽核酸”或“PNAs”是指核酸模拟物，如DNA模拟物，其中磷酸脱氧核糖骨架被假肽骨架替换并仅保留了四种天然核苷碱基。已显示中性PNA骨架使得可以在低离子强度条件下与DNA和RNA进行特异性杂交。如Hyrup等人(1996)见上文；Perry-O’Keefe等人，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad SciUSA)(1996)9314670所述，可通过标准的固相肽合成法进行PNA寡聚体的合成。
GAVE6的PNAs可用于治疗和诊断应用。例如，PNA可作为反义或反基因药剂，通过如诱导转录或翻译停滞或抑制复制用于基因表达的序列特异性调控。也可使用GAVE6的PNA。例如，PNA可通过如PNA-指导的PCR钳夹术用于分析基因中的单碱基对突变；当与其它酶如S1核酸酶组合使用时PNA可用作人工限制性酶(Hyrup等人，(1996)见上文)；或PNA可用作DNA序列和杂交的探针或引物(Hyrup等人，(1996)见上文；Perry-O’Keefe等人，(1996)见上文)。
在另一实施方案中，可通过将亲脂基团或其它辅助基团与PNA连接、通过形成PNA-DNA嵌合体或通过使用脂质体或其它本领域公知的药物递送技术来修饰GAVE6的PNA以便如增强稳定性、特异性或细胞摄入。可如Hyrup等人(1996)见上文；Finn等人，核酸研究(1996)24(17)3357-63；Mag等人，核酸研究(1989)175973；和Peterser等人，Bioorganic MedChem Lett(1975)51119所述进行PNA-DNA嵌合体的合成。
GAVE6蛋白质此外，本发明涉及分离的多肽，其包括图2之氨基酸序列(SEQ IDNO2)、其变体、其片段或其类似物或衍生物。
编码具有与SEQ ID NO2不同序列的GAVE6蛋白质(例如变体)之分离核酸分子，可藉于向SEQ ID NO1核苷酸序列中引入一或多个核苷酸替代、添加或缺失以使所编码蛋白质中引入一或多个氨基酸替代、添加或缺失而产生。
在一个特定的实施方案中，可测定突变的GAVE6蛋白质(1)与GAVE6信号途径中的蛋白质形成蛋白质蛋白质相互作用的能力；(2)结合GAVE6配体的能力；或(3)结合胞内靶蛋白的能力。又在另一个优选的实施方案中，可测定突变的GAVE6调节细胞增殖或细胞分化的能力。
天然GAVE6蛋白质可以通过使用标准蛋白质纯化技术由适当纯化方案自细胞或组织来源分离。或者，可利用重组DNA技术，容易地制造GAVE6蛋白质。本发明所涵盖之又一选择方案为使用标准肽合成技术之GAVE6蛋白质或多肽化学合成法。
“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上不含有GAVE6蛋白质所来自的细胞或组织源中的细胞物质或其它污染蛋白质，或当通过化学合成产生时，基本上不含有化学前体或其它化学物质。
短语“基本上不含细胞物质”包括这样的GAVE6蛋白质制品，其中该蛋白质从细胞的细胞组分中被分离出来，所述细胞为用于分离或重组产生该蛋白质的细胞。因此，基本上不含细胞物质的GAVE6蛋白质包括这样的GAVE6蛋白质制品，其具有少于约30％，20％，10％或5％或更少(指干重)的非GAVE6蛋白质(此处也称为“污染蛋白质”)。
当GAVE6蛋白质或其生物活性部分是重组产生的时，还优选其基本上不含培养基，即，培养基在蛋白质制品中所占有的体积少于约20％、10％、5％或更少。
当GAVE6蛋白质通过化学合成产生时，优选地基本上不含有化学前体或其它化学物质，即该蛋白质从参与其合成的化学前体或其它化学物质中分离出来。因此，此类GAVE6蛋白质制品具有少于约30％，20％，10％或5％或更少(指干重)的化学前体或非GAVE6的化学物质。
GAVE6蛋白质的生物活性部分或片段包括这样的肽，其包含的氨基酸序列与GAVE6蛋白质的氨基酸序列(如SEQ ID NO2中所示的氨基酸序列)具有足够的同一性或衍生自后者，并且该肽包含少于全长GAVE6蛋白质的氨基酸并显示GAVE6蛋白质的至少一种活性。一般来说，生物活性部分包含具有GAVE6蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。GAVE6蛋白质的生物活性部分可为如长10个、25个、50个、100个或更多氨基酸的多肽。特定的生物活性多肽包括一个或多个已鉴定的GAVE6结构域。
而且，可通过重组技术制备其它生物活性部分(其中该蛋白质的其它区域已缺失)并针对其评估天然GAVE6蛋白质的一种或多种功能活性。
其它有用的GAVE6蛋白质基本上与SEQ ID NO2相同并保留了SEQID NO2蛋白质的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变，其氨基酸序列与SEQ ID NO2存在差异。例如，此类GAVE6蛋白质和多肽具有至少一种此处描述的生物活性。
因此，有用的GAVE6蛋白质为这样的蛋白质，其包括与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少约45％，优选地55％，65％，75％，85％，95％，99％或100％相同的氨基酸序列，并保留了SEQ ID NO2的GAVE6蛋白质的功能活性。在一个特定的实施方案中，该GAVE6蛋白质保留了SEQ ID NO2的GAVE6蛋白质的功能活性。
为了确定两条氨基酸序列或两条核酸的百分同一性，对序列进行比对以优化比较(如可在第一条氨基酸或核酸序列中导入缺口(gap)，以使其与第二条氨基酸或核酸序列最佳比对)。然后在相应氨基酸位置或核苷酸位置比较氨基酸残基或核苷酸。当第一条序列中的某个位置与第二条序列中的相应位置被同一氨基酸残基或核苷酸占据，则认为这些分子在那个位置是相同的。两条序列间的百分同一性为两条序列共享的同一位置的数目的函数(即百分同一性＝同一的位置的数目/位置的总数(如重叠位置)X 100)。在一个实施方案中，两条序列长度相同。
可用数学算法完成对两条序列间百分同一性的确定。用于比较两条序列的数学算法的一个特定的非限制性例子是Karlin等人，美国国家科学院院报(1990)872264提供的算法，改进算法见Karlin等人，美国国家科学院院报(1993)905873-5877。此算法被引入Altschul等人，分子生物学杂志(J Mol Bio)(1990)215403的NBLAST和XBLAST程序中。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，设置例如记分＝100，字长＝12，来获得与本发明GAVE6核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质检索，设置记分＝50，字长＝3，来获得与本发明的GAVE6蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得有缺口的对比序列用于比较，可使用Altschul等人，核酸研究(1997)253389中描述的Gapped BLAST。或者，可用PSI-Blast进行迭代检索来检测分子间的距离关系。Altschul等人(1997)见上文。应用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省参数，参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
用于比较序列的数学算法的另一特定的非限制性实例为Myers等人，CABIOS(1988)411-17提供的算法。此算法被引入GCG序列比较软件包的ALIGN程序(版本2.0)部分中。应用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分为12且缺口罚分为4。
可用类似于上面所描述的技术在允许或不允许缺口的情况下确定两条序列间的百分同一性。在计算百分同一性时，只计数准确的匹配。
本发明也提供了GAVE6嵌合体或融合蛋白质。如此处所用，GAVE6“嵌合蛋白质”或“融合蛋白质”包括可操作地连接非GAVE6多肽的GAVE6多肽。“GAVE6多肽”是指多肽具有对应于GAVE6的氨基酸序列。“非GAVE6多肽”是指多肽具有的氨基酸序列对应于基本上不同于GAVE6蛋白质的蛋白质，如不同于GAVE6蛋白质且来自相同或不同生物体的蛋白质。
在GAVE6融合蛋白质中，GAVE6多肽可对应于GAVE6蛋白质的全部或部分，优选GAVE6蛋白质的至少一个生物活性部分。在融合蛋白质中，术语“可操作地连接”是指GAVE6多肽和非GAVE6多肽相互间融合在读码框内。可将非GAVE6多肽融合在GAVE6多肽的N-端或C-端。一种有用的融合蛋白是GST-GAVE6，其中GAVE6序列融合至谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的C-端。此融合蛋白质使得重组GAVE6的纯化易于进行。
在另一实施方案中，本发明融合蛋白质延及GAVE6-免疫球蛋白融合蛋白质，其中全部的GAVE6或其一部分被融合至来自免疫球蛋白家族成员的序列上。可将本发明的GAVE6-免疫球蛋白融合蛋白质掺入药物组合物并施与受试者以抑制GAVE6配体和细胞表面的GAVE6蛋白质间的相互作用，由此体内抑制GAVE6-介导的信号转导。GAVE6-免疫球蛋白融合蛋白质可用于影响GAVE6相关配体的生物利用度。GAVE6配体-GAVE6相互作用的抑制在治疗上是有用的，可用于治疗增生和分化失调并用于调节(如促进或抑制)细胞存活。而且，本发明的GAVE6-免疫球蛋白融合蛋白质可用作免疫原以在受试者体内产生抗GAVE6抗体、以纯化GAVE6配体和进行筛选测试来确定可抑制GAVE6与GAVE6配体间相互作用的分子。
在一个特定实施方案中，本发明的GAVE6嵌合或融合蛋白质通过标准的重组DNA技术产生。例如，将编码不同多肽序列的DNA片段按照常规技术连接在读码框内，如用钝末端或粘末端连接、限制性酶消化以提供合适的末端、根据需要补平粘末端、碱性磷酸酶处理以避免不想要的连接和酶促连接。在另一实施方案中，可通过常规技术包括DNA自动合成仪合成融合基因。另外，可用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，这样在两个连续的基因片段间产生互补的突出端，接下来可退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参见如Ausubel等人，见上文)。而且，许多已编码融合部分(如GST多肽)的表达载体可通过商业途径得到。可将编码GAVE6的核酸克隆入此类表达载体，这样融合部分与GAVE6蛋白质连接在读码框内。
变体如上述说明，本发明进一步涉及GAVE6蛋白质之变体。例如，可使用标准技术，例如定点诱变及PCR介导之诱变，将突变引入SEQ ID NO2之氨基酸序列中。此外，可针对一或多个预测的非必需氨基酸残基进行保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”为氨基酸残基被具有类似侧链之氨基酸残基替换。例如，一或多个氨基酸可被具有类似极性之另一氨基酸(其具有功能性对等物之作用)置换，产生沉默改变。在本发明多肽的氨基酸序列内，氨基酸的置换可选自该氨基酸所属组别之其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸及甲硫氨酸。含有芳族环结构的氨基酸为苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、及谷氨酰胺。带正电荷(碱性)之氨基酸包括精氨酸、赖氨酸及组氨酸。带负电荷(酸性)之氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。此等改变预期不影响由聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定之表观分子量或等电点。
特别优选之置换为-以Lys置换Arg，反之亦然，以便可以保持正电荷；-以Glu置换Asp，反之亦然，以便可以保持负电荷；-以Ser置换Thr，以便可以保持游离-OH；-以Gln置换Asn，以便可以保持游离-NH2。
此外，亦可引入氨基酸置换以置换为具有特别优选性质的氨基酸。例如，可引入Cys以提供与另一Cys形成二硫键之潜在位点；可引入His作为特别的“催化”位置(亦即，His可以起到酸或碱的作用，为生化催化反应中最常见之氨基酸)；Pro由于其特殊平面结构而可以被引入以在蛋白质结构中诱导β-转角。
此外，可在全长或部分的GAVE6编码序列中随机导入突变，如通过饱和诱变导入，并且通过对所得的突变体筛选GAVE6生物活性来鉴定保留活性的突变体。诱变后，可重组表达编码的蛋白质并可确定蛋白质的活性。
本发明的变体可起GAVE6激动剂(模拟物)的作用或起GAVE6拮抗剂的作用。GAVE6蛋白质的变体可通过诱变产生，如GAVE6蛋白质的不连续点突变或截短。GAVE6蛋白质的激动剂可保留与天然存在的GAVE6蛋白质基本上相同的生物学活性或其中一部分的生物活性。例如，GAVE6蛋白质的拮抗剂可通过竞争性结合包括GAVE6蛋白质的细胞信号级联的下游或上游成员来抑制天然GAVE6蛋白质的一种或多种活性。因此，用功能局限的变体来处理可产生特定的生物学作用。用如下变体处理受试者较用GAVE6蛋白质的天然存在形式处理可对受试者产生较小的副作用，其中所述变体具有该蛋白质天然存在形式的一部分生物活性。
作为GAVE6激动剂(模拟物)或GAVE6拮抗剂起作用的GAVE6蛋白质变体可通过针对GAVE6激动剂或拮抗剂活性筛选GAVE6蛋白质突变体如截短突变体的组合文库而鉴定。在一个实施方案中，GAVE6变体的多样化文库通过核酸水平的组合诱变产生并由多样化基因文库编码。例如，多样化GAVE6变体文库可通过如下方式制备将合成的寡核苷酸混合物酶促连接入基因序列中，以使一组简并的潜在GAVE6序列可表达为单独的多肽，或备选地，表达为其中含有该组GAVE6序列的一组较大融合蛋白(例如，噬菌体展示)。有许多方法可用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在的GAVE6变体文库。可在DNA自动合成仪上进行简并基因序列的化学合成，然后将合成的基因连接入合适的表达载体。基因简并集合的使用使得可在一个混合物中提供编码所需的潜在GAVE6序列集合的所有序列。用于合成简并寡核苷酸的方法为本领域公知(参见如Narang，四面体(Tetrahedron)(1983)393；Itakura等人，生物化学年鉴(Ann RevBiochem)(1984)53323；Itakura等人，科学(Science)(1984)1981056；Ike等人，核酸研究(1983)11477)。
此外，GAVE6蛋白质编码序列的片段文库可用于产生多样化的GAVE6片段群体，用来筛选和接下来选择GAVE6蛋白质变体。在一个实施方案中，编码序列片段的文库可如下产生用核酸酶处理GAVE6编码序列的双链PCR片段(在所述处理进行的条件下，在每个分子中仅发生大约一次切割)，变性该双链DNA，复性所得DNA以形成可能包含来自不同缺口产物的有义/反义对的双链DNA，重新形成的双链体用S1核酸酶处理去除单链部分并将所得的片段文库连接入表达载体。通过此方法，可获得编码GAVE6蛋白质N-端和不同大小内部片段的表达文库。
用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物和筛选cDNA文库以获得具有所选特性的基因产物的一些技术在本领域是公知的。此类技术适用于快速筛选通过组合诱变GAVE6蛋白质产生的基因文库。适于高通量分析筛选大基因文库的最广泛使用的技术一般包括将基因文库克隆入复制型表达载体，用所得的载体文库转化合适的细胞并在一定的条件下表达组合基因，其中对所需活性的检测有利于分离编码基因的载体，其中所述基因的表达产物已得以检测。递归整体诱变(recursive ensemblemutagenesis；REM)为在文库中增加功能突变体的频率的技术，该技术可用于与筛选测试结合来鉴定GAVE6变体(Arkin等人，美国国家科学院院报(1992)897811-7815；Delgrave等人，蛋白质工程(Protein Engineering)(1993)6(3)327-331)。
GAVE6类似物及衍生物此外，本发明亦包括以化学修饰法制备的GAVE6衍生物或类似物。本发明之GAVE6蛋白质可通过使蛋白质部分连接一或多个化学部分予以衍生化。
用于衍生化的化学部分-适用于衍生化之化学部分可选自水溶性聚合物，从而使该GAVE6类似物或衍生物于水性环境(例如生理环境)中不会沉淀。任选地，该聚合物为可药用的。本领域技术人员可基于例如该聚合物/成分缀合物是否可于治疗上使用，以及如果可以的话，所需剂量、循环时间、对蛋白水解的抗性等考虑因素选择所需之聚合物。对于GAVE6，可使用本文提供的试验予以确定。在此处具有用途的水溶性聚合物的实例包括，但不限于，聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧杂环己烷、聚-1，3，6-三氧杂环己烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或者随机共聚物)、dextran、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由于在水中之稳定性而于制备上具有优点。
聚合物可具有任何分子量，并可是分枝或不分枝的。以聚乙二醇而言，为了容易操作及制备，优选之分子量介于约2kDa与约100kDa之间(“约”一词表明聚乙二醇制品中，有些分子较所述分子量重，有些则较轻)。视所需治疗性质(例如，所需缓释持续时间、对生物活性的影响(若有的话)、操作容易性、抗原性的程度或缺乏、及聚乙二醇对治疗性蛋白质或类似物之其它已知效应)而定，可使用其它大小。
如此连接于GAVE6之聚合物分子的数目可不同，并且本领域技术人员能够确定其对功能的影响。可以使用相同或不同的化学部分(例如，聚合物，如不同重量之聚乙二醇)予以单一衍生化，或可提供二-、三-、四-衍生物或某种衍生化组合。聚合物分子对GAVE6分子之比例可不同，其于反应混合物中之浓度亦可以不同。通常最适比例(就其中无过量未反应成分或诸成分及聚合物的反应的效率而言)由例如所需衍生化程度(例如，单、二-、三-、等)、所选聚合物分子量、聚合物是不分枝的或是分枝的、及反应条件等因素决定。
聚乙二醇分子(或其它化学部分)连接于GAVE6时应虑及对GAVE6功能域或抗原性域的影响。本领域技术人员有许多可运用的连接方法，例如，并入本文供参考用之EP 0 401 384(将PEG偶联于G-CSF)，亦参见Malik et al.，1992，Exp.Hematol.201028-1035(记载使用tresyl chloride之GM-CSF的聚乙二醇化)。举例而言，聚乙二醇可藉反应基，例如，游离氨基或羧基，经由氨基酸残基共价结合。反应基为可与活化之聚乙二醇分子结合者。具有游离氨基之氨基酸残基包括赖氨酸残基及N-末端氨基酸残基；具有游离羧基者包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基及C-末端氨基酸残基。亦可使用巯基作为反应基，以连接聚乙二醇分子。用于治疗用途时优选连接于氨基，例如连接于N-末端或赖氨酸基团。
可能特别需要N-末端经化学修饰之GAVE6。使用聚乙二醇举例说明本发明组合物，可从多种聚乙二醇分子(由分子量、分支情况等)、反应混合物中聚乙二醇分子对GAVE6分子之比例、所进行的聚乙二醇化反应之类型、及获得选定N-末端聚乙二醇化蛋白质之方法予以选择。获得N-末端聚乙二醇化制品(亦即，如果需要，则自其它单聚乙二醇化部分中分离此部分)之方法可为从聚乙二醇化蛋白质分子群中纯化N-末端聚乙二醇化物质。选择性N-末端化学修饰可通过利用GAVE6中可以用于衍生化的不同类型伯胺基团之不同反应性(赖氨酸对N-末端)籍由还原性烷化作用达成。于适当反应条件下，可以用含羰基的聚合物对GAVE6在N-末端进行实质上的选择性衍生化。例如，于容许利用赖氨酸残基的ε-氨基与GAVE6 N-末端残基的α-氨基间的pKa差异之pH下进行反应，可将GAVE6选择性地N-末端聚乙二醇化。利用此选择性衍生化，可控制水溶性聚合物与GAVE6之连接与聚合物之缀合主要发生于GAVE6之N-端，而其它反应性基团，例如赖氨酸侧链氨基，则无明显的修饰作用发生。使用还原性烷化作用，水溶性聚合物可属上述类型，并且应具有供偶联于GAVE6之单一反应性醛。可使用含单一反应性醛的聚乙二醇丙醛。
