专利名称：一种抗SARS－CoV免疫球蛋白抗体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体，属于生物制药领域。
背景技术：
世界卫生组织在今年3月12日发出关于非典型肺炎(atypicalpneumonia)的全球性警告之后，随后命名为严重急性呼吸综合征(SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS)。在WHO的高度重视、协调和组织下，引起SARS的病原体很快被确认为一种新的或变异的冠状病毒，并相应命名为SARS-CoV。自SARS爆发后很快在全球传播，现已蔓延到世界30多个国家和地区，严重地影响人们的健康和生命，成为21世纪初最危害人类的头号大敌。马抗血清(又叫马抗免疫球蛋白)自古以来是用于重要病原体感染的一种有效的应急治疗措施，至今至少有7种抗血清在临床广泛应用，发挥重要的治疗和预防传染病的作用。马抗血清发展经历了传统的整个抗体分子，发展到今天有效去掉能引起毒副作用的Fc段抗体分子和其它血浆杂蛋白分子，获得具有与病原体抗原特异结合的高纯度F(ab′)2治疗抗体，达到消灭病原体的效果。基于香港、新加坡和我国大陆报道针对SARS恢复期病人的血清具有治疗SARS的作用，但SARS恢复期病人血清的广泛应用存在一定的问题，并且人们对SARS-CoV的认识还很浮浅，特别是在安全性等方面存在一定的问题，制约其应用和发展。
因此，研制有治疗与预防SARS的马抗SARS-CoV免疫球蛋白，是非常有价值的治疗性和预防性抗体药物。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种新型的用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体；本发明的另一个目的在于公开制备马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的方法。
一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体，是马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体。
本发明马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的制备包括以下步骤1)灭活纯化SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹，免疫四次、间隔10天免疫一次，试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800，测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800，并不同SARS-CoV标准株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性；2)采集马抗SARS-CoV血浆，用无热源2倍蒸馏水稀释加入21％饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白，上清再加入9％饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G(IgG)，用无热源蒸馏水恢复原体积再用30％饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG，先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9％氯化钠盐水用6万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，超滤液为纯化马抗SARS-CoV IgG；3)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氢氧化钠调PH至7.4，加热58℃、30min，用帆布过滤去Fc段，滤液为初步纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体；4)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基蔬水层析(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)，用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱，20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液，再用6万超滤器超滤除盐、浓缩，为纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体。
本发明制备的纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体可制备成马抗SARS-CoV免疫球蛋白注射剂型和黏膜喷雾剂型成品。
本发明所用纯化的灭活SARS-CoV可以通过如下步骤制得1)绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；2)SARS冠状病毒(SARS-CoV)滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量(TCID50)测定SARS-CoV的毒力(106-108)，对滴定的SARS-CoV分装冻存；3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV，生产SARS-CoV；4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次(冰冻-37℃)或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；7)用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱，开始缓冲液是0.1MPBS PH7.0缓冲液，用100mM PBS PH7.0洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析，用100mM PB，PH7.2液平衡并将病毒吸附在柱上、用100mM PB，PH7.2，0.35M NaCl洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。
本发明利用分离的SARS-CoV经培养、灭活、纯化后免疫健康马匹，产生高效价中和SARS-CoV的抗血清，去除能引起副作用的Fc片段，制备马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体，能特异消灭SARS-CoV，对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果；纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体对SARS-CoV具有很好的特异性及灵敏性。
以下实验例进步说明本发明。
