专利名称：从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法
技术领域：
本发明涉及一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法。
背景技术：
茶叶是我国重要经济作物和出口创汇产品之一，2000年创汇达4.0亿美元，但长期以来，我国茶叶生产仍以传统的粗加工产品为主，近年来传统茶叶产品供过于求，每年有10万吨左右的低档茶积压，严重阻碍了我国茶产业的发展。
茶叶深加工是茶产业的新领域，有着巨大的增值潜力和市场潜力。随着茶叶研究的不断深入以及和医学研究的交叉和渗透，已经证实茶多糖具有降血糖、增强免疫力、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗凝血、抗血栓等保健功能；茶多酚具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗突变和增强免疫、降血脂等保健功能；茶氨酸具有促进大脑功能与神经的生长、增加肠道有益菌群、降压安神、改善睡眠等保健功能。上述茶叶中的功能成分，因其良好的保健功能和资源优势而越来越被重视。
目前国内有关茶多糖提取纯化方法的专利有CN1344748A、CN1379044A、CN1431226A、CN1176748A。上述四项专利都是采用水或有机溶剂浸泡法提取茶叶中的茶多糖，存在难以同时提出四种功能成分或溶剂用量大、提取时间长、提取率低、有效成份损失大等缺点。
上述专利中涉及茶多糖纯化方面的专利有CN1379044A，该方法是采用水提取、超滤精制的方法生产茶多糖。但该方法仅开发利用了茶叶中一种成分茶多糖，无法充分利用茶叶中其它的有效成分，如茶多酚、茶氨酸、咖啡碱等，造成了资源的浪费，降低了茶叶深加工的经济效益。
目前国内有关从茶叶中提取分离咖啡碱和茶多酚的专利比较多，但提取分离茶氨酸的专利还没有，如何充分有效地利用茶叶中的有效成分，提高茶叶深加工的经济效益，已经成为急待解决的问题。
针对以上缺点，本发明提出了在微波强化的作用下，一次性从茶叶粉末中提取四种功能成分，采用凝胶柱层析法精制分离高纯度茶多糖、氯仿萃取法分离咖啡碱、乙酸乙酯萃取法分离茶多酚、732阳离子树脂交换法提取茶氨酸的工艺方法，以提高茶叶提取深加工的经济效益。
发明内容
本发明目的是提供一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法。如附
图1所示，工艺的步骤如下1)茶叶粉末中加入5-20倍的水或有机溶剂水溶液，在微波作用下，20℃-60℃温度范围内，多次重复浸泡提取，每次5-60分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加茶多糖沉淀剂，经过滤可得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，利用盐析法除去蛋白，经凝胶柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖。
2)多糖提取后余液，用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取2-4次，合并氯仿萃余相，然后萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为萃余相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取相并干燥可得到茶多酚。
3)乙酸乙酯萃余相，调整pH值为1-5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1-3BV酸水洗柱后，用氨水洗脱，收集所需部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3-1/2，降温、结晶、干燥可得到茶氨酸。
4)合并收集的氯仿萃取相，经结晶、干燥可得到咖啡碱。
本发明的优点1)将微波强化作用应用到茶叶有效成分的提取中，存在提取时间短、提取率高、活性物质损失少等优点；2)一次性提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱等四种成分；3)将凝胶柱层析应用到茶多糖的精制工艺中，存在分离效果好、茶多糖含量高、不损伤茶多糖的原有结构与活性；4)得到的茶多糖产品，总糖含量≥65.00％，得率≥0.5％；咖啡碱的纯度≥95％，得率≥1.0％；茶多酚的纯度≥80％，得率≥5％；茶氨酸的纯度≥50％。
具体实施例方式
如附图1所示，总的工艺流程如下1)茶叶粉末中加入5-20倍的水或有机溶剂水溶液，在微波作用下，20℃-60℃温度范围内，多次重复浸泡提取，每次5-60分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加茶多糖沉淀剂，经过滤可得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，利用盐析法除去蛋白，经凝胶柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖。
2)多糖提取后余液，用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取2-4次，合并氯仿萃余相，然后萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为萃余相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取相并干燥可得到茶多酚。
3)乙酸乙酯萃余相，调整pH值为1-5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1-3BV酸水洗柱后，用氨水洗脱，收集所需部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3-1/2，降温、结晶、干燥可得到茶氨酸。
4)合并收集的氯仿萃取相，经结晶、干燥可得到咖啡碱。
在本发明中，所述的茶叶经粉碎为粉末为好，如粉碎到1-100目。
在本发明中，所述的提取中，在茶叶或滤渣中加入水或有机溶剂中，固液重量比为1∶5-20，置于微波作用下，在20℃-60℃温度范围内多次重复提取，每次5-60分钟，滤除残渣，合并滤出液；在本发明中，所述的茶多糖沉淀剂可以是低分子的醇、酮或壳聚糖。从经济与安全考虑，采用乙醇为适，用量为液体的体积1-5倍。
在本发明中，所述的水建议用去离子水。
在本发明中，所述的蛋白质盐析剂，可以是醋酸锌、硫酸锌、硫酸钠、氯化钠、柠檬酸钠。
在本发明中，经过除蛋白质后的提取液，采用凝胶柱层析精制分离得到茶多糖。所述的凝胶是交联葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，交联葡聚糖凝胶包括Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75，聚丙烯酰胺凝胶包括Bio-Gel P-4、Bio-Gel P-6、Bio-Gel P-10、Bio-Gel P-30。推荐使用SephadexG-25。
在本发明中，采用732阳离子交换精制茶氨酸，只收集高浓度茶氨酸部分的洗脱液，其余含有茶氨酸的洗脱液经浓缩后重新过732阳离子交换柱，以提高茶氨酸的得率。
在本发明中，需要对茶氨酸浓缩液进行降温结晶，一般置于-10℃下过夜就可以析出茶氨酸，结晶后的液体可进行重结晶。
在本发明的方法中，所述的过滤、浓缩、干燥可以是离心分离、过滤分离、真空蒸馏、薄膜蒸馏、冷冻干燥、喷雾干燥。
实施例1
1)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用5倍的乙醇水溶液，60℃温度下重复浸泡提取4次，每次5分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加食用乙醇，用量为浓缩液体积的2倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％醋酸锌去除蛋白质，多糖溶液经凝胶G75柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到65.00％，得率为0.5％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的1倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取4次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的5倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为80％，得率为5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为1，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用3BV酸水洗柱后，用pH＝12的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到-10℃、结晶干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为50％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