GAVE6、其变体、其片段、或其类似物或衍生物之抗体可使用分离之GAVE6蛋白质或其部分或片段作为免疫原，使用制备多克隆与单克隆抗体之标准技术产生结合GAVE6之抗体。此处所用术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原结合位点的分子或其片段，其中所述抗原结合位点特异性结合抗原如GAVE6。特异性结合GAVE6的分子是在天然含有GAVE6的样品如生物样品中结合GAVE6而不结合其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括用酶如胃蛋白酶处理抗体可产生的F(ab)和F(ab′)2片段。本发明提供以GAVE6、其变体、其片段、或其类似物或衍生物作为免疫原之多克隆、单克隆及嵌合型抗体。用于治疗人类病症或失调症时，以嵌合型抗体为佳，因为人类或人源化抗体本身与异种抗体相比有小得多的可能性诱发免疫反应，特别是过敏反应。
可使用全长GAVE6蛋白质作为免疫原，或者，本发明提供GAVE6之抗原性肽片段作为免疫原。GAVE6之抗原肽含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列中的至少8个(优选地10、15、20、30或更多个)氨基酸残基，并涵盖GAVE6之抗原决定部位，从而对抗该肽产生的抗体可以与GAVE6形成特异免疫复合物。
GAVE6免疫原一般通过用该免疫原免疫合适的受试对象(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳动物)被用于制备抗体。合适的免疫原性制品可包含如重组表达的GAVE6蛋白质或化学合成的GAVE6多肽。该制品还可包含佐剂，诸如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。用免疫原性GAVE6制品免疫合适的受试对象可诱导多克隆的抗GAVE6抗体反应。
本发明之抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体、或嵌合型抗体。此处所用术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一群这样的抗体分子，其只包含一种可与GAVE6特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。这样单克隆抗体组合物一般显示出与特定的GAVE6蛋白质表位的单一结合亲和性。
多克隆抗GAVE6抗体可如上所述通过用GAVE6免疫原免疫合适的受试对象而制备。可用标准技术，如使用固定化GAVE6的酶联免疫吸附测试法(ELISA)，在一段时间内监测接受免疫的受试对象体内的GAVE6抗体效价。如果需要，可从哺乳动物(如从血液)分离直接针对GAVE6的抗体分子，并用公知的技术如蛋白A层析法进一步纯化，以获得IgG级分。免疫后在合适的时间，如当抗GAVE6抗体效价最高时，可从受试对象获得抗体产生细胞并通过标准技术利用此细胞制备单克隆抗体，所述技术有例如Kohler等人，自然(Nature)(1975)256495-497最初描述的杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kohler等人，今日免疫学(Immunol Today)(1983)472)，EBV杂交瘤技术(Cole等人，单克隆抗体和癌治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，(1985)，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)或三瘤(trioma)技术。产生杂交瘤的技术是公知的(一般参见免疫学最新技术(Current Protocols in Immunology)(1994)Coligan等人编辑，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，NY)。简而言之，将永生细胞系(通常为骨髓瘤)与来自如上所述的GAVE6免疫原免疫过的哺乳动物的淋巴细胞(通常为脾细胞)融合，并筛选所得杂交瘤细胞的培养上清来鉴定产生结合GAVE6的单克隆抗体的杂交瘤。
可使用任一熟知的用于融合淋巴细胞和永生细胞系的方法产生抗GAVE6单克隆抗体(参见如免疫学最新技术，见上文；Galfre等人，自然(1977)266550-552；Kenneth，单克隆抗体生物学分析中的新方面(Monoclonal AntibodiesA New Dimension In Biological Analyses)，Plenum Publishing Corp.，纽约，N.Y.(1980)；和Lerner，耶鲁生物医学杂志(Yale J Biol Med)(1981)54387-402)。而且，普通技术人员可以理解也可用此类方法的诸多改变后的方法。
一般永生细胞系(如骨髓瘤细胞系)来自与淋巴细胞相同的哺乳动物种类。例如，鼠杂交瘤可通过用本发明免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴细胞与永生小鼠细胞系如骨髓瘤细胞系融合而制备，其中骨髓瘤细胞系对含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培养基(“HAT培养基”)敏感。许多骨髓瘤细胞系中的任一种都可按照标准技术用作融合伙伴(partner)，如P3-NS1/l-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤细胞系。这些骨髓瘤细胞系可从ATCC获得。
一般，用聚乙二醇(“PEG”)使HAT敏感的小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞融合。融合所得的杂交瘤细胞然后用HAT培养基选择，其中HAT培养基杀死未融合的和非生产性融合的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞由于未被转化几天后死去)。本发明的产生单克隆抗体的杂交瘤细胞可通过筛选骨髓瘤细胞培养物上清液中结合GAVE6的抗体进行检测(例如应用标准的ELISA试验)。
作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的备选方案，可以应用GAVE6筛选重组组合免疫球蛋白质文库(如抗体噬菌体展示文库)，由此得以分离结合GAVE6的免疫球蛋白文库成员，从而鉴定和分离到抗-GAVE6的单克隆抗体。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒可从供应商处获得(例如，Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及StratageneSurfZAP噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。
此外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可在以下文献中查询，例如美国专利号5,223,409；PCT公开号WO 92/18619；PCT公开号WO 91/17271；PCT公开号WO 92/20791；PCT公开号WO 92/15679；PCT公开号WO 93/01288；PCT公开号WO 92/01047；PCT公开号WO 92/09690；PCT公开号WO 90/02809；Fuchs等，Bio/Technology(1991)91370-1372；Hay等，Hum Antibody Hybridomas(1992)381-85；Huse等，科学(Science)(1989)2461275-1281和Griffiths等，EMBO J(1993)25(12)725-734。
此外，重组抗GAVE6抗体，如嵌合的和人源化的单克隆抗体(同时包含人的和非人的部分)可以使用标准重组DNA技术制备。该嵌合和人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组DNA技术产生，例如使用如下文献中描述的方法产生PCT公开号WO 87/02671；欧洲专利申请号184,187；欧洲专利申请号171,496；欧洲专利申请号173,494；PCT公开号WO 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利申请号125,023；Better等，科学(1988)2401041-1043；Liu等，美国国家科学院院报(1987)843439-3443；Lin等，免疫学杂志(1987)1393521-3526；Sun等，美国国家科学院院报(1987)84214-218；Nishimura等，癌研究(Canc Res)(1987)47999-1005；Wood等，自然(1985)314446-449；Shaw等，国家癌研究所杂志(J Natl Cancer Inst)(1988)801553-1559；Morrison，科学(1985)2291202-1207；Oi等，生物/技术(Bio/Techniques)(1986)4214；美国专利号5,225,539；Jones等，自然(1986)321552-525；Verhoeyan等，科学(1988)2391534；和Beidler等，免疫学杂志(J Immunol)(1988)1414053-4060。
特别需要完全人抗体以用于治疗人类患者。该抗体可应用转基因小鼠制备，所述转基因小鼠不能表达内源免疫球蛋白重链和轻链基因，而能够表达人的重链和轻链基因。该转基因小鼠可以用选择的抗原(如GAVE6的全部或一部分)以标准方式进行免疫。直接针对该抗原的单克隆抗体可由常规的杂交瘤技术获得。位于转基因小鼠中的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中进行重排，并随后经历类型转换和体细胞突变。
这样，应用该表位可鉴定出抑制GAVE6活性的抗体。克隆非人抗体的重链和轻链并用于构建噬菌体展示的Fab片段。例如，可将重链基因克隆到质粒载体中，以使细菌分泌重链。可将轻链基因克隆到噬菌体外壳蛋白基因中以使其可表达于噬菌体表面。使用与人轻链库(随机收集的)融合的噬菌体感染表达非人重链的细菌。产生的后代噬菌体展示杂合抗体(人轻链/非人重链)。利用选择的抗原淘选能结合所选抗原的噬菌体。为鉴定出该噬菌体可能需要几轮筛选。
从选出的可结合所选抗原的噬菌体中分离人轻链基因。然后利用选出的人轻链基因指导人重链基因的筛选，方法如以下所述。将选出的人轻链基因插入细菌表达载体。表达所选人轻链的细菌用融合了人重链库的噬菌体进行感染。产生的子代噬菌体展示人抗体(人轻链/人重链)。
接着，使用选出的抗原淘选可结合选择抗原的噬菌体。选出的噬菌体展示出完全人抗体，该抗体识别的表位与最初选择的非人单克隆抗体所识别的表位相同。分离编码重链和轻链的基因，并可进一步操作用于制备人抗体。该技术参见Jespers等的描述(生物/技术(Bio/Technology)(1994)12899-903)。
抗-GAVE6抗体(如单克隆抗体)可通过标准技术(如亲和层析或免疫沉淀)用来分离GAVE6。抗-GAVE6抗体可以帮助从细胞中纯化天然的GAVE6和表达于宿主细胞中的重组产生的GAVE6。此外，抗-GAVE6抗体可用于检测GAVE6蛋白质(如在细胞裂解物或细胞上清液中)以评估GAVE6蛋白质的表达丰度和表达方式。抗-GAVE6抗体可用于诊断中作为临床试验方法的一部分来监测组织中的蛋白质水平，以便例如，确定特定治疗方案的疗效。如下文所述，将抗体与可检测的物质偶联可促进检测的进行。
可检测的标记物任选地，本发明的分离核酸分子、本发明多肽和本发明抗体、以及这些部分之片段，可进行可检测标记。适当标记物包括酶、荧光团[例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红(TR)、罗丹明、游离或螯合的镧系盐(特别是Eu3+)等]、发光团、放射性同位素、螯合剂、染料、胶体金、乳胶颗粒、配体(例如，生物素)、生物发光物质、及化学发光剂。使用对照标志时，受体及对照标志可使用相同或不同的标记物。
使用放射性标记物，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、及186Re之情形下，可使用目前已知可用之计数方法。于标记物为酶的情形下，可利用本领域中目前使用之比色、分光光度、荧光分光光度、电流测定或气体定量测定等技术之任一者达成检测。
直接标记物为根据本发明可用的标记物的一个实例。直接标记物被定义为呈天然状态时，以肉眼或藉助于光学滤片及/或通过施加刺激(例如，以U.V.光引起荧光)易于被看见之实体。根据本发明可用的有色标记物的实例包含金属溶胶颗粒，例如，如Leuvering(美国专利4,313,734)所述之金溶胶颗粒；如Gribnau et al.(美国专利4,373,932)与May et al.(WO 88/08534)所述之染料溶胶颗粒；如May(文献同前)、Snyder(EP-A 0 280 559与0 281327)所述之染色乳胶；或如Campbell et al.(美国专利4,703,017)所述之包封于脂质体中之染料。其它直接标记物包括放射性核苷酸、荧光基团或发光基团。除了这些直接标记装置外，包括酶在内的间接标记物亦可根据本发明予以使用。多种酶联免疫吸附测定法为本领域中悉知，例如，碱性磷酸酶与辣根过氧化物酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、脲酶，这些及其它实例已由Eva Engvall于Methods in Enzymology，70，419-439，1980之Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT及美国专利4,857,453详细讨论。
用于本发明之其它标记物包括磁珠或磁共振成像标记物。
于另一实施方案中，可于本发明分离多肽、本发明抗体、或其片段上，产生供32P标记用之磷酸化位点，例如，见述于Sidney Pestka之欧洲专利0372707(申请号89311108.8)或1995年10月17日颁给Foxwell et al.之美国专利5,459,240。
如此处所例示，蛋白质，包括抗体，可通过代谢标记法予以标记。代谢标记发生于在补充代谢性标记物(例如[35S]-甲硫氨酸或[32P]-正磷酸盐)的培养基存在下体外培养表达该蛋白质的细胞的期间。除了以[35S]-甲硫氨酸进行代谢性(或生物合成性)标记外，本发明还考虑以[14C]-氨基酸及[3H]-氨基酸(其中氚取代于非不稳定位置)进行标记。
重组表达载体和宿主细胞本发明另一方面涉及含编码GAVE6(或其一部分)的核酸的载体，优选表达载体。如上所解释的，载体的一个类型为“质粒”，是指可连入额外DNA区段的环状双链DNA环。载体的另一类型为病毒载体，其中可以将额外的DNA区段连入病毒基因组中。某些载体可在宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他的载体(如非游离型的哺乳动物载体)在导入宿主细胞内时整合到宿主细胞基因组中，并因此随宿主基因组一同复制。此外，表达载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。一般，重组DNA技术中应用的表达载体常为质粒(载体)形式。然而，本发明意在包括其他形式的表达载体，如可执行等同功能的病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体包含本发明的核酸分子，所述核酸分子以适于在宿主细胞内表达的形式存在。这意味着本发明的重组表达载体包括一段或多段基于用于表达的宿主细胞而选出的调控序列，该序列与待进行表达的核酸可操作地连接。在重组表达载体内，“可操作地连接”意指目的核苷酸序列连接到调控序列上，其连接方式允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中或当载体导入宿主细胞中后在该宿主细胞中表达)。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(如多聚腺苷酸化信号)。该调控序列在如Goeddel，基因表达技术酶学方法(GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology)，185卷，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有描述。调控序列包括那些指导核苷酸序列在多种宿主细胞中进行组成型表达的序列(如组织特异的调控序列)。本领域内的技术人员应当理解，表达载体的设计将取决于选择进行转化的宿主细胞、所需蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体导入宿主细胞中以产生此处描述的核酸编码的蛋白质或肽(如GAVE6蛋白质、突变体形式的GAVE6和融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可设计用于在原核或真核细胞中表达GAVE6，所述细胞有例如，细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞。合适的宿主细胞在之前的Goeddel的文献中有讨论。备选地，重组表达载体可应用如噬菌体的调控元件和蛋白质在体外进行转录和翻译，其中所述元件和蛋白质如T7启动子和/或T7聚合酶。
蛋白质在原核细胞内的表达大都在大肠杆菌中使用载体进行，所述载体含有指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子。融合载体可在其编码的蛋白质上添加一些氨基酸，这些氨基酸通常添加到重组蛋白的氨基端。此类融合载体一般有三种用途1)提高重组蛋白的表达；2)提高重组蛋白的溶解度；和3)在亲和纯化中作为配体协助重组蛋白的纯化。通常，融合表达载体中在融合部分和重组表达蛋白的连接处导入有一个蛋白水解切割位点，从而使得可以在纯化融合蛋白后使重组蛋白得以和融合部分分离。此类酶和关联识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith等，基因(Gene)(1988)6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，三者分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合到靶重组蛋白上。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等，基因(Gene)(1988)69301-315)和pET 11d(Studier等，基因表达技术酶学方法(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)，AcademicPress，San Diego，California(1990)18560-89)。pTrc载体上靶基因的表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂合trp-lac融合启动子起始转录。