实验例1精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的鉴定1)精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体和纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体，采用对流电泳抗体效价达到1∶128以上、间接酶联免疫抗体效价高达1∶12800以上；2)精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的中和效价的滴定，是首先在Vero细胞上对SARS-CoV滴定确定滴度为106-8，选择200TCID50按抗体稀释方法检测马抗SARS-CoV血浆、精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的中和效价。或用蚀斑减数中和实验方法检测马抗SARS-CoV血浆、精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体的中和效价在1∶10000以上；实验例2精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白治疗和预防效果的评价1)建立SARS-CoV感染Vero-6细胞模型，在16孔细胞培养板加入4×105/孔Vero-6，培养24h加入100CTID50BJ01 SARS-CoV200ul，24h后加入0.1mg/100mL马抗SARS-CoV免疫球蛋白治疗SARS-CoV感染的细胞，观察48h经细胞病变法、MTT法和空斑减数法检测马抗SARS-CoV免疫球蛋白具有很好治疗SARS-CoV的效果；2)马抗SARS-CoV免疫球蛋白0.1mg/100mL加入4×105/孔Vero-6细胞/16孔细胞培养板，12h用100CTID50BJ01 SARS-CoV200ul感染Vero-6细胞，观察72h经细胞病变法、MTT法和空斑减数法检测精制马抗SARS-CoV免疫球蛋白具有很好预防SARS-CoV的效果；3)通过对每只恒河猴1×108滴鼻感染BJ01株SARS-CoV建立了感染模型，感染后6h、12h、24h、48h分别肌肉注射2mg/2mL(100IU)，观察15天解剖，从症状表现治疗组减轻到无、白细胞及免疫细胞逐渐恢复正常。从病原学观察到治疗组肺、肝、肾、脑、胸腺、脾脏、淋巴结、拭胭子、血液、粪便等部位分离病原体，及PCR检测S、N、M、E和X4主要病原体蛋白基因，经病毒培养和PCR扩增病原体均为阴性。从病理改变观察到治疗组肺、肝组织病理改变有不同程度的好转，并产生有效的抗SARS-CoV抗体。说明马抗SARS-CoV免疫球蛋白在SARS-CoV感染的动物有明显治疗SARS的效果；4)马抗SARS-CoV免疫球蛋白黏膜喷雾剂3mg/3mL(150IU)给药，每12h一次，共用4次给恒河猴预防，再用1×108滴鼻感染BJ01株SARS-CoV感染攻击恒河猴，观察30天预防组恒河猴没有出现症状、不发烧、血细胞正常，发病。从病原学观察到预防组肺、肝、肾、脑、胸腺、脾脏、淋巴结、拭胭子、血液、粪便等部位分离病原体，及PCR检测S、N、M、E和X4主要病原体蛋白基因，经病毒培养和PCR扩增病原体均为阴性。从病理改变观察到治疗组肺、肝组织病理改变有不同程度的好转，并产生具有中和活性的抗SARS-CoV抗体。说明马抗SARS-CoV免疫球蛋白在SARS-CoV感染的动物有明显预防SARS的效果。
下述实施例均能达到上述实验例的效果。
实施例1马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体制备1、SARS-CoV的培养、灭活及纯化1)绿猴肾细胞(Vero细胞)的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；2)SARS冠状病毒(SARS-CoV)滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量(TCID50)测定SARS-CoV的毒力(106-108)，对滴定的SARS-CoV分装冻存；3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV，生产SARS-CoV；4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次(冰冻-37℃)或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；5)向SARS-CoV培养液加入1/4000的β-丙内酯(1/2000-1/8000均可)，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；7)用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子筛纯化，对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱层析，0.01Mtris-HCl PH7.4缓冲液洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析纯化，用0.03MNacl、50mMTris PH8.0缓冲液洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。
2、马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体制备1)选用的SARS-CoV是我们所分离并经国家生物制品检定所鉴定的标准毒株，所用Vero细胞是来自细胞生产工厂，进行SARS-CoV培养、灭活和纯化，制备灭活纯化SARS-CoV抗原；2)灭活纯化SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹，免疫四次、间隔10天免疫一次，试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800，测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800，并不同SARS-CoV标准株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性；3)采集马抗SARS-CoV血浆，用无热源2倍蒸馏水稀释加入21％饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白，上清再加入9％饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G(IgG)，用无热源蒸馏水恢复原体积再用30％饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG，先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9％氯化钠盐水用6万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，超滤液为纯化马抗SARS-CoV IgG；4)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氢氧化钠调PH至7.4，加热58℃、30min，用帆布过滤去Fc段，滤液为初步纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体；5)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基蔬水层析(Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)，用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱，20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液，再用6万超滤器超滤除盐、浓缩，为纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体；6)纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体加入适量硫柳汞防腐剂，用生理盐水稀释所需含量0.22um除菌分装，分别制备马抗SARS-CoV免疫球蛋白注射剂型和黏膜喷雾剂