使大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的一个策略是在蛋白水解切割重组蛋白的能力被削弱的宿主中表达蛋白(Gottesman，基因表达技术酶学方法，Academic Press，San Diego，California(1990)185119-128)。另一策略是改变待插入表达载体的核酸的核酸序列，以使编码每一氨基酸的各密码子都为优选在大肠杆菌中应用的密码子(Wada等，核酸研究(1992)202111-2118)。对本发明核酸序列进行此类改变可通过标准的DNA合成技术完成。
在另一实施方案中，GAVE6表达载体为酵母表达载体。用于在酵母(如酿酒酵母(S.cerevisiae))中实现表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan等，细胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
备选地，可应用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达GAVE6。现有可用于在培养的昆虫细胞(如Sf 9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)(1983)32156-2165)和pVL系列(Lucklow等，病毒学(Virology)(1989)17031-39)。
而在另一实施方案中，本发明的核酸使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中进行表达。应用于此处的哺乳动物表达载体的实例包括，但当然不限于pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)。当用于哺乳动物细胞时，表达载体的控制功能常由病毒调控元件提供。例如，通常应用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40。对于其他适用于原核和真核细胞的表达系统，见之前Sambrook等的文献的第16和17章。
在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优选地在特定的细胞类型中表达(例如，应用组织特异的调控元件来表达核酸)。组织特异的调控元件在本领域内是公知的。合适的组织特异性启动子的非限定实例包括白蛋白启动子(肝脏特异；Pinkert等，基因进展(Genes Dev)(1987)1268-277)，淋巴特异的启动子(Calame等，Adv Immunol(1988)43235-275)，特别是T细胞受体(Winoto等，EMBO J(1989)8729-733)和免疫球蛋白(Banerji等，细胞(Cell)(1983)33729-740；Queen等，细胞(Cell)(1983)33741-748)的启动子，神经元特异的启动子(如神经丝启动子；Byrne等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1989)865473-5477)，胰腺特异的启动子(Edlund等，科学(Science)(1985)230912-916)和乳腺特异的启动子(如奶乳清蛋白启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请号264,166)。发育调节的启动子也包括在内，如鼠hox启动子(Kessel等，科学(Science)(1990)249374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes等，基因进展(Genes Dev)(1989)3537-546)。
本发明还提供含本发明的DNA分子的重组表达载体，其中该DNA分子以反义方向克隆在表达载体中。也就是，DNA分子可操作地连接到调控序列上，该连接方式使得可以表达(通过转录该DNA分子)产生与GAVE6mRNA反义的RNA分子。可以对与反义方向克隆的核酸可操作连接的调控序列进行选择以指导反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达。例如，可选择病毒启动子和/或增强子或调控序列以指导反义RNA实现组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达。反义表达载体的形式可为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒，其中反义核酸被置于高效调控区域的控制下，其活性由载体所导入的细胞的类型决定。使用反义基因进行基因表达调控的讨论见Weintraub等(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。
本发明的另一方面涉及已导入本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在此处可互换使用。应当理解，该术语不仅指特定的受试细胞，也指该细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响在传代过程中可发生某些改变，这样，后代实际上可能并非与亲代细胞相同，但其仍包括在此处所用术语的范围之内。
宿主细胞可为任意的原核或真核细胞。例如，GAVE6蛋白质可在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、293细胞或COS细胞)中表达。其他合适的宿主细胞为本领域内的技术人员公知。载体DNA可通过常规转化或转染技术导入原核或真核细胞中。如此处所用，术语“转化”和“转染”意指本领域内公知的各种将外源核酸(如DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、转导、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂转染或电穿孔。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，已知根据应用的表达载体和转染技术，仅一小部分的细胞可将外源DNA整合到基因组中。为鉴定和筛选整合体，一般将编码选择标记的基因(如抗生素抗性基因)与目的基因一同导入宿主细胞。优选的选择标记包括那些可赋予药物抗性的基因，所述药物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。编码选择标记的核酸可与编码GAVE6的基因位于同一载体上被导入宿主细胞或可以位于不同的载体上导入。被导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物筛选进行鉴定(例如，掺入了选择标记物基因的细胞将存活，而其他细胞死亡)。
本发明的宿主细胞(如培养的原核或真核宿主细胞)可用于产生(即表达)GAVE6蛋白质。因此，本发明进一步提供了通过应用本发明的宿主细胞产生GAVE6蛋白质的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(编码GAVE6的重组表达载体已经导入了该细胞)，由此使GAVE6蛋白质得以产生。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离GAVE6。
在另一实施方案中，GAVE6被包含在诱导型表达系统中，用于其他亚克隆到修饰表达载体上的蛋白质的重组表达。例如，包含突变G蛋白的宿主细胞(例如，酵母细胞、Y2肾上腺皮质细胞和cyc-S49，见美国专利号6,168,927B1，5,739,029和5,482,835；Mitchell等，美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad USA)(1992)89(19)8933-37和Katada等，生物化学杂志(J BiolChem)(1984)259(6)3586-95)用含有编码GAVE6的核酸序列的第一表达载体进行转导，其中该GAVE6在宿主细胞中进行功能表达。尽管表达的GAVE6具有组成型活性，但突变的存在不允许信号转导发生；即，不能激活G蛋白指导的下游级联放大(例如，不能激活腺苷酰环化酶)。随后，用第二表达载体转导包含GAVE6的宿主细胞。除待通过此诱导型系统进行表达的目的基因外，第二载体还包含与宿主细胞G蛋白突变体互补的结构基因(即，哺乳动物或酵母的功能性Gs、Gi、Go或Gq，例如，见PCT公开号WO 97/48820；美国专利号6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835)。第二载体的互补结构基因为可诱导的；即，处于外源添加的化合物(如四环素、IPTG、小分子等，见之前的Sambrook等的文献)的控制下，所述化合物可以激活与所述互补结构基因可操作连接的启动子。加入诱导剂后，该互补结构基因编码的蛋白质进行功能性表达，结果具有组成型活性的GAVE6将形成复合体，导致适当的下游通路的激活(例如，形成第二信使)。第二载体包含的目的基因具有可操作连接的启动子，所述启动子可以由合适的第二信使(如CREB和AP1元件)激活。这样，当第二信使积聚时，目的基因上游的启动子被激活以表达所述基因的产物。缺乏诱导剂时，目的基因的表达关闭。
在一个特定的实施方案中，用于此诱导型表达系统的宿主细胞包括但不限于，S49(cyc)细胞。尽管本发明考虑包含G-蛋白突变的细胞系，但也可以人工制备/构建出合适的突变体(见针对酵母细胞的美国专利号6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835)。
在相关的方面，细胞用与如下cDNA可操作连接的载体转化，所述cDNA包含编码SEQ ID NO2中所示蛋白质的序列。该系统包含的第一和第二载体可以考虑包括但不限于，pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)、pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan.，细胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
在一个相关方面，宿主细胞可通过适宜的方法转染，其中转染可导致功能性GAVE6蛋白质的表达(例如，Sambrook等，同上和Kriegler，基因转移和表达实验室指南(Gene Transfer and ExpressionA LaboratoryManual)，Stockton Press，New York，NY，1990)。该“功能性蛋白质”包括但不限于，一经表达即可与G-蛋白形成复合体的蛋白质，其中该G-蛋白调节第二信使的形成。于本文中具有用途的其它宿主细胞转染方法包括，但当然不限于，转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、使用基因枪、或DNA载体转运子(参见，例如，Wu et al.，1992，J.Biol.Chem.267963-967；Wu and Wu，1988，J.Biol.Chem.26314621-14624；Hartmut et al.，加拿大专利申请2,012,311，1990年3月15日申请)。
广泛种类的启动子于本发明中具有用途。的确，本发明多肽之表达可由本领域中已知之任何启动子/增强子元件控制，但这些调控元件必须在选定供表达用的宿主中具有功能。可用于控制GAVE6表达之启动子包括，但不限于，SV40早期启动子区域(Benoist和Chambon，1981，Nature290304-310)、劳氏肉瘤病毒3’长末端重复中所含的启动子(Yamamoto etal.，1980，Cell 22787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金属硫蛋白基因之调控序列(Brinster et al.，1982，Nature 29639-42)、原核表达载体例如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)、或tac启动子(DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；亦参见《Scientific American》中“来自重组细菌的有用蛋白质”，1980，24274-94；得自酵母或其它真菌之启动子元件例如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；及具有组织特异性且已用于转基因动物之动物转录控制区域于胰腺腺泡细胞中具活性之弹性蛋白酶I基因控制区域(Swift et al.，1984，Cell 38639-646；Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；于胰腺β细胞中具活性之胰岛素基因控制区域(Hanahan，1985，Nature 315115-122)、于淋巴细胞中具活性之免疫球蛋白基因控制区域(Grosschedl et al.，1984，Cell 38647-658；Adames et al.，1985，Nature 318533-538；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、于丸、乳房、淋巴与肥大细胞中具活性之小鼠乳腺肿瘤病毒控制区域(Leder et al.，1986，Cell 45485-495)、于肝脏中具活性之白蛋白基因控制区域(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1268-276)、于肝脏中具活性之甲胎蛋白基因控制区域(Krumlauf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer et al.，1987，Science23553-58)、于肝脏中具活性之α1抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1161-171)、于髓样细胞中具活性之β-珠蛋白基因控制区域(Mogram et al.，1985，Nature 315338-340；Kollias et al.，1986，Cell 4689-94)、于大脑少突胶质细胞中具活性之髓鞘碱性蛋白质基因控制区域(Readhead et al.，1987，Cell 48703-712)、于骨骼肌中具活性之肌球蛋白轻链-2基因控制区域(Sani，1985，Nature 314283-286)、及于下丘脑中具活性之促性腺素释放激素基因控制区域(Mason et al.，1986，Science2341372-1378)。
含本发明核酸分子之表达载体可由四种一般方法予以鉴定(a)所需质粒DNA或特定mRNA之PCR扩增、(b)核酸杂交、(c)存在或不存在选择标记基因的功能、及(d)插入序列之表达。第一方法中，核酸可利用PCR扩增以便扩增产物的检测。第二方法中，插入表达载体中的外源基因之存在可通过使用包含与插入的标记基因同源的序列的探针进行核酸杂交予以鉴定。第三方法中，重组载体/宿主系统可根据由载体中插入外源基因引致的某些“选择标记”基因功能(例如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、抗生素抗性、转化表型、杆状病毒中包含体的形成等)之存在与否予以鉴定和挑选。于另一实例中，若编码GAVE6蛋白质、其变体、或其类似物或衍生物之核酸插入载体之”选择标记”基因序列内，则含该插入物之重组体可由不存在GAVE6基因功能予以鉴定。第四方法中，只要表达的蛋白质呈现功能活性构象，则重组表达载体可藉测定由重组体表达的基因产物之活性、生化或免疫学特征予以鉴定。
广泛种类的宿主/表达载体组合可用于表达本发明之DNA序列。有用的表达载体，举例而言，可由染色体片段、非染色体的及合成的DNA序列组成。适当之载体包括SV40与已知细菌质粒之衍生物，例如，大肠杆菌质粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith et al.，1988，Gene 6731-40)、pMB9及其衍生物、质粒例如RP4；噬菌体DNA，例如，λ噬菌体的许多衍生物，例如，NM989，及其它噬菌体DNA，例如，M13与丝状单链噬菌体DNA；酵母质粒例如2μ质粒或其衍生物；用于真核生物细胞之载体，例如用于昆虫或哺乳动物细胞之载体；由质粒与噬菌体DNA的组合衍生之载体，例如经修饰可以使用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒等。
例如，于杆状病毒表达系统中，非融合转移载体，例如但不限于pVL941(BamH1克隆位点；Summers)、pVL1393(BamH1、SmaI、XbaI、EcoR1、NotI、XmaIII、BglII、及PstI克隆位点；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI、及BamH1克隆位点；Summers和Invitrogen)、及pBlueBacIII(BamH1、BglII、PstI、NcoI、及HindIII克隆位点，可具有蓝/白重组体筛检；Invitrogen)，及融合转移载体，例如但不限于pAc700(BamH1与KpnI克隆位点，其中BamH1识别位点由起始密码子开始；Summers)、pAc701与pAc702(与pAc700相同，但读框不同)、pAc360[多角体蛋白起始密码子下游36碱基对BamH1克隆位点；Invitrogen(195)]、及pBlueBacHisA、B、C[三个不同读框，具有BamH1、BglII、PstI、NcoI、及HindIII克隆位点，供ProBond纯化之N-末端肽，及噬菌斑蓝/白重组体筛检；Invitrogen(220)]均可使用。
考虑用于本发明之哺乳动物表达载体包括具有可诱导的启动子[例如二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子]之载体，例如，具有DHFR表达载体之任何表达载体、或DHFR/氨甲喋呤共扩增载体，例如pED[PstI、SalI、SbaI、SmaI、及EcoRI克隆位点，载体表达克隆基因与DHFR二者；参见Kaufman，Current Protocols in Molecular Biology，16.12(1991)]。或者，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸亚磺酰亚胺共扩增载体，例如pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、及BclI克隆位点，其中载体表达谷氨酰胺合成酶与克隆基因；Celltech)。于另一实施方案中，可使用在Epstein Barr病毒(EBV)控制下指导附加体表达之载体，例如pREP4(BamH1、SiiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、及KpnI克隆位点、组成型RSV-LTR启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pCEP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、及KpnI克隆位点、组成型hCMV立即早期基因、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、及BamH1克隆位点、可诱导之金属硫蛋白Iia基因启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pREP8(BamH1、XhoI、NotI、HindIII、NheI、及KpnI克隆位点、RSV-LTR启动子、组氨醇选择标记；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、及BamH1克隆位点、RSV-LTR启动子、G418选择标记；Invitrogen)、及pEBVHis(RSV-LTR启动子、潮霉素选择标记、经由ProBond树脂可纯化及以肠激酶可切割的N-端肽；Invitrogen)。用于本发明之可选择哺乳动物表达载体包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI、及Apa1克隆位点、G418选择；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaI克隆位点、G418选择；Invitrogen)等。根据本发明可以使用之痘苗病毒哺乳动物表达载体包括但不限于pSC11(SmaI克隆位点、TK-及β-gal选择)、pMJ601(SalI、SmaI、Afli、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、及HindIII克隆位点；TK-及β-gal选择)、及pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII、SbaI、BamHI、及Hpa克隆位点；TK或XPRT选择)。
根据本发明亦可使用酵母表达系统来表达GAVE6蛋白质、其变体、或其类似物或衍生物。例如，仅举二例如下，非融合pYES2载体(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、KpnI、及HindIII克隆位点；Invitrogen)或融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI、及HindIII克隆位点、以ProBond树脂纯化及以肠激酶切割之N-端肽；Invitrogen)，均可根据本发明予以使用。
一经鉴定及分离出特定之重组DNA分子，便可使用本领域中已知的数种方法扩增它。一旦建立适当的宿主系统及生长条件，即可将重组表达载体增殖并大量制备。如先前之说明，可使用之表达载体包括，惟不限于，下述载体或其衍生物人类或动物病毒例如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒例如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如，λ)、及质粒与粘粒DNA载体，仅举数例如上。
此外，可选择能以所需特定方式调节插入序列的表达、或修饰及加工基因产物之宿主细胞株。不同宿主细胞在蛋白质的翻译与翻译后加工及修饰上[例如，糖基化作用、切割(例如，信号序列之切割)]具有特征性及特异的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质得到所需的修饰及加工。例如，细菌系统中之表达可用于制备无糖基化的核心蛋白质产物。
转基因动物本发明的宿主细胞也可用于制备非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞为受精的卵母细胞或胚胎干细胞，所述细胞中已导入编码GAVE6的序列。然后该宿主细胞可以用于产生基因组中导入了外源GAVE6序列的非人转基因动物，或产生其内源GAVE6序列已被改变的同源重组动物。该动物可用以研究GAVE6的功能和/或活性，以及用于鉴定和/或评估GAVE6活性的调节剂。如此处所用，“转基因动物”为非人动物，优选地为哺乳动物，更优选地为啮齿类动物如大鼠或小鼠，其中动物的一个或多个细胞包含转基因。转基因动物的其他实例包括非人灵长类、绵羊、狗、牛、山羊、鸡和两栖动物等。
如此处所用，术语“转基因”指外源DNA，其整合到细胞基因组中，并在细胞发育成转基因动物后保留在成熟动物的基因组内。转基因指导编码的基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。如此处所用，“同源重组动物”为非人动物，优选地为哺乳动物，更优选地为小鼠，其内源GAVE6基因已通过同源重组发生改变。这在动物发育之前，在内源基因以及导入动物细胞(如动物的胚胎细胞)的外源DNA分子间完成。
本发明的转基因动物可以通过使用上述一种转染方法将编码GAVE6的核酸分子导入受精卵母细胞的雄性原核、然后允许卵母细胞在假孕的雌性代孕动物体内发育来产生。GAVE6 cDNA序列(如(SEQ ID NO1)中的序列)可作为转基因导入非人动物的基因组中。备选地，人GAVE6基因的非人同系物(如小鼠GAVE6基因)可基于与人GAVE6 cDNA的杂交进行分离，并用作转基因。内含子序列和聚腺苷酸化信号也可包括在转基因内，以提高转基因的表达效率。组织特异的调控序列可以以可操作方式连接GAVE6转基因以指导GAVE6蛋白质在特定细胞内表达。用于通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物(特别是诸如小鼠等动物)的方法是本领域内的常规操作，且可参见如美国专利号4,736,866和4,870,009、美国专利号4,873,191和Hogan，小鼠胚胎的操作(Manipulating the MouseEmbryo)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。可以使用相似的方法产生在基因组中存在转基因和/或在动物的组织或细胞内表达GAVE6 mRNA的其它转基因动物。起始的转基因动物可用来繁殖其它的携带转基因的动物。此外，携带编码GAVE6的转基因的转基因动物可进一步被培育成携带其他转基因的转基因动物。
为生成同源重组动物，制备出含至少部分GAVE6基因(例如，人或非人GAVE6基因同系物，如鼠GAVE6基因)的载体，所述部分GAVE6基因中已经导入缺失、添加或替代因而可以改变(如功能性破坏)GAVE6基因。在一个优选的实施方案中，设计载体，以致在同源重组后可破坏内源GAVE6基因的功能(即，不再编码功能蛋白质；也称为“敲除”载体)。
备选地，可设计载体，以便在同源重组后内源GAVE6基因发生突变或改变但仍编码功能蛋白质(例如，可改变上游调控区域由此改变内源GAVE6蛋白质的表达)。
在此同源重组载体中，改变的GAVE6基因部分在5′和3′端被GAVE6基因的其它核酸序列包围，从而允许在载体携带的外源GAVE6基因和存在于胚胎干细胞内的内源GAVE6基因之间发生同源重组。此其它的两翼GAVE6核酸序列的长度应足以使与内源基因的重组成功进行。一般地，载体内包括几千碱基的侧翼DNA(5′及3′端)(例如参见，Thomas等，细胞(Cell)(1987)51503中对同源重组载体的描述)。
将载体导入(如通过电穿孔)胚胎干细胞系，且筛选出导入的GAVE6基因与内源GAVE6基因发生同源重组的细胞(例如参见，Li等，细胞(Cell)(1992)69915)。然后将筛选出的细胞注射到动物(如小鼠)的胚泡中以形成嵌合集合体(例如参见，Bradley，畸胎癌和胚胎干细胞实用方法(Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach)，Robertson编辑，IRL，Oxford，(1987)，113-152页)。然后将嵌合胚胎植入合适的假孕雌性代孕动物，并使胚胎生长足月。在生殖细胞中带有同源重组DNA的子代可用于繁殖动物，通过转基因的生殖系传送，所繁殖的动物的所有细胞都将含有同源重组的DNA。
用于构建同源重组载体和同源重组动物的方法可以进一步参见Bradley，生物/技术中的最新观点(Current Opinion in Bio/Technology)(1991)2823-829和PCT公开号WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169中的描述。
在另一实施方案，产生的转基因非人动物可含有所选系统以允许调控转基因的表达。该系统的一个实例为噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统。对cre/loxP重组酶系统的描述参见如Lakso等，美国国家科学院院刊(ProcNatl Acad USA))(1992)896232-6236。重组酶系统的另一实例为酿酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重组酶系统(O′Gorrnan等，科学(Science)(1991)2511351-1355)。如果cre/loxP重组酶系统被用于调控转基因的表达，则需要同时含有编码cre重组酶和选定蛋白的转基因的动物。该动物可通过构建“双重”转基因动物，例如通过两转基因动物的交配(所述动物中一个含有编码选定蛋白的转基因而另一个含有编码重组酶的转基因)来提供。
此处描述的非人转基因动物的克隆可根据以下文献描述的方法制备，Wilmut等，自然(Nature)(1997)385810-813和PCT公开号WO 97/07668和WO 97/07669。简言之，可以分离转基因动物的细胞如体细胞，诱导其脱离生长周期并进入G0期。然后，通过应用如电脉冲将此静止细胞与去除细胞核的卵母细胞融合，所述去核卵母细胞与分离的静止细胞来自同一动物物种。然后培养重建的卵母细胞以使其发育成桑椹胚或胚细胞，然后将其转移到假孕的雌性代孕动物体内。雌性代孕动物生育的后代即是分离细胞(如体细胞)所来源的动物的克隆。
药物组合物本发明的GAVE6核酸分子、GAVE6蛋白质和抗-GAVE6抗体(此处也称作“活性化合物”)可掺入到适于施用的药物组合物中。该组合物一般包含此核酸分子、蛋白质或抗体，以及可药用载体。如此处所用，术语“可药用载体”意在包括任何及所有适合药物施用的溶剂、分散介质、包衣材料、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。对药物活性物质应用这些介质和药剂是本领域熟知的。除了与活性化合物不相容的外，任何常规介质或药剂均可考虑应用在组合物内。还可以将辅助活性化合物掺入组合物中。
将本发明的药物组合物进行配制以使其适合于预定的施用途径。施用途径的实例包括肠胃外用药，例如静脉内、皮内和皮下、经口(如吸入)、经皮(局部的)、经粘膜和直肠用药。用于肠胃外、皮内和皮下给药的溶液或混悬液可包括以下成分无菌稀释剂(如用于注射的水)、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂如苄基醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如EDTA；缓冲剂如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调整渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。pH的调整可应用酸或碱，如HCl或NaOH进行。肠胃外制剂可封闭在安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶(玻璃或塑料制成)中。
适于注射用药的药物组合物包括无菌水性溶液(水可混溶的)或分散液，以及用于随时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲溶液(PBS)。在所有的情况中，组合物必须无菌且应是易于注射的流体。组合物在生产和储存条件下必须稳定，且必须避免微生物(如细菌和真菌)的污染。载体可为溶剂或分散介质，含有如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)和其适宜的混合物。适当的流动性可通过例如使用包衣材料(如卵磷脂)，在分散剂的情况下保持所需的粒子大小和应用表面活性剂来维持。多种抗菌剂和抗真菌剂可用来预防微生物的作用，如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠等。在许多情况下，组合物中优选包括等渗剂，例如糖、聚醇(如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可注射组合物的延时吸收可以通过在组合物中加入延缓吸收的试剂实现，所述试剂如单硬脂酸铝和明胶。
无菌注射溶液的制备可以按如下进行将活性化合物(如GAVE6蛋白质、其变体、或其类似物或衍生物；或抗-GAVE6抗体)以所需数量与以上所列成分中的一种或其组合(按需要)掺入到适当的溶剂中，之后过滤除菌。一般地，分散剂的制备方式是将活性化合物掺入到含碱性分散介质和所需其他成分(来自以上列举的成分)的无菌赋形药中。对于用于配制无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从预先过滤除菌的溶液产生含有活性成分及任何额外所需成分的粉末。
口服组合物一般包括惰性稀释液或可食用的载体。组合物可密封于明胶胶囊中或压成片剂。为用于口服治疗性施用目的，可以将活性化合物加入赋形剂中并以片剂、锭剂或胶囊形式使用。口服组合物也可用流体载体制备以用作漱剂，其中化合物在流体载体中经口应用、漱口然后吐出或咽下。
可包括药学相容的粘合剂和/或辅药作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可含有以下任一种成分或具有类似性质的化合物粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如藻酸，Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲基酯或橙味调味品。用于吸入施用时，化合物以气溶胶喷雾形式递送，气溶胶可由含合适抛射剂(例如，气体如二氧化碳)的加压容器或给药器(dispenser)或喷雾器产生。
全身施用也可通过经皮或经粘膜途径进行。对于经皮或经粘膜施用，可将对待渗透的屏障而言适宜的渗透剂用于制剂中。该渗透剂一般在本领域内公知，且包括如用于经粘膜施用的去污剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可通过应用鼻喷雾或栓剂完成。对于经皮施用，活性化合物的剂型可以为本领域内公知的软膏、油膏、凝胶或霜剂。
化合物也可以制备成栓剂(例如，应用常规栓剂基质，如可可油或其他甘油酯)或灌肠滞留剂形式直肠递送。
在一个特定实施方案中，活性化合物应用可以保护化合物避免其从体内被快速清除的载体进行配制，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以应用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。
用于制备这些制剂的方法对本领域内的技术人员而言是显而易见的。材料也可从供应商处获得，如Alza公司和Nova Pharmaceuticals，Inc.。也可用脂质体悬液(包括带有单克隆抗体靶向感染细胞的脂质体)作为可药用载体。这些可根据本领域内技术人员公知的方法制备，如参见美国专利号4,522,811中的描述。
配制单位剂量形式的口服或肠胃外用药组合物是特别有利的，这可以利于施用及剂量的一致性。此处应用的单位剂量形式指在物理上不连续的适用于作为单一剂量给予待治疗患者的单位；每一单位含预定量的活性化合物，该数量的活性化合物经计算与所需的药物载体联合可产生所需的治疗效应。根据疾病的类型及严重程度，施用给患者的起始候选剂量为约1μg/kg到15mg/kg(如0.1-20mg/kg)的化合物，无论是通过例如一次或多次单独施用或是通过连续输注。根据以上提及的因素，典型的每日剂量可为约1μg/kg到100mg/kg或更大。对于超过几天或更长时间的重复施用，根据疾病，治疗可持续进行直到获得了所需的对疾病症状的抑制。但是，也可以使用其他给药方案。治疗的进程由常规的技术和试验可以容易地进行监测。一示例性剂给药方案在WO 94/04188中公开。用于本发明单位剂量形式的规格决定于且直接取决于活性化合物的独特特性、待获得的具体治疗效果以及复合该活性化合物用于个体治疗时本领域所固有的限制。
此外，可将本发明的核酸分子插入载体并用作基因治疗载体。将基因治疗载体递送给患者可通过如静脉注射、局部施用(美国专利号5,328,470)或通过立体定位注射(例如参见，Chen等，美国国家科学院院刊(Proc NatlAcad USA)(1994)913054-3057)进行。基因治疗载体的药物制剂可以在可接受稀释剂中包括基因治疗载体；或可以包含其中埋植有基因递送工具的缓释基质。备选地，当整个基因递送载体可以从重组细胞中完整产生时，例如反转录病毒载体，药物制剂可包括一个或多个产生此基因递送系统的细胞。
药物组合物可与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器内。
本发明之用途及方法本发明的核酸分子、蛋白质、蛋白质同系物和抗体以及这些部分的片段可用于一种或多种以下的方法中a)筛选试验；b)检测试验(例如，染色体作图、组织分型、法医生物学)；c)预测医学(例如，诊断试验、预后试验、临床监测试验和药物基因组学)；和d)治疗方法(如治疗性和预防性的)。GAVE6蛋白质与其他细胞蛋白质相互作用，因此可用于(i)调节细胞增殖；(ii)调节细胞分化；和(iii)调节细胞存活。本发明的分离的核酸分子可用于表达GAVE6蛋白质(例如，在基因治疗应用中在宿主细胞中通过重组表达载体表达)，用于检测GAVE6 mRNA(如在生物样品中)或用于检测GAVE6基因中的遗传损伤以及用于调节GAVE6活性。此外，GAVE6蛋白质可用于筛选能调节GAVE6活性或表达的药物或化合物；以及用于治疗失调，所述失调的特征为GAVE6蛋白质产生不足或过量。应用本发明也可以针对与GAVE6野生型蛋白质相比活性降低或异常的GAVE6蛋白质形式的产生来进行筛选。此外，本发明抗-GAVE6抗体可用于检测和分离GAVE6蛋白质，以及用于调节GAVE6活性。本发明进一步涉及通过以上描述的筛选试验鉴定到的新型药剂，及其在此处描述的治疗中的用途。
筛选试验存在内源配体时激活G蛋白受体将允许G蛋白受体复合体形成，由此导致GTP结合G蛋白。G蛋白的GTPase结构域可以将GTP缓慢水解为GDP，在正常情况下导致受体失活。但组成型激活的受体会持续将GDP转变成GTP。
G蛋白的不可水解底物[35S]GTPγS可用于监测G蛋白与如下胞膜增强的结合作用，其中所述胞膜表达组成型激活的受体。Traynor和Nahorski报道，[35S]GTPγS可用于监测在存在和缺乏配体时与膜偶联的G蛋白(MolPharmacol(1995)47(4)848-54)。该试验系统优选用于候选化合物的起始筛选，因为该系统可通用于所有G蛋白偶联受体，而不必考虑与受体结合的具体G蛋白的种类。
Gs20刺激腺苷酰环化酶，而Gi和Go抑制该酶。如在本领域内所公知的，腺苷酰环化酶催化ATP向cAMP转化；因而，偶联Gs蛋白的组成型活化GPCR将与提高的cAMP细胞水平相关联。备选地，偶联Gi(或Go)蛋白的组成型活化GCPRs将与降低的cAMP细胞水平相关联，参见“突触传导的间接机制(Indirect Mechanism of Synaptic Transmission)”，第8章，从神经元到脑(3rdEd.)，Nichols等编，Sinauer Associates，Inc.，1992。因此，检测cAMP的试验可用于判定候选化合物是否为受体的逆向激动剂。本领域内已知的多种测定cAMP的方法均可以使用。在一个实施方案中，抗-cAMP抗体用于基于ELISA的试验中。在另一实施方案中，则考虑全细胞第二信使报告系统(见PCT公开号WO 00/22131)。