型成品；7)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品用2％蛋白浓度做琼脂糖电泳检测，没有白蛋白成分、通过10％SDS-PAGE检测F(ab′)2纯度在90％以上，抗体中和效价细胞病变法、空斑减数法1∶2000/mg蛋白，按现有国家对人抗SARS-CoV免疫球蛋白注射液1∶40/mg为1个治疗单位(1IU)，则马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品50IU/mg；8)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品的理化性质检测，蛋白含量3.0g/L、PH值6.8、氯化钠含量8.5g/L、硫酸铵含量0.5g/L、硫柳汞0.06g/L、冻干制剂水分含量2.0％，均符合生物制品的规定；9)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品在兔和小鼠体内进行热源、异常毒性观察，实验证实马抗SARS-CoV免疫球蛋白无热源、异常毒性；10)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品放4℃、37℃观察稳定性，实验证实马抗SARS-CoV免疫球蛋白放置6个月以上中和效价不减，有很好的稳定性；11)马抗SARS-CoV免疫球蛋白成品，通过免疫组化证实与正常人心、肝、肺、肾、脑、脾、淋巴结、肠组织器官没有交叉反应，证实马抗SARS-CoV免疫球蛋白没有抗人的组织成分，用于人的防治是安全的。
权利要求
1.一种用于治疗、预防及诊断SARS-CoV的抗SARS-CoV免疫球蛋白抗体，其特征在于该抗体是的制备方法包括如下步骤1)灭活纯化SARS-CoV加入不完全福氏佐剂乳化制备免疫原，采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫符合生物制品要求的马匹，免疫四次、间隔10天免疫一次，试血测抗体效价对流电泳1∶128、间接酶联免疫1∶12800，测抗体中和效价细胞病变法1∶12800、空斑减数法1∶12800，并不同SARS-CoV标准株免疫马产生的中和抗体均与其它SARS-CoV毒株呈现一致的中和抗体活性；2)采集马抗SARS-CoV血浆，用无热源2倍蒸馏水稀释加入21％饱和度硫酸铵混匀、离心弃沉淀纤维蛋白和白蛋白，上清再加入9％饱和度硫酸铵混匀离心要沉淀免疫球蛋白G，用无热源蒸馏水恢复原体积再用30％饱和度硫酸铵混匀、离心要沉淀IgG，先加入一定量的无热源蒸馏水、后加入无热源0.9％氯化钠盐水用6万超滤器超滤除盐、浓缩和去杂蛋白，超滤液为纯化马抗SARS-CoV IgG；3)纯化的马抗SARS-CoV IgG用盐酸调PH至3.2后胃蛋白酶切割，再用氢氧化钠调PH至7.4，加热58℃、30min，用帆布过滤去Fc段，滤液为初步纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体；4)初步纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体过苯基蔬水层析，用200mmol/L pH7.0磷酸缓冲液、1mol/L硫酸铵上柱，20mmol/L pH7.0磷酸缓冲液收集F(ab′)2抗体流出液，再用6万超滤器超滤除盐、浓缩，为纯化马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体。
2.如权利要求1所述的免疫球蛋白抗体，其特征在于制备该抗体所用的纯化的灭活SARS-CoV是由如下方法制得的1)绿猴肾细胞的复苏、培养，取细胞种子库冻存Vero细胞株，用DMEM培养基并加入10％小牛血清培养，提供培养SARS-CoV的Vero细胞；2)SARS冠状病毒滴定，对培养的Vero细胞加入经鉴定冻存的SARS-CoV，扩增培养SARS-CoV，采用组织培养半数感染量测定SARS-CoV的毒力106-108，对滴定的SARS-CoV分装冻存；3)用长满单层的Vero细胞加入滴定的SARS-CoV，用无血清DMEM培养SARS-CoV，生产SARS-CoV；4)Vero细胞完全病变后收集SARS-CoV培养液，反复冻融三次，冰冻-37℃或不冻融，收集SARS-CoV细胞培养液；5)向SARS-CoV培养液加入1/2000-1/8000的β-丙内酯，4℃过夜、37℃2h灭活SARS-CoV，取灭活的SARS-CoV培养液在Vero细胞上连传三代，检测SARS-CoV灭活效果；6)灭活的SARS-CoV培养液，4℃、离心12000rpm/min 30min，弃沉淀杂蛋白，上清为SARS-CoV液；7)用分子量30万超滤柱超滤SARS-CoV液，浓缩和去杂蛋白，滤液为粗制灭活SARS-CoV；8)对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B分子筛纯化，对粗制灭活SARS-CoV上Sepharose CL-2B柱层析，0.01Mtris-HCl PH7.4缓冲液洗脱，收集SARS-CoV，合并浓缩收集初步纯化SARS-CoV；9)对初步纯化的SARS-CoV液上DE52阴离子柱层析纯化，用0.03MNacl、50mMTris PH8.0缓冲液洗脱，收集SARS-CoV峰，合并浓缩收集纯化SARS-CoV；10)对超滤浓缩后SARS-CoV液的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为55％、用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为92％；11)对凝胶过滤纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得抗原回收率平均为85％、采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为94.5％、用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于10.0ng/ml、用血凝抑制实验测定病毒残余牛血清含量小于12.5ng/ml；12)对离子交换纯化SARS-CoV的效果分析，用双抗体夹心法测得蛋白抗原由纯化前的9.4ng/U，降低到0.8ng/U，HPLC显示病毒纯度为97％；采用改良Lowry法测得杂蛋白去除率平均为98.5％；用电镜观察病毒颗粒完整、用斑点杂交测定Vero细胞残留DNA含量小于1.0ng/ml；SDS-PAGE显示有SARS-CoV的S、N、M、主要蛋白条带，并与恢复期SARS病人的血清发生反应，纯化灭活SARS-CoV分装放-70℃保存。
3.如权利要求1所述的免疫球蛋白抗体，其特征在于纯化的马抗SARS-CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体可制备成马抗SARS-CoV免疫球蛋白注射剂型和黏膜喷雾剂型成品。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗、预防及诊断SARS－CoV的抗SARS－CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体，特征在于该抗体为马抗SARS－CoV免疫球蛋白F(ab′)2抗体，同时本发明公开该抗体的制备方法。本发明抗体能特异消灭SARS－CoV，对非典型肺炎的治疗和预防有很好的效果。
文档编号C07K16/08GK1621415SQ200310113790
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年11月25日
发明者王希良, 杜新安, 石辛甫, 张松乐, 刘建源, 李岩, 赵光宇, 田光, 周华 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所