在一个相关的方面，环AMP通过促进cAMP效应DNA结合蛋白或转录因子(CREB)的结合而驱使基因表达，其中cAMP效应DNA结合蛋白或转录因子(CREB)然后在称为cAMP效应元件的特异性位点结合启动子并驱动基因表达。因此可构建这样的报告体系，其在报告基因如β-半乳糖苷酶或萤光素酶之前具有包含多个cAMP效应元件的启动子。进一步地，当组成型活化的Gs-连接受体引起cAMP的累积时，则可激活基因并表达报告蛋白。然后可用标准的生物化学试验检测报告蛋白如β-半乳糖苷酶或萤光素酶(PCT公开号WO 00/22131)。
其它G蛋白，如Go和Gq，与磷脂酶C的激活相关，所述磷脂酶又可水解磷脂PIP2释放出两个胞内信使甘油二酯(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3积聚的增加与Gq-相关受体和Go-相关受体的激活相关联(PCT公开号WO 00/22131)。检测IP3积聚的试验可用于判定候选化合物是否为Gq-相关受体或Go-相关受体的逆向激动剂。Gq-相关受体还可用AP1报告试验检测，该试验在于检测Gq-依赖的磷脂酶C是否引起了含AP1元件的基因的激活。这样，激活的Gq-相关受体将显示为该基因表达的增强，而逆向激动剂将显示为该表达的减弱。
本发明提供了用于鉴定调节剂的方法(此处也称作“筛选试验”)，所述调节剂即能结合GAVE6蛋白质或对例如GAVE6表达或GAVE6活性具有刺激或抑制效应的候选或测试化合物或试剂(例如，肽、肽模拟物(peptidomimetics)、小分子或其他药物)。
在一个实施方案中，本发明提供用于筛选如下候选或测试化合物的试验，所述化合物能结合膜结合形式的GAVE6蛋白质、多肽或其生物活性部分或调节其活性。本发明的测试化合物可应用众多手段之任一种在本领域内公知的组合文库方法中获得，包括生物文库；可空间寻址的平行固相或液相文库；需要去褶合(deconvolution)的合成文库方法；“单珠单化合物”文库方法；和应用亲和层析选择的合成文库方法。生物文库方法限于肽文库，而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库(Lam，抗癌药物研究(Anticancer Drug Des)(1997)12145)。
用于合成分子文库的方法的实例可在本领域内找到，例如DeWitt等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1993)906909；Erb等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1994)9111422；Zuckermann等，医学化学杂志(J Med Chem)(1994)372678；Cho等，科学(Science)(1993)2611303；Carrell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332059；Carell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332061和Gallop等，医学化学杂志(JMed Chem)(1994)371233。
化合物文库可呈现在溶液中(例如，Houghten Bio/Techniques(1992)13412-421)或珠子上(Lam，自然(Nature)(1991)35482-84)、芯片上(Fodor，自然(Nature)(1993)364555-556)、或细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(美国专利号5,571,698；5,403,484和5,223,409)、质粒(Cull等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1992)891865-1869)或噬菌体上(Scott等，科学(Science)(1990)249386-390；Devlin，科学(Science)(1990)249404-406；Cwirla等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)876378-6382；和Felici，分子生物学杂志(J Mol Biol)(1991)222301-310)。
在本发明的一个特定实施方案中，试验为基于细胞的试验，其中使细胞表面表达膜结合形式的GAVE6蛋白质(或其生物活性部分)的细胞与受试化合物接触，并测定受试化合物结合GAVE6蛋白质的能力。例如，细胞可为酵母细胞或哺乳动物来源的细胞。测试化合物与GAVE6蛋白质的结合能力的测定可以通过例如以下方式进行将测试化合物与放射性同位素或酶标记偶联，这样测试化合物与GAVE6蛋白质或其生物活性部分的结合可通过检测复合物中的标记化合物进行确定。例如，测试化合物可直接或间接标记125I、35S、14C或3H，放射性同位素的检测可通过直接计数放射量或通过闪烁计数进行。备选地，测试化合物可应用如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或萤光素酶进行酶标记，且酶标记的检测可通过测定适宜的底物向产物的转化来实现。
在特定的实施方案中，试验包括将在细胞表面表达膜结合形式的GAVE6蛋白质或其生物活性部分的细胞与可以结合GAVE6的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与GAVE6蛋白质相互作用的能力，其中对测试化合物与GAVE6蛋白质相互作用的能力的测定包括测定测试化合物与已知化合物相比优先与GAVE6或其生物活性部分结合的能力。
在另一实施方案中，试验为基于细胞的试验，包括使细胞表面表达膜结合形式的GAVE6蛋白质或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)GAVE6蛋白质或其生物活性部分的活性的能力。测试化合物调节GAVE6或其生物活性部分的活性的能力可通过，例如，测定GAVE6蛋白质结合GAVE6靶分子或与其相互作用的能力来确定。
如此处所用，“靶分子”是指天然与GAVE6蛋白质结合或作用的分子，如表达GAVE6蛋白质的细胞的表面分子、在第二细胞的表面上的分子、在细胞外周围区域中的分子、与胞膜内表面关联的分子或细胞质分子。GAVE6靶分子可以是非GAVE6分子或本发明的GAVE6蛋白质或多肽。在一个实施方案中，GAVE6靶分子为信号转导途径的成分，所述途径促进胞外信号(例如由化合物结合膜结合形式的GAVE6分子所产生的信号)通过胞膜向细胞内转导。例如，靶分子可为具有催化活性的第二胞内蛋白质或促进下游信号分子与GAVE6关联的蛋白质。
GAVE6蛋白质与GAVE6靶分子结合或作用的能力可通过以上描述的用于测定直接结合的其中一种方法来测定。在特定的实施方案中，GAVE6蛋白质与GAVE6靶分子结合或作用的能力可通过测定靶分子的活性来确定。靶分子活性的测定方法有例如检测靶分子对胞内第二信使(如胞内Ca2+、甘油二酯、IP3等)的诱导、检测靶分子对合适底物的催化/酶促活性、检测报告基因(例如可操作地连接编码可检测标记(如萤光素酶)的核酸的GAVE6效应调控元件)的诱导或检测细胞反应，例如细胞分化或细胞增殖。
本发明还涉及无细胞试验，包括将GAVE6蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触，并测定测试化合物结合GAVE6蛋白质或其生物活性部分的能力。测试化合物与GAVE6蛋白质的结合可以如以上所描述的方式直接或间接进行检测。在优选的实施方案中，试验包括将GAVE6蛋白质或其生物活性部分与能结合GAVE6的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与GAVE6蛋白质相互作用的能力，其中对测试化合物与GAVE6蛋白质相互作用的能力的测定包括测定测试化合物与已知化合物相比优先结合GAVE6或其生物活性部分的能力。
本发明的另一无细胞试验涉及将GAVE6蛋白质或其生物活性部分与测试化合物接触并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)GAVE6蛋白质或其生物活性部分的活性的能力。对测试化合物调节GAVE6的活性的能力的测定可通过，例如利用以上描述的用于测定直接结合的其中一种方法测定GAVE6蛋白质结合GAVE6靶分子的能力来实现。在备选的实施方案中，对测试化合物调节GAVE6活性的能力的测定可通过测定GAVE6蛋白质进一步调节GAVE6靶分子的能力来实现。例如，可以按前述测定靶分子对适当底物的催化/酶促活性。
本发明另一无细胞试验包括将GAVE6蛋白质或其生物活性部分与能结合GAVE6的已知化合物接触以形成试验混合物，将试验混合物与测试化合物接触并测定测试化合物与GAVE6蛋白质相互作用的能力，其中对测试化合物与GAVE6蛋白质相互作用的能力的测定包括测定GAVE6蛋白质优先结合GAVE6靶分子或调节GAVE6靶分子的活性的能力。
受体可由非配体分子激活，所述非配体分子并不一定抑制配体结合但可引起受体结构改变以致造成G蛋白结合或，可能的受体聚集、二聚化或簇集，从而引起激活作用。例如，可以针对暴露于细胞表面的GAVE6的多个部位产生抗体。如用标准试验(如监测cAMP水平或胞内Ca2+水平)所测定的，这些抗体可以通过G蛋白级联激活细胞。由于涉及分子作图，特别是表位作图，单克隆抗体可能是优选的。单克隆抗体可由表达于细胞表面的完整受体以及已知形成在细胞表面的肽引起。可应用Geysen等，美国专利号5,998,577的方法以获得大量的相关肽。所发现的可激活GAVE6的抗体可经过修饰以最小化与激活GAVE6无关的活性，如补体结合。这样，可对抗体分子实行截短或突变以使激活GAVE6以外的活性最小或丧失。例如，对某些抗体，仅需要抗原结合部分。这样，可去除抗体的Fc部分。
将表达GAVE6的细胞暴露于抗体以激活GAVE6。然后使激活的细胞暴露于多种分子以期鉴定出那些改变受体活性并导致更高激活水平或更低激活水平的分子。然后可对达此目的的分子在无抗体的情况下在表达GAVE6的细胞上进行试验，以观察对非激活细胞的效应。然后可以用公知的技术检测靶分子并将其修饰为候选药物，用于治疗与GAVE6代谢改变相关的失调。
本发明的无细胞试验适于应用可溶形式和膜结合形式的GAVE6。对于包括膜结合形式的GAVE6的无细胞试验，可能需要利用增溶剂以使膜结合形式的GAVE6维持在溶液中。该增溶剂的实例包括非离子去污剂，如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、Thesit、异三癸基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸。
在本发明以上试验方法的不止一个实施方案中，可能需要固定GAVE6或其靶分子以易于从非复合形式的一种或全部两种所述蛋白质中分离出复合形式，以及适于试验的自动化。在存在或缺乏候选化合物时测试化合物与GAVE6的结合或GAVE6与靶分子的相互作用可在任何适用于容纳反应物的容器内完成。该容器的实例包括微滴板、试管和微离心管。在一个实施方案中，可提供融合蛋白，该融合蛋白质添加有允许其中一种或全部两种上述蛋白质结合到基质上的结构域。例如可将谷胱甘肽-S-转移酶/GAVE6融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽Sephares珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上。备选地，将谷胱甘肽衍生的微滴板与测试化合物组合。接着，在利于形成复合物的条件下(例如在生理性盐和pH条件下)，孵育非吸附靶蛋白或GAVE6蛋白质及混合物。孵育后，洗涤珠子或微滴板孔以移去任何未结合成分，然后直接或间接地测定复合体的存在。备选地，可以使复合物与基质解离，且用标准技术测定GAVE6的结合或活性水平。
其他用于固定蛋白质于基质上的技术也可用于本发明的筛选试验。例如，可利用生物素和链霉亲和素的偶联固定GAVE6或其靶分子。生物素化的GAVE6或靶分子可应用本领域内公知的技术(如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)从生物素-NHS(N-羟基-丁二酰亚胺)制备产生，并固定在链霉亲和素包被的96孔板(Pierce Chemicals)的孔内。备选地，可使用与GAVE6或靶分子反应但不阻碍GAVE6蛋白质结合靶分子的抗体对平板的孔进行衍生。孵育后，通过抗体缀合，将未结合的靶标或GAVE6捕获在孔内。除了以上描述的用于检测GST-固定的复合物的方法外，用于检测复合物的方法还包括应用与GAVE6或靶分子反应的抗体对复合物进行的免疫检测以及依赖于检测与GAVE6或靶分子连结的酶促活性的酶联试验。
在另一实施方案中，GAVE6表达的调节剂可通过如下方法鉴定，其中，使细胞与候选化合物接触并测定胞内GAVE6 mRNA或蛋白质的表达。将存在候选化合物时GAVE6 mRNA或蛋白质的表达水平与缺乏候选化合物时GAVE6 mRNA或蛋白质的表达水平进行比较。然后，基于该比较，可以鉴定候选化合物是否为GAVE6表达的调节剂。例如，当GAVE6 mRNA或蛋白质在存在候选化合物时的表达大于(统计学显著大于)缺乏该化合物时的表达，则候选化合物被鉴定为GAVE6 mRNA或蛋白质表达的刺激剂或激动剂。备选地，当GAVE6 mRNA或蛋白质在存在候选化合物时的表达低于(统计学显著低于)缺乏该化合物时的表达，则候选化合物被鉴定为GAVE6 mRNA或蛋白质表达的抑制剂或拮抗剂。如果GAVE6活性在存在配体或激动剂时减少，或在组成型GAVE6的情况下低于基线，则候选化合物被鉴定为逆向激动剂。胞内GAVE6 mRNA或蛋白质的表达水平可由此处描述的用于检测GAVE6 mRNA或蛋白质的方法进行测定。
而在本发明另一方面，GAVE6蛋白质可在双杂交或三杂交试验中用作“诱饵蛋白”(例如参见美国专利号5,283,317；Zervos等，细胞(Cell)(1993)72223-232；Madura等，生物化学杂志(J Biol Chem)(1993)26812046-12054；Bartel等，Bio/Techniques(1993)14920-924；Iwabuchi等，癌基因(Oncogene)(1993)81693-1696；和PCT公开号WO 94/10300)，以鉴定其他与GAVE6结合或作用(“GAVE6结合蛋白”或“GAVE6-bp”)并调节GAVE6活性的蛋白质。该GAVE6-结合蛋白也可能通过GAVE6蛋白质作为如GAVE6途径的上游或下游元件参予信号传播。
由于本发明使得可以制备出大量的纯GAVE6，故可以确定出可能功能区域的构象的物理特征，用于合理的药物设计。例如，该分子的IC3区域和EC结构域为特别有意义的区域。一旦确定了区域的形状和离子构型，可与这些区域作用的候选药物即可成型，然后可以在完整细胞、动物和患者中进行试验。能够获得此3-D结构信息的方法包括X射线晶体学、NMR光谱学、分子模建等。3-D结构也可导致鉴定出其他已知蛋白中的类似构象位点，而对于所述蛋白已存在作用于此位点的已知药物。这些药物或其衍生物可能能用于GAVE6。
本发明还涉及由以上筛选试验鉴定到的新药剂，以及其在此处描述的治疗中的应用。
本发明之分析方法A.检测试验本发明DNA序列的部分或片段可在多个方面用作多核苷酸试剂。例如，序列可用于(i)在染色体上对相应的基因绘图并，由此定位与遗传疾病相关的基因区域；(ii)从微小量生物样品中对个体实施鉴定(组织分型)；和(iii)为生物样品的法医鉴定提供帮助。这些应用在以下的分段中描述。
1.染色体作图一旦分离出基因的序列(或序列的一部分)，则该序列可用于在染色体上作图定位GAVE6基因。因此，此处描述的GAVE6核酸分子或其片段可用于在基因组上作图定位GAVE6。基因组(尤其是人类基因组)上GAVE6序列的作图定位是确定序列与疾病相关基因的关系的重要第一步。
简言之，通过从GAVE6序列中制备PCR引物(优选的长度为15-25bp)，可以对GAVE6基因在基因组上作图。引物可用于包含单个人染色体的体细胞杂合体的PCR筛选。仅有包含与GAVE6序列对应的人类基因的那些杂合体能产生扩增片段。
通过融合不同哺乳动物来源的体细胞(例如，人和小鼠的细胞)制备体细胞杂合体。人和小鼠细胞的杂合体在生长和分裂时，一般人的染色体会出现随机丢失，而小鼠染色体保留。通过应用小鼠细胞(由于缺乏特定的酶)不能但人细胞可以在其中生长的培养基，含编码所需酶的基因的一条人染色体将得以保留。通过应用多种培养基，可以建立一组杂合细胞系。组内每一细胞系含单一的人染色体或小数目的人染色体及一整套鼠染色体，从而使得可以容易地将单独的基因作图定位于特定的人染色体上(D′Eustachio等，科学(Science)(1983)220919-924)。还可通过应用带有易位和缺失的人染色体制备仅含人染色体片段的体细胞杂合体。
体细胞杂合体的PCR作图是一种将特定序列定位于特定染色体上的快速方法。每台热循环仪每天可定位三段或更多的序列。用GAVE6序列设计寡核苷酸引物。可类似地用于将GAVE6序列作图定位到基因组特定染色体上的其他作图策略，包括原位杂交(描述于Fan等，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)876223-27)、用标记的流式分拣染色体预筛选和通过与染色体特异的cDNA文库杂交进行预选择。
可使用DNA序列与中期染色体铺展物的荧光原位杂交(FISH)一步提供精确的染色体定位。染色体铺展物的制备可应用被化学物阻滞在分裂中期的细胞进行，所述化学物如可破坏有丝分裂纺锤体的秋水仙碱。染色体可以用胰蛋白酶短暂处理然后进行Giemsa染色。每条染色体上会出现亮带和暗带图案，由此可鉴定出各染色体。FISH技术可应用500或600个碱基的DNA序列进行。但是，大于1,000个碱基的克隆更有可能结合独特的染色体位置并产生足够的信号强度以便简单检测。优选地1,000个碱基且更优选地2,000个碱基将足以在合理的时间内产生好的结果。参见Verma等的涉及该技术的综述(人类染色体基础操作手册(Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques)(Pergamon Press，New York，1988))。染色体作图可以在硅片上(in silico)考虑统计学因素，如优势对数得分或单纯接近度(mere proximity)进行推断。
用于染色体作图的试剂可单个应用以定位染色体上的单一位点。此外，可应用一组试剂标记多个位点和/或多条染色体。对作图目的，实际上优选对应于GAVE6基因两翼区域的试剂。编码序列在基因家族内更可能保守，因此增加了染色体作图中交叉杂交的机会。
一旦将序列绘制在精确的染色体位置，则可以将序列在染色体上的物理位置与遗传图谱数据联系起来(该数据存放在例如McKusick，人类的孟德尔遗传(Mendelian Inheritance in Man)中，可在线从Johns Hopkins大学的Welch医学图书馆获得)。然后，基因和绘图定位于同一染色体区域的疾病之间的关系，可通过连锁分析进行确定(物理上邻近的基因的共遗传)，如参见Egeland等，自然(Nature)(1987)325783-787中的描述。
此外，可测定受到或未受到GAVE6相关疾病影响的个体之间DNA序列的差异。如果在一些或全部的受影响个体中观察到突变而未在任何未受影响的个体中观察到此突变，则该突变可能为特定疾病的致病因子。对受到影响和未受到影响的个体的比较一般包括首先在染色体中寻找结构的改变，如缺失或易位，所述改变可在染色体铺展物中观察到或可应用基于该DNA序列的PCR检测到。最终，可对来自几个个体的基因进行完整测序，以证实突变的存在并将突变与多态性区分开来。
2.组织分型本发明的GAVE6序列也可用于从微小量的生物样品出发对个体进行鉴定。例如，美国部队正考虑将限制性片段长度多态性(RFLP)用于人员的鉴定。该技术中，用一种或多种限制性酶消化个体的基因组DNA，在Southern印迹中用探针探测以产生独特的条带用于鉴定。该方法避免了目前身份识别牌(Dog Tags)方法的局限性，所述局限性为可丢失、转换或被窃，这使得阳性鉴定变得困难。本发明的序列可用作RFLP的额外DNA标记(在美国专利号5,272,057中描述)。
此外，本发明的序列可用于提供备选的技术以逐个碱基确定个体基因组中选定部位的实际DNA序列。这样，此处描述的GAVE6序列可用于制备针对序列的5’和3′末端的两段PCR引物。然后可以使用引物扩增个体的DNA并随后提供其序列。
由此方式从个体得到的相应DNA序列组将提供独特的个体身份证明，这是因为由于等位基因的差异使得每一个体将具有独特的一套该DNA序列。可应用本发明的序列从个体和组织获得此身份证明序列。本发明的GAVE6序列是人类基因组中的一个独特部分。在该序列的编码区有一定程度的等位基因变异，且在非编码区有程度更高的变异。据估计人类个体间等位基因变异的频率为每500个碱基约发生一次。此处描述的每个序列均可在某种程度上作为标准，与来自个体的DNA比较用于鉴定的目的。由于非编码区有更多数目的多态性，故区分个体将必需较少的序列。应用一组约10到1,000个引物(每条引物产生100个碱基的非编码扩增序列)，SEQ ID NO1的非编码序列可提供阳性的个体鉴定。如果应用预测的编码序列如SEQ ID NO1中的那些，对于阳性个体鉴定，更为合适的引物数目将为500-2,000。
如果使用来自GAVE6序列的一组试剂(如此处所描述)来产生个体的独特身份证明数据库，则同样的试剂可随后用于鉴定来自该个体的组织。应用此独特身份证明数据库，可从极其少量的组织样品出发实现个体(存活的或死亡的)的阳性鉴定。
3.GAVE6部分序列在法医生物学中的应用基于DNA的鉴定技术也可用于法医生物学中。法医生物学为应用对犯罪现场发现的生物证据进行遗传分型来作为阳性鉴定(如犯罪者)手段的一个科学领域。为进行鉴定，可应用PCR技术扩增取自很少量生物样品的DNA序列，所述生物样品如发现于犯罪现场的组织(如头发或皮肤)或体液(如血液、唾液或精液)。然后可与标准品比较扩增序列，由此允许鉴定出生物样品的来源。
本发明的序列可用于提供可增加基于DNA的法医鉴定的可靠性多核苷酸试剂，如靶向人类基因组特定位点的PCR引物。例如，目的核酸可提供另一“鉴定标记”(即，特定个体所特有的另一DNA序列)。如以上提到的，实际的碱基序列信息可作为由限制性酶产生的片段图形的一个精确备选方案用于鉴定目的。靶向SEQ ID NO1非编码区的序列特别适用于此用途，因为该非编码区存在大量数目的多态性，从而提高了应用该技术区分个体的辨别力。多核苷酸试剂的实例包括GAVE6序列或其部分，例如来自SEQ ID NO1非编码区且长度为至少20到30个碱基的片段。
此处描述的GAVE6序列还可用于提供如下多核苷酸试剂，如被标记的探针或标记探针，所述试剂可用于如原位杂交技术中以鉴定特定的组织(如脑组织)。当提供给法医病理学家的是未知来源的组织时，这些多核苷酸试剂会十分有用。该GAVE6探针组可用于鉴定组织的物种和/或器官类型。
以类似的方式，诸如GAVE6引物或探针等试剂可用于筛选污染的组织培养物(即在培养物中甄别不同类型细胞混合物的存在)。
B.预测医学本发明也涉及预测医学领域，其中诊断试验、预后试验、药物基因组学和临床监测试验被用于预后(预测性)目的以预防性治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及诊断试验，该试验用于在生物样品(如血、尿、粪、痰、血清、细胞和组织)环境中测定GAVE6蛋白质和/或核酸的表达以及GAVE6的活性。可应用此试验确定个体是否患有与异常GAVE6表达或活性相关的疾病或失调或存在疾病发生危险性。
本发明也提供预后(或预测性)试验，以确定个体是否存在罹患与GAVE6蛋白质、核酸表达或活性相关的失调的危险。例如，可以在生物样品中测试GAVE6基因中的突变。该试验可用于预后或预测性的目的，由此可以在以GAVE6蛋白质、核酸的表达或活性为特征或与其相关的失调发作之前预防性治疗个体。
本发明另一方面提供了用于测定个体的GAVE6蛋白质、核酸的表达或GAVE6的活性以便由此选择合适的治疗性或预防性药剂用于该个体的方法(此处称为“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型(如检查个体基因型以判定个体对特定药剂的反应能力)选择药剂(如药物)用于治疗性或预防性治疗个体。
而在本发明另外的方面，涉及到在临床试验中监测药剂(如药物或其他化合物)对GAVE6表达或活性的影响。
这些以及其他的药剂在以下的部分中作进一步详细描述。
1.诊断试验用于检测生物样品中GAVE6存在与否的示例性方法包括从受试对象中获得生物样品，并将生物样品与可检测GAVE6蛋白质或编码GAVE6蛋白质的核酸(如mRNA或基因组DNA)的化合物或试剂接触，以检测生物样品中GAVE6的存在。用于检测GAVE6 mRNA或基因组DNA的优选试剂为能够与GAVE6 mRNA或基因组DNA杂交的标记核酸探针。核酸探针可为，例如全长GAVE6核酸，如SEQ ID NO1的核酸或其部分，如长度为至少15、30、50、100、250、500或更多个核苷酸并且足于在严紧的条件下特异杂交到GAVE6 mRNA或基因组DNA上的寡核苷酸。可用于本发明诊断试验的其它合适探针在本文中有描述。
用于检测GAVE6蛋白质的一个特定试剂为能够结合GAVE6蛋白质的抗体，优选地为带有可检测标记的抗体。抗体可为多克隆的、嵌合的或更优选地为单克隆的。可应用完整的抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。术语“生物样品”意在包括从受试对象分离的组织、细胞和生物液体，以及存在于受试对象体内的组织、细胞和液体。即，本发明的检测方法可用于在体外及体内检测生物样品中的GAVE6 mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于体外检测GAVE6 mRNA的技术包括Northern杂交和原位杂交。用于在体外检测GAVE6蛋白质的技术包括ELISA、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于体外检测GAVE6基因组DNA的技术包括Southern杂交。此外，用于体内检测GAVE6蛋白质的技术包括向受试者体内导入标记的抗-GAVE6抗体。例如，可给抗体标记上放射活性标记物，其在受试者体内的存在和部位可通过标准成象技术检测。
在一个实施方案中，生物样品含有来自受试对象的蛋白质分子。或者，生物样品可以含有来自受试对象的mRNA分子或来自受试对象的基因组DNA分子。可以应用于此处的一个特定的生物样品是利用常规手段从受试对象分离到的外周血白细胞样品。
因此，在开发预后或诊断实验时，将鉴定核酸或蛋白质的多态性与疾病联系起来用于诊断携带者或患者可能是有益的。例如，对于类风湿性关节炎、哮喘、节段性回肠炎等，具有预后或诊断试验将是有益的。在与活化或发炎状态相关的细胞中，GAVE6表达提升。与发炎相关的失调症包括，过敏状态、结肠炎、节段性回肠炎、水肿状态、接触性过敏、过敏症、其它形式之关节炎、脑膜炎及免疫系统藉由血管扩张、发热、聚集细胞、体液等对刺激产生反应而造成刺激部位肿胀等之其它状况。因此，GAVE6代谢的失调可以用于诊断类风湿性关节炎。而且，类风湿性关节炎的分子机制可能是可检测的，例如，可能存在可以在组织样品(如血液样品)中进行检测的诊断性SNP、RFLP、表达水平的变化性、功能的变化性等等。
在另一实施方案中，这些方法还包括从对照受试者获得生物样品；使对照样品与能够检测GAVE6蛋白质、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，以便检测生物样品中GAVE蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和数量；和将对照样品中GAVE6蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和数量与测试样品中GAVE6蛋白质、mRNA或基因组DNA的存在和数量进行比较。
高通量筛选化学文库能调节GAVE6活性的化合物之任何分析法均经得起实施高通量筛选。高通量筛选系统为市售可得[参见，例如，Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；Beckman Instruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等]。这些系统典型地使整个程序自动化，包括适用于该分析法的所有样品与试剂的吸取、液体的分配、定时孵育、及检测器中微量培养板之最后读取。这些可配置系统提供了高通量及迅速的启动，以及高度灵活性与使用者自定性。这些系统之厂商提供了有关多种高通量操作之详细方案。举例而言，Zymark Corp.提供了叙述用于检测基因转录调节、配体结合等的筛选系统之技术公报。
试剂盒本发明还包括检测生物样品(测试样品)中GAVE6存在的试剂盒。该试剂盒可以用于确定受试者是否患有或有增加的危险性患有与GAVE6异常表达相关的疾病(例如免疫学失调)。例如，该试剂盒可以包含能够检测生物样品中的GAVE6蛋白质或mRNA的标记化合物或试剂以及用于检测样品中GAVE6数量的手段(例如，抗GAVE6抗体或能与GAVE6的编码DNA(例如SEQ ID NO1)结合的寡核苷酸探针)。当GAVE6蛋白质或mRNA的数量高于或低于正常水平时，试剂盒还可以用于得出指示受试对象是否患者或有危险患有与GAVE6异常表达相关的疾病的结果。
对于基于抗体的试剂盒，其可以包含例如(1)可与GAVE6蛋白质结合的第一抗体(例如附着在固相支持物上)；和，任选地，(2)可与GAVE6蛋白质或与第一抗体结合并缀合有可检测试剂的第二不同抗体。如果不存在第二抗体，则可以可检测地标记第一抗体，或者对能与第一抗体结合的另一分子进行可检测的标记。正如本领域已知的，无论如何都应包括已标记的结合部分以充当可检测报道分子。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，本发明的试剂盒可以包含，例如(1)可与GAVE6核酸序列杂交的寡核苷酸，例如可检测标记的寡核苷酸或(2)可用于扩增GAVE6核酸分子的引物对。
试剂盒还可以包含例如缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包含在探测可检测试剂(例如酶或底物)时所必需的成分。试剂盒还可以含有可以进行分析和与测试样品进行比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的每一个成分通常装在不同的容器中，并且所有这些不同容器被放在一个包装中。此外，还可以将与用于观察受试对象是否患有或有危险患有GAVE6表达异常相关疾病的说明书放在包装中。
2.预后实验本文中所描述的方法可进一步用作诊断或者预后试验以鉴定受试者是否患有或有危险患有与异常GAVE6表达或活性相关的疾病或病症。例如，本文中所描述的试验，例如前瞻性诊断试验或后随试验，可用于鉴定患有或者有危险患有与GAVE6蛋白、核酸的表达或活性相关的病症的受试者。例如，近来与细菌的接触或与哮喘、慢性阻塞性肺病和类风湿性关节炎相关的炎症易于用这个实验来检验。作为一种备选方案，可以使用预后试验鉴定患有或有危险患有此疾病或病症的受试者。
因此，本发明提供了一个方法，其中从受试者获得测试样品，并检测GAVE6蛋白或核酸(例如mRNA或基因组DNA)。GAVE6蛋白或核酸的存在可以用于诊断患有或有危险患有与异常GAVE6表达或活性相关的疾病或病症的受试者。本文中所用的“测试样品”指来自目的受试者的生物样品。例如，测试样品可以是生物液体(例如血清)、细胞样品或组织。
此外，此处所描述的预后试验可用于判定能否给受试者施用药剂(例如，激动剂，拮抗剂，肽模拟物，蛋白质，肽，核酸，小分子或其他候选药物)以治疗与异常GAVE6表达或活性相关的疾病或病症。例如，这些方法可用于判定特定药剂或药剂类(例如降低GAVE6活性的药剂类)能否有效的治疗受试者。因此，本发明提供了一种方法，由此可以判定药剂是否能有效地治疗患者的与异常GAVE6表达或活性相关的病症，其中获取测试样品，并检测GAVE6蛋白或核酸(例如，其中，GAVE6蛋白或核酸的存在可以用于诊断受试者是否可以通过给予药剂治疗与异常GAVE6表达或活性相关的病症)。
本发明的方法还可用于检测GAVE6基因的遗传损伤或者突变，由此确定带有损伤基因的受试者是否有出现如下病症的危险性，所述病症的特征在于异常细胞增殖和/或分化。在优选实施方案中，此方法包括在来自受试者的细胞样品中检测如下遗传损伤或突变存在与否，所述损伤或突变的特征在于存在至少一个影响编码GAVE6蛋白的基因的完整性的改变或者造成GAVE6基因错误表达的改变。例如，这些遗传损伤或突变可以通过确定至少一种如下情况的存在来检测1)GAVE6基因中一个或多个核苷酸的缺失；2)GAVE6基因中一个或多个核苷酸的增加；3)GAVE6基因中一个或多个核苷酸的替换；4)涉及GAVE6基因的染色体重排；5)GAVE6基因的信使RNA转录本水平的改变；6)GAVE6基因的异常修饰，例如基因组DNA的甲基化模式的异常改变；7)GAVE6蛋白的非野生型水平；8)GAVE6基因的等位基因丢失；9)GAVE6蛋白的不恰当的翻译后修饰。
如本文所述，在本领域中有大量已知的实验技术可用于检测GAVE6基因中的损伤。优选的生物样品是用常规方法从受试者分离得到的外周血白细胞样品。
在某些实施方案中，损伤的检测涉及在聚合酶链式反应(PCR)(见，例如美国专利号4,683,195和4,683,202)，例如锚定PCR或RACE PCR中，或者，作为一种选择，在连接链式反应(LCR)(见，例如Landegran等，科学(Science)(1988)2411077-1080；和Nakazawa等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1994)91360-364)中使用探针/引物，其中后者在检测GAVE6基因中的点突变时尤其有用(见，例如Abravaya等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1995)23675-682)。该方法可以包括如下步骤从患者收集细胞样品，分离样品细胞的核酸(例如，基因组核酸，mRNA或者两者)，在一定条件下使核酸样品与一个或多个可与GAVE6基因特异杂交的引物接触以实现GAVE6基因(如果存在的话)的杂交和扩增，然后检测扩增产物的存在与否或者检测扩增产物的大小并将此长度与对照样品比较。预期可能有利的是将PCR和/或LCR用作初始扩增步骤与本文中描述的用于检测突变的任何技术相结合。
可选择的扩增方法包括自动维持序列扩增(Guatelli等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1990)871874-1878)，转录扩增系统(Kwoh等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)861173-1177)，Q-β复制酶(Lizardi等，Bio/Technology(1988)61197)或任何其他核酸扩增方法，之后可以用本领域技术人员已知的技术检测扩增的分子。这些检测方案对检测以非常低数量存在的核酸分子尤其有用。
在一个备选实施方案中，样品细胞中GAVE6基因的突变可以通过限制性酶切割带型的改变而得以鉴定。例如，可以分离样品和对照DNA，进行扩增(任选地)，用一种或多种限制性内切酶消化，通过凝胶电泳来测定片段的长度尺寸并进行对比。在样品与对照DNA之间片段长度的差异指示出样品DNA中有突变。另外，序列特异的核酶(见，例如美国专利号5,498,531)也可以用于通过核酶酶切位点的产生或丢失评判特异突变的存在。
在其他实施方案中，可通过样品和对照核酸(例如DNA或RNA)与含有成百或上千的寡核苷酸探针的高密度阵列(Cronin等，HumanMutation(1996)7244-255；Kozal等，自然医药(Nature Medicine)(1996)2753-759)杂交的方法来鉴定GAVE6的遗传突变。例如，GAVE6的遗传突变可以用含有发光DNA探针的二维阵列来鉴定，参见如Cronin等，同上。简言之，第一杂交探针阵列可用于对样品和对照中的长链DNA进行扫描，通过产生顺序重叠探针线性阵列来鉴定两序列间的碱基改变。该步骤允许鉴定点突变。这个步骤之后为第二杂交阵列，它通过使用能与所有检测的变体或突变体互补的较小特异化探针的阵列，可以对具体突变进行表征。每个突变阵列都由平行探针组构成，一个与野生型基因互补而另一个与突变基因互补。
又在另一个实施方案中，本领域已知的任何一种测序反应都可用于直接地对GAVE6基因测序，以及通过样品GAVE6序列与相应野生型(对照)序列的比较来检测突变。测序反应的实例包括以Maxam和Gilbert(美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1977)74560)或者Sanger(美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1977)745463)开发的技术为基础的那些反应。也可以考虑利用任何一种自动测序方法实施诊断试验(Bio/Techniques(1995)19448)，包括用质谱进行测序(见，例如，PCT公开号WO 94/16101；Cohen等，Adv Chromatogr(1996)36127-162；和Griffin等，应用生物化学与生物技术(Appl BiochemBiotechnol)(1993)38147-159)。
其他可用于检测GAVE6基因中的突变的方法包括如下方法，在该方法中通过保护作用防止切割剂的切割，得以检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中的碱基错配(Myers等，科学(Science)(1985)2301242)。一般，“错配切割”技术中必须提供由含有野生型GAVE6序列的(标记的)RNA或DNA与获自组织样品的潜在突变RNA或DNA杂交形成的异源双链体。用切割双链体中的单链区域的试剂处理此双链体，所述双链体中的单链区域可以因为例如对照与样品链之间的碱基对错配而存在。RNA/DNA双链体可以用RNAase来处理以消化错配区域，DNA/DNA杂合体可以用S1核酸酶来处理以消化错配区域。在其他实施方案中，DNA/DNA或者RNA/DNA双链体可以用羟胺或锇酸及哌啶来处理以消化错配区域。消化错配区域之后，所得物质在变性聚丙烯酰胺凝胶上根据大小分离，从而确定出突变的位点，参见例如Cotton等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1988)854397；Saleeba等，酶学方法(Methods Enzymol)(1992)217286-295。在优选实施方案中，可以标记对照DNA或RNA以利于检测。
在另一个实施方案中，错配切割反应使用一个或多个能识别双链DNA中错配碱基对的蛋白(所谓的“DNA错配修复酶”)在规定系统中检测从样品细胞获得的GAVE6 cDNA中的点突变并对其作图。例如，大肠杆菌的mutY酶切割G/A错配处的A，来自Hela细胞的胸苷DNA糖基化酶切割G/T错配处的T(Hsu等，Carcinogenesis(1994)151657-1662)。根据一个示范实施方案，基于GAVE6序列(例如野生型GAVE6序列)的探针与来自测试细胞的cDNA或其他DNA产物杂交。用DNA错配修复酶处理双链，切割产物(如果有的话)可以在电泳方案或类似的方案中检测到，参见，例如美国专利号5,459,039。
在其他实施方案中，可以使用电泳迁移率的改变鉴定GAVE6基因中的突变。例如，单链构象多态性(SSCP)可用于检测突变与野生型核酸之间电泳迁移率的差异(Orita等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad SciUSA)(1989)862766；也见Cotton，突变研究(Mutat Res)(1993)285125-144；Hayashi，Genet Anal Tech Appl(1992)973-79)。使样品和对照GAVE6核酸的单链DNA片段变性然后使之复性。单链核酸的二级结构会因序列不同而不同，由此导致的电泳迁移率的改变使得即使单个碱基变化也可得以检测。可以标记DNA片段或者用标记的探针对其进行检测。使用RNA(比DNA)可以增强试验的灵敏度，因为RNA二级结构对序列的改变更为敏感。在一个优选实施方案中，此主题方法利用异源双链分析基于电泳迁移率的改变来分离异源双链分子。(Keen等，Trends Genet(1991)75)在另一个实施方案中，用变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Myers等，自然(Nature)(1985)313495)来分析突变型或野生型片段在含有梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中的运动。当DGGE用作分析方法时，DNA将被修饰以保证它不会完全变性，例如，用PCR添加约40bp的高熔点富含GC的DNA，即GC夹。在另一个实施方案中，用温度梯度代替变性梯度来鉴定对照与样品DNA的迁移率差异(Rosenbaum等，Biophys Chem(1987)26512753)。
其他可用于检测点突变的技术的实例包括但不限于，选择性寡核苷酸杂交，选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可以制备寡核苷酸引物，其中将已知的突变置于中央，然后在只有完全匹配才可发生杂交的条件下，使引物与靶DNA杂交(Saiki等，自然(Nature)(1986)324163；Saiki等，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci USA)(1989)866230)。在使这些等位特异性寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA或者许多不同的突变体杂交时，可以将寡核苷酸结合在杂交膜上然后与标记的靶DNA杂交。
或者，可以在本发明中使用依赖于选择性PCR扩增的等位特异性扩增技术。在特异扩增中用作引物的寡核苷酸可以在分子中央(以致扩增依赖于差异杂交)(Gibbs等，核酸研究(Nucleic Acids Res)(1989)172437-2448)或在一个引物的3’最末端(此时，在适合的条件下，错配能阻止或减少聚合酶的延伸)(Prossner，Tibtech(1993)11238)携带令人感兴趣的突变。另外，也可能期望向突变区域中引入新的限制性位点以创造基于切割的检测(Gasparini等，Mol Cell Probes(1992)61)。预期，在某些实施方案中扩增也可以使用扩增用Taq连接酶进行(Barany，美国国家科学院院报(ProcNatl Acad Sci USA)(1991)88189)。在这种情况下，只有在5’序列的3’末端有完全的匹配时，连接反应才可以发生，这就使得可以通过寻找扩增物的有无来检测特异位点处已知突变的存在。
此处所描述的方法可以，例如，使用含有至少一种此处所描述的探针核酸或抗体试剂的预包装诊断试剂盒来执行。此方法和试剂盒可以方便的应用于，例如，临床条件下，对显示出GAVE6基因相关疾病或病症的症状的患者或具有该疾病家族史的患者进行诊断。
另外，表达GAVE6的任何细胞类型和组织都可以在此处所描述的预后试验中使用。
3.药物基因组学通过本文描述的筛选试验鉴定的对GAVE6活性(例如GAVE6基因表达)具有刺激或抑制影响的试剂或调节剂，可以施用给个体以治疗(预防性或治疗性)与GAVE6活性相关的疾病(例如，与哮喘、慢性阻塞性肺病和类风湿性关节炎相关的炎症)。可以考虑将此治疗与个体的药物基因组学结合起来，所述药物基因组学研究的是个体基因型与个体对外来化合物或药物的反应性之间的关系。治疗物代谢差异可以通过改变药理学活性药物的血液浓度和剂量之间的关系，导致严重毒性或治疗失败。因此，个体的药物基因组学使得可以基于对个体基因型的考虑来选择有效的预防或治疗剂(例如药物)。此药物基因组学还可以用于确定适当的剂量和治疗方案。因此，可以通过确定个体的GAVE6蛋白质的活性、GAVE6核酸的表达或GAVE6基因的突变内容，选择对个体适宜的治疗或预防药剂。
药物基因组学所处理的问题是患者在药物应答方面存在的临床显著遗传差异，这种差异是由患者体内药物处置的不同和异常作用导致的。见，例如，Linder，临床化学(Clin Chem)(1997)43(2)254-266。一般，可以区分两类药理学遗传情况(pharmacogenetic conditions)。作为能改变药物作用于身体的途径的单因素而传递的遗传情况，称作“改变的药物作用”。作为能改变身体对药物的作用途径的单因素而传递的遗传情况，称作“改变的药物代谢”。这些药理学遗传情况可以以罕见缺陷或多态性的形式存在。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺陷是常见的遗传酶病，其中主要的临床并发症是吞食氧化剂药物(抗疟疾药物、磺酰胺、止痛剂或硝基呋喃)和食用蚕豆后出现的溶血。
作为举例说明性实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和持续时间的一个主要决定因素。对药物代谢酶(例如N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶，CYP2D6和CYP2Cl 9)遗传多态性的发现解释了，为什么服用标准和安全药物剂量后，一些患者不能获得预期的药物效果或表现出过度的药物反应和严重毒性。在群体中这些多态性表现为两种表型，泛代谢者(extensive metabolizer，EM)和不良代谢者(PM)。PM的普遍性在不同群体之间是不同的。例如，编码CYP2D6的基因具有高度多态性，在PM中已鉴定到几种突变，所有均导致CYP2D6功能的缺乏。CYP2D6和CYP2Cl 9的不良代谢者在接受标准剂量后十分频繁地出现过度药物反应和副反应。正如通过可待因的止痛作用(由CYP2D6形成的代谢物吗啡介导的)所证实的，如果代谢物是活性治疗部分，则PM将不会表现出治疗反应。另一极端是对标准剂量不起反应的所谓超快代谢者。近来，超快代谢的分子基础已得以鉴定，其是由CYP2D6基因扩增导致的。
因此，通过确定个体中GAVE6蛋白质的活性、GAVE6核酸的表达或GAVE6基因的突变内容，可以选择出用预防或治疗个体时适宜的药剂。此外，可以使用药物基因组学研究，通过对编码药物代谢酶的多态性等位基因进行基因分型鉴定个体的药物应答表型。当使用GAVE6调节剂(如，通过本文所述其中一种示例性筛选试验鉴定的调节剂)治疗对象时，在给药或选择药物方面，此信息可以避免不良反应或治疗失败，由此增强治疗或预防的功效。
4.在临床试验过程中监测疗效监测药剂(例如，药物或化合物)对GAVE6表达或活性的影响(例如，调节异常细胞增殖和/或分化的能力)既可以应用于基础药物筛选中也可以应用于临床试验中。例如，可以在表现出降低的GAVE6基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性的对象的临床试验中，监测药剂(通过本文描述的筛选试验确定的)在增加GAVE6基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性方面的有效性。或者，可以在表现出增加的GAVE6基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性的对象的临床试验中，监测药剂(通过本文描述的筛选试验确定的)在降低GAVE6基因表达、蛋白质水平或蛋白质活性方面的有效性。在这些临床试验中，GAVE6的表达或活性以及，优选地，其它基因的表达或活性(例如，细胞增殖疾病所涉及的基因)可以用作特定细胞的免疫应答性的标记物。
例如，但不限于，可以鉴定当用调节GAVE6活性的药剂(例如，化合物、药物或小分子)(例如，本文所述筛选试验鉴定的药剂)处理时细胞中可以被调节的基因(包括GAVE6)。因此，例如，在临床试验中，为了研究药剂对细胞增殖疾病的作用，可以分离细胞，制备RNA并分析GAVE6及参与该疾病的其它基因的表达水平。基因表达水平(即，基因表达式样)可以通过如下方式定量按本文所述进行Northern印迹分析或RT-PCR，或者，作为备选方案，利用本文所述方法之一测量产生的蛋白质的量或测量GAVE6或其它基因的活性水平。以此方式，基因表达式样可以作为标记物指示细胞对药剂的生理反应。由此，可以在使用药剂治疗个体之前以及治疗过程中的不同点上，确定反应状态。
在一个特定的实施方案中，本发明提供了一种方法，由此可以监测使用药剂(例如，通过本文所述筛选试验鉴定的激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其它候选药物)治疗受试者的疗效，该方法包括步骤(i)在施用药剂前从受试者获得用药前样品；(ii)检测用药前样品中GAVE6蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)从受试者获得一个或多个用药后样品；(iv)检测用药后样品中GAVE6蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平；(v)对用药前样品中GAVE6蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平与一个或多个用药后样品中GAVE6蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达或活性水平进行比较；和(vi)据此改变患者的药剂施用方案。例如，可能期望增加药剂施用以增加GAVE6的表达或活性水平，使之超过所检测到的水平，即，增加药剂的效力。或者，可能期望降低药剂施用以降低GAVE6的表达或活性水平，使之低于所检测到的水平，即，降低药剂的效力。
D.治疗方法本发明为有危险患有(或易感)或已患有与异常GAVE6表达或活性相关的疾病的患者提供了预防和治疗方法。所述疾病包括，但不限于，例如与哮喘、慢性阻塞性肺病及风湿性关节炎相关之炎症。
1.预防方法一方面，本发明提供预防方法，该方法通过给受试者施用调节GAVE6表达或至少一种GAVE6活性的药剂，预防受试者患上与异常GAVE6表达或活性相关的疾病或病症。可以通过，例如，本文所述任一种诊断或预后试验或其组合，鉴定个体是否有危险罹患可由异常GAVE6表达或活性引起的或促成的疾病。可以在以GAVE6异常为特征的症状显现之前施用预防剂，以便预防疾病或病症，或作为备选方案阻滞疾病或病症的进程。例如，根据GAVE6异常的类型，可以使用GAVE6激动剂或GAVE6拮抗剂治疗个体。适宜的药剂可以根据本文所述筛选试验确定。
2.治疗方法本发明另一方面涉及调节GAVE6表达或活性用于治疗目的的方法。本发明的调节方法涉及使细胞与能调节和细胞相关的一种或多种GAVE6蛋白质活性的药剂接触。能够调节GAVE6蛋白质活性的药剂可以是本文所述的药剂，例如核酸或蛋白质、GAVE6蛋白质的天然关联配体、肽、GAVE6肽模拟物或其它小分子。在一个实施方案中，该药剂刺激GAVE6蛋白质的一种或多种生物学活性。此刺激剂的实例包括活性GAVE6蛋白质和已导入细胞中的编码GAVE6的核酸分子。在另一实施方案中，该药剂抑制GAVE6蛋白质的一种或多种生物学活性。此抑制剂的实例包括反义GAVE6核酸分子和抗GAVE6抗体。可以体外(例如，通过使用药剂培养细胞)或，作为备选方案，体内(例如，通过向患者施用药剂)执行此调节方法。由此，本发明提供治疗罹患疾病或病症(其特征在于GAVE6蛋白质或核酸分子的异常表达或活性)的个体的方法。在一个实施方案中，本方法涉及施用可调节(例如，上调或下调)GAVE6表达或活性的药剂(例如，通过本文所述筛选试验鉴定的药剂)或药剂组合。在另一实施方案中，本方法涉及施用GAVE6蛋白质或核酸分子作为治疗物以弥补降低的或异常的GAVE6表达或活性。
当GAVE6被异常下调和/或当增加的GAVE6活性可能具有有益作用时，刺激GAVE6活性是有利的。相反，当GAVE6被异常上调和/或当降低的GAVE6活性可能具有有益作用时，抑制GAVE6活性是有利的。
参照下文提供作为本发明范例之非限制实施例，可更了解本发明。下文呈现之实施例系为了对本发明之优选具体实施方案作更完整之举例说明，而决不拟对本发明之宽广范围构成限制。
实施例材料与方法GAVE6之鉴定-以各种GPCR为查询标题，使用FASTA算法(Wisconsin GCG Package Version 10.1)在人类基因组序列数据库HTG(NCBI/NIH)中进行同源物搜寻。将返回的具有统计显著性之基因组DNA序列翻译成供蛋白质数据库之BLASTp搜寻的三个正向读框(forwardframes)。鉴定出基因组DNA序列AC013396，其含有推定之GPCR序列，将其命名为GAVE6。GAVE6染色体位置定位于2p22.1。
编码GAVE6的基因组DNA之克隆-设计对该预测GAVE6之5’与3’序列具特异性之引物。以人类基因组DNA作为模板，经由聚合酶链式反应(PCR)，使用正向引物HP157，CAG CCC ATG GAA CTT CAT AACCTG(SEQ ID NO5)，及反向引物HP158，CTG GCC CTC AGC CCTGGG AGG AG(SEQ ID NO6)扩增GAVE6基因组DNA。PCR条件如下于94℃变性30秒，于55℃退火30秒，及于72℃延伸1分钟，进行35个循环，随后于72℃延伸5分钟。将扩增之DNA片段克隆入pCRII-TOPO载体(得自Invitrogen)中。利用DNA测序法证实该克隆之DNA插入物。所有PCR扩增反应均于DNA Engine Tetrad(MJ Research，型号PTC-225)中进行。
Northern印迹分析-根据厂商说明书，以[α-32P]dCTP标记的全长开放读框DNA片段和人类多组织Northern印迹(得自Clontech)杂交。杂交印迹以2XSSPE和0.1％ SDS于50℃洗涤30分钟，并以0.1XSSPE和0.1％ SDS于50℃洗涤1小时。然后于增感屏存在下，于-70℃，使该印迹暴露于X光片。此Northern印迹分析结果示于图4。
Taqman分析-自Clontech购买得自人类组织之总RNA。于产生cDNA之前，使总RNA进行DNAse1处理，以避免潜在的基因组DNA污染。简言之，使总RNA与5微升10x DNAseI缓冲液[20mM Hepes pH 7.5；10mM CaCl2；10mM MgCl2；1mM DTT与50％(v/v)甘油](Ambion)、RNAse抑制剂及1微升DNAseI(不含RNase)(2U/微升；Ambion)混合，最终体积50微升，于37℃ 1小时。经苯酚沉淀步骤之后，使用Superscript选择系统，如Life Technologies所述进行cDNA之合成。使用PrimerExpress 1.0软件(ABI)设计Taqman引物/探针。GAVE6之Taqman正向引物为5’GCT GCC TGC AAA GTC AAC CT 3’(SEQ ID NO7)、反向引物为5’TGG CTG TGA GGA AGA CAA CG 3’(SEQ ID NO8)及Taqman探针序列5’FAM-CCA CCA ACC GCA CGG CAA-TAMRA3’(SEQ ID NO9)。使用Fam作为报道染料，Tamra作为淬灭剂(quencher)。向Operon Technologies订制合成Taqman探针。于96孔板MicroAmp光学管(PE)中进行Taqman反应，最终体积50微升，含下述成分25微升Taqman PCR混合物(Perkin Elmer)；1微升正向引物，最终浓度900nM；1微升反向引物，最终浓度900nM；及1微升Taqman探针，最终浓度200nM；5微升cDNA模板(计算浓度10纳克/微升)及17微升水。Taqman PCR条件如PE Applied Biosystem所述执行。使用人类β肌动蛋白引物探针(由PE Applied Biosystem设计及贩售)作为内对照。各组织针对靶基因及内对照进行二次重复的Taqman反应。此外，重复二次使用增量模板，产生人类β肌动蛋白于总的脑cDNA中之标准曲线，由此得以获得所扩增的扩增子之相对数量。靶基因之表达相对于脑cDNA以相对倍数表达量表示。Taqman分析所得数据示于下文表1及图5。
表1
cDNA文库之PCR筛选-使用对GAVE6编码区域具特异性之PCR引物5’TTC CTC CTG ATC AGC AAC CT 3’(SEQ ID NO10)、及5’TTGGTG GAC AGC ATG AAG AG 3’(SEQ ID NO11)筛选合并的人类脾、脑、肾、活化T细胞、及肺cDNA文库。使用下述PCR实验流程于96孔板中进行PCR筛选94℃，保持3分钟；94℃ 30秒、52℃ 30秒、及68℃ 45秒进行40个循环。接着稀释阳性亚池(positive subpools)，供下一回合PCR筛选之用。于琼脂板上平板培养得自阳性亚池之有限数量的菌落，利用PCR证实阳性质粒，并进行DNA测序分析。
本发明之范围不受限于本文所述之特定实施方案。事实上，从前文说明及附图，本文所述以外的本发明之各种修饰将为本领域技术人员所显见。该修饰意欲包含于随附权利要求的范围之内。
进一步应了解，给予核酸或多肽的所有碱基大小或氨基酸大小，及所有分子量或分子质量值为近似值，其提供系作为描述之用。
在此引用各出版物，其全部内容均并入本文以资参考。
序列表<110>安万特药物公司<120>编码G-蛋白质-偶联之受体的核酸及其用途<130>USAV2001/0054 US NP<140>10/348,083<141>2002-01-23<150>US60/351,006<151>2002-01-23<150>GB0210597.1<151>2002-05-09<160>11<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1155<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>1atggaacttc ataacctgag ctctccatct ccctctctct cctcctctgt tctccctccc 60tccttctctc cctcaccctc ctctgctccc tctgccttta ccactgtggg ggggtcctct 120ggagggccct gccaccccac ctcttcctcg ctggtgtctg ccttcctggc accaatcctg 180gccctggagt ttgtcctggg cctggtgggg aacagtttgg ccctcttcat cttctgcatc 240cacacgcggc cctggacctc caacacggtg ttcctggtca gcctggtggc cgctgacttc 300ctcctgatca gcaacctgcc cctccgcgtg gactactacc tcctccatga gacctggcgc 360tttggggctg ctgcctgcaa agtcaacctc ttcatgctgt ccaccaaccg cacggccagc 420gttgtcttcc tcacagccat cgcactcaac cgctacctga aggtggtgca gccccaccac 480gtgctgagcc gtgcttccgt gggggcagct gcccgggtgg ccgggggact ctgggtgggc 540atcctgctcc tcaacgggca cctgctcctg agcaccttct ccggcccctc ctgcctcagc 600tacagggtgg gcacgaagcc ctcggcctcg ctccgctggc accaggcact gtacctgctg 660gagttcttcc tgccactggc gctcatcctc tttgctattg tgagcattgg gctcaccatc 720cggaaccgtg gtctgggcgg gcaggcaggc ccgcagaggg ccatgcgtgt gctggccatg 7809tggtggccg tctacaccat ctgcttcttg cccagcatca tctttggcat ggcttccatg 840gtggctttct ggctgtccgc ctgccgatcc ctggacctct gcacacagct cttccatggc 900tccctggcct tcacctacct caacagtgtc ctggaccccg tgctctactg cttctctagc 960cccaacttcc tccaccagag ccgggccttg ctgggcctca cgcggggccg gcagggccca1020
gtgagcgacg agagctccta ccaaccctcc aggcagtggc gctaccggga ggcctctagg1080aaggcggagg ccatagggaa gctgaaagtg cagggcgagg tctctctgga aaaggaaggc1140tcctcccagg gctga 1155<210>2<211>384<212>PRT<213>人<400>2Met Glu Leu His Asn Leu Ser Ser Pro Ser Pro Ser Leu Ser Ser Ser1 5 10 15Val Leu Pro Pro Ser Phe Ser Pro Ser Pro Ser Ser Ala Pro Ser Ala20 25 30Phe Thr Thr Val Gly Gly Ser Ser Gly Gly Pro Cys His Pro Thr Ser35 40 45Ser Ser Leu Val Ser Ala Phe Leu Ala Pro Ile Leu Ala Leu Glu Phe50 55 60Val Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Ala Leu Phe Ile Phe Cys Ile65 70 75 80His Thr Arg Pro Trp Thr Ser Asn Thr Val Phe Leu Val Ser Leu Val85 90 95Ala Ala Asp Phe Leu Leu Ile Ser Asn Leu Pro Leu Arg Val Asp Tyr100 105 110Tyr Leu Leu His Glu Thr Trp Arg Phe Gly Ala Ala Ala Cys Lys Val115 120 125Asn Leu Phe Met Leu Ser Thr Asn Arg Thr Ala Ser Val Val Phe Leu130 135 140Thr Ala Ile Ala Leu Asn Arg Tyr Leu Lys Val Val Gln Pro His His145 150 155 160Val Leu Ser Arg Ala Ser Val Gly Ala Ala Ala Arg Val Ala Gly Gly165 170 175Leu Trp Val Gly Ile Leu Leu Leu Asn Gly His Leu Leu Leu Ser Thr180 185 190
Phe Ser Gly Pro Ser Cys Leu Ser Tyr Arg Val Gly Thr Lys Pro Ser195 200 205Ala Ser Leu Arg Trp His Gln Ala Leu Tyr Leu Leu Glu Phe Phe Leu210 215 220Pro Leu Ala Leu Ile Leu Phe Ala Ile Val Ser Ile Gly Leu Thr Ile225 230 235 240Arg Asn Arg Gly Leu Gly Gly Gln Ala Gly Pro Gln Arg Ala Met Arg245 250 255Val Leu Ala Met Val Val Ala Val Tyr Thr Ile Cys Phe Leu Pro Ser260 265270Ile Ile Phe Gly Met Ala Ser Met Val Ala Phe Trp Leu Ser Ala Cys275 280 285Arg Ser Leu Asp Leu Cys Thr Gln Leu Phe His Gly Ser Leu Ala Phe290 295 300Thr Tyr Leu Asn Ser Val Leu Asp Pro Val Leu Tyr Cys Phe Ser Ser305 310 315 320Pro Asn Phe Leu His Gln Ser Arg Ala Leu Leu Gly Leu Thr Arg Gly325 330 335Arg Gln Gly Pro Val Ser Asp Glu Ser Ser Tyr Gln Pro Ser Arg Gln340 345 350Trp Arg Tyr Arg Glu Ala Ser Arg Lys Ala Glu Ala Ile Gly Lys Leu355 360 365Lys Val Gln Gly Glu Val Ser Leu Glu Lys Glu Gly Ser Ser Gln Gly370 375 380<210>3<211>387<212>PRT<213>人<400>3Met Asn Arg His His Leu Gln Asp His Phe Leu Glu Ile Asp Lys Lys1 5 10 15Asn Cys Cys Val Phe Arg Asp Asp Phe Ile Ala Lys Val Leu Pro Pro20 25 30
Val Leu Gly Leu Glu Phe Ile Phe Gly Leu Leu Gly Asn Gly Leu Ala35 40 45Leu Trp Ile Phe Cys Phe His Leu Lys Ser Trp Lys Ser Ser Arg Ile50 55 60Phe Leu Phe Asn Leu Ala Val Ala Asp Phe Leu Leu Ile Ile Cys Leu65 70 75 80Pro Phe Val Met Asp Tyr Tyr Val Arg Arg Ser Asp Trp Asn Phe Gly85 90 95Asp Ile Pro Cys Arg Leu Val Leu Phe Met Phe Ala Met Asn Arg Gln100 105 110Gly Ser Ile Ile Phe Leu Thr Val Val Ala Val Asp Arg Tyr Phe Arg115 120 125Val Val His Pro His His Ala Leu Asn Lys Ile Ser Asn Trp Thr Ala130 135 140Ala Ile Ile Ser Cys Leu Leu Trp Gly Ile Thr Val Gly Leu Thr Val145 150 155 160His Leu Leu Lys Lys Lys Leu Leu Ile Gln Asn Gly Pro Ala Asn Val165 170 175Cys Ile Ser Phe Ser Ile Cys His Thr Phe Arg Trp His Glu Ala Met180 185 190Phe Leu Leu Glu Phe Leu Leu Pro Leu Gly Ile Ile Leu Phe Cys Ser195 200 205Ala Arg Ile Ile Trp Ser Leu Arg Gln Arg Gln Met Asp Arg His Ala210 215 220Lys Ile Lys Arg Ala Ile Thr Phe Ile Met Val Val Ala Ile Val Phe225 230 235 240Val Ile Cys Phe Leu Pro Ser Val Val Val Arg Ile Arg Ile Phe Trp245 250 255Leu Leu His Thr Ser Gly Thr Gln Asn Cys Glu Val Tyr Arg Ser Val260 265 270Asp Leu Ala Phe Phe Ile Thr Leu Ser Phe Thr Tyr Met Asn Ser Met
275 280 285Leu Asp Pro Val Val Tyr Tyr Phe Ser Ser Pro Ser Phe Pro Asn Phe290 295 300Phe Ser Thr Leu Ile Asn Arg Cys Leu Gln Arg Lys Met Thr Gly Glu305 310 315 320Pro Asp Asn Asn Arg Ser Thr Ser Val Glu Leu Thr Gly Asp Pro Asn325 330 335Lys Thr Arg Gly Ala Pro Glu Ala Leu Met Ala Asn Ser Gly Glu Pro340 345 350Trp Ser Pro Ser Tyr Leu Gly Pro Thr Ser Asn Asn His Ser Lys Lys355 360 365Gly His Cys His Gln Glu Pro Ala Ser Leu Glu Lys Gln Leu Gly Cys370 375 380Cys Ile Glu385<210>4<211>319<212>PRT<213>人<400>4Met Pro Phe Pro Asn Cys Ser Ala Pro Ser Thr Val Val Ala Thr Ala1 5 10 15Val Gly Val Leu Leu Gly Leu Glu Cys Gly Leu Gly Leu Leu Gly Asn20 25 30Ala Val Ala Leu Trp Thr Phe Leu Phe Arg Val Arg Val Trp Lys Pro35 40 45Tyr Ala Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ala Asp Leu Leu Leu Ala50 55 60Ala Cys Leu Pro Phe Leu Ala Ala Phe Tyr Leu Ser Leu Gln Ala Trp65 70 75 80His Leu Gly Arg Val Gly Cys Trp Ala Leu Arg Phe Leu Leu Asp Leu85 90 95
Ser Arg Ser Val Gly Met Ala Phe Leu Ala Ala Val Ala Leu Asp Arg100 105 110Tyr Leu Arg Val Val His Pro Arg Leu Lys Val Asn Leu Leu Ser Pro115 120 125Gln Ala Ala Leu Gly Val Ser Gly Leu Val Trp Leu Leu Met Val Ala130 135 140Leu Thr Cys Pro Gly Leu Leu Ile Ser Glu Ala Ala Gln Asn Ser Thr145 150 155 160Arg Cys His Ser Phe Tyr Ser Arg Ala Asp Gly Ser Phe Ser Ile Ile165 170 175Trp Gln Glu Ala Leu Ser Cys Leu Gln Phe Val Leu Pro Phe Gly Leu180 185 190Ile Val Phe Cys Asn Ala Gly Ile Ile Arg Ala Leu Gln Lys Arg Leu195 200 205Arg Glu Pro Glu Lys Gln Pro Lys Leu Gln Arg Ala Gln Ala Leu Val210 215 220Thr Leu Val Val Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Leu Pro Cys Phe Leu225 230 235 240Ala Arg Val Leu Met His Ile Phe Gln Asn Leu Gly Ser Cys Arg Ala245 250 255Leu Cys Ala Val Ala His Thr Ser Asp Val Thr Gly Ser Leu Thr Tyr260 265 270Leu His Ser Val Val Asn Pro Val Val Tyr Cys Phe Ser Ser Pro Thr275 280 285Phe Arg Ser Ser Tyr Arg Arg Val Phe His Thr Leu Arg Gly Lys Gly290 295 300Gln Ala Ala Glu Pro Pro Asp Phe Asn Pro Arg Asp Ser Tyr Ser305 310 315<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cagcccatgg aacttcataa cctg24<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6ctggccctca gccctgggag gag 23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>7gctgcctgca aagtcaacct 20<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8tggctgtgag gaagacaa 18<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针<400>9ccaccaaccg cacggcaa 18<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10ctcctgatca gcaacct17<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ttggtggaca gcatgaagag 20
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其包括图1的DNA序列(SEQ ID NO1)。
2.一种分离的核酸分子，其于严紧杂交条件下，可与根据权利要求1的分离核酸分子，或与互补于根据权利要求1的分离核酸分子的杂交探针杂交。
3.根据权利要求1或2的分离核酸分子，其编码具有图2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的多肽。
4.根据权利要求2的分离核酸分子，其编码具有与SEQ ID NO2的氨基酸序列至少30％相同的氨基酸序列的多肽。
5.根据权利要求1或2的分离核酸分子，其被可检测标记物标记。
6.根据权利要求5的可检测标记的分离核酸分子，其中该可检测标记物包括酶、放射性同位素、或发荧光的化学剂。
7.一种分离的多肽，其包括图2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
8.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求7的纯化多肽。
9.根据权利要求7的纯化多肽，其被可检测标记物标记。
10.根据权利要求9的纯化多肽，其中该可检测标记物包括酶、放射性同位素、或发荧光的化学剂。
11.一种抗体，其以根据权利要求7的纯化多肽为免疫原。
12.根据权利要求11的抗体，其中该抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合型抗体。
13.根据权利要求11的抗体，其被可检测标记物标记。
14.根据权利要求13的抗体，其中该可检测标记物包括酶、放射性同位素、或发荧光的化学剂。
15.一种表达载体，其包括可操作地结合表达控制元件的根据权利要求1的分离核酸分子。
16.一种表达载体，其包括可操作地结合表达控制元件的根据权利要求2的分离核酸分子。
17.根据权利要求15或16的表达载体，其中该表达控制元件选自组成型调控序列、细胞特异性调控序列及诱导性调控序列。
18.根据权利要求17的表达载体，其中该表达控制元件为启动子。
19.根据权利要求18的表达载体，其中该启动子包括hCMV的立即早期启动子、SV40的早期启动子、腺病毒的早期启动子、痘苗病毒的早期启动子、多瘤病毒的早期启动子、SV40的晚期启动子、腺病毒的晚期启动子、痘苗病毒的晚期启动子、多瘤病毒的晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、λ噬菌体的主要操纵基因及启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶启动子、酸性磷酸酶启动子、或酵母α交配因子的启动子。
20.一种宿主细胞，其被根据权利要求15或16的表达载体转化或转染。
21.根据权利要求20的宿主细胞，其中该宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
22.根据权利要求21的宿主细胞，其中该宿主细胞包括大肠杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10或Sf9细胞。
23.一种制备根据权利要求7的分离多肽的方法，该方法包括下述步骤a)于允许表达该分离多肽的条件下，培养根据权利要求20的宿主细胞；及b)自该宿主、该培养物、或其组合中回收该分离多肽。
24.一种用于在需要治疗的患者体内调节GAVE6信号活性或信号转导的治疗方法，包括向该患者施与GAVE6的激动剂、拮抗剂或逆向激动剂。
25.一种鉴定GAVE6的激动剂的方法，包括使潜在激动剂与表达GAVE6的细胞接触，并测定相对于该潜在激动剂不存在时的GAVE6活性，该潜在激动剂存在下的GAVE6信号活性是否增加。
26.一种鉴定GAVE6的逆向激动剂的方法，包括使潜在逆向激动剂与表达GAVE6的细胞接触，并测定该潜在逆向激动剂存在下，GAVE6活性是否相对于该潜在逆向激动剂不存在下的GAVE6活性发生降低，及于内源配体或激动剂存在下是否降低。
27.一种鉴定GAVE6拮抗剂的方法，包括使潜在拮抗剂与表达GAVE6的细胞接触，并测定相对于内源配体或激动剂存在下的GAVE6活性，该潜在拮抗剂存在下的GAVE6信号活性是否降低。
28.一种治疗组合物，其包括能调节GAVE6信号活性或转导的GAVE6的激动剂、拮抗剂或逆向激动剂。
29.一种治疗疾病的方法，包括向需要治疗的患者施用治疗组合物，所述治疗组合物包含能调节GAVE6信号活性或转导的GAVE6的激动剂、拮抗剂或逆向激动剂。
全文摘要
本发明提供新颖及有用的G－蛋白质偶联受体，其涉及与炎症及生理免疫学反应相关的信号转导。本发明亦提供使用该受体筛选可调节受体活性的分子的方法。该分子可容易地应用于治疗多种炎症及免疫学上的相关病症与失调症。
文档编号C07K14/705GK1813187SQ03802712
公开日2006年8月2日 申请日期2003年1月21日 优先权日2002年1月23日
发明者H·艾施因德雷罗, 蔡济东, A·桑德拉塞格拉 申请人:安万特药物公司