实施例21)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用10倍的30％乙醇水溶液，40℃温度下重复浸泡提取3次，每次20分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加食用乙醇，用量为浓缩液体积的3倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％醋酸锌去除蛋白质，多糖溶液经凝胶G25柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到66.10％，得率为0.51％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的5倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取3次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为82％，得率为5.5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1BV酸水洗柱后，用pH＝11的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到-10℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为55％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
实施例31)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用15倍的10％乙醇水溶液，40℃温度下重复浸泡提取3次，每次15分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加食用乙醇，用量为浓缩液体积的5倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％醋酸锌去除蛋白质，多糖溶液经凝胶Bio-Gel P-6柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到67％，得率为0.55％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的3倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取3次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为82％，得率为5.5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用3BV酸水洗柱后，用pH＝11的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/2，降温到-10℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为53％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为96％，得率为1.6％。
实施例41)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用20倍的去离子水，40℃温度下重复浸泡提取3次，每次20分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加壳聚糖，用量为1.0％，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加2％硫酸锌除去蛋白，经凝胶Bio-Gel P-10柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到66.10％，得率为0.51％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的2倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取3次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为82％，得率为5.5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为1，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1BV酸水洗柱后，用pH＝11的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到0℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为50％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
实施例41)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用10倍的30％乙醇水溶液，40℃温度下重复浸泡提取3次，每次20分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加95％的乙醇，用量为浓缩液体积的3倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％醋酸锌除去蛋白，多糖溶液经凝胶柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到66.10％，得率为0.51％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的2倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取3次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为82％，得率为5.5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为1，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1BV酸水洗柱后，用pH＝11的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到0℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为50％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
实施例51)茶叶粉末1千克，在微波作用下，用20倍的50％乙醇水溶液，20℃温度下重复浸泡提取3次，每次60分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加100％的乙醇，用量为浓缩液体积的2倍，经过滤得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，添加1％硫酸锌除去蛋白，多糖溶液经凝胶G25柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖，茶多糖中总糖含量达到670％，得率为0.57％。
2)多糖提取后余液用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的2倍，混合均匀，进行两相分离，得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取4次，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为液相体积的2倍，混合均匀，两相分离，得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取4次，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚，茶多酚的纯度为85％，得率为5％。
3)乙酸乙酯萃余相，调整其pH为5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用3BV酸水洗柱后，用pH＝12的氨水进行洗脱，收集部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3，降温到-10℃、结晶、干燥可得到茶氨酸，茶氨酸的纯度为52％。
4)合并氯仿萃取相，结晶、干燥可得到咖啡碱，咖啡碱的纯度为95％，得率为1.2％。
权利要求
1.一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法，其特征在于方法的步骤如下1)茶叶粉末中加入5-20倍的水或有机溶剂水溶液，在微波作用下，20℃-60℃温度范围内，多次重复浸泡提取，每次5-60分钟，经过滤分离得到茶叶提取液，茶叶提取液经浓缩，浓缩液中添加茶多糖沉淀剂，经过滤可得到茶多糖沉淀和多糖提取后余液，多糖沉淀用水溶解后，利用盐析法除去蛋白，经凝胶柱层析，洗脱液干燥得到茶多糖。2)多糖提取后余液，用氯仿萃取，氯仿的用量为液相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到氯仿萃取相与氯仿萃余相，重复萃取2-4次，合并氯仿萃余相，然后萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯的用量为萃余相体积的1-5倍，混合均匀，两相分离，可得到乙酸乙酯萃取相与乙酸乙酯萃余相，重复萃取2-4次，合并乙酸乙酯萃取相并干燥可得到茶多酚。3)乙酸乙酯萃余相，调整pH值为1-5，然后经过732阳离子交换树脂柱进行离子交换，用1-3 BV酸水洗柱后，用氨水洗脱，收集所需部分流出液，调整收集液pH值到茶氨酸的等电点，浓缩到原体积的1/3-1/2，降温、结晶、干燥可得到茶氨酸。4)合并收集的氯仿萃取相，经结晶、干燥可得到咖啡碱。
2.根据权利要求1所述的一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法，其特征在于所述的有机溶剂水溶液为甲醇或乙醇的水溶液。
3.根据权利1要求所述的一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法，其特征在于所述的茶多糖沉淀剂为高浓度的乙醇、丙酮、壳聚糖等，乙醇或丙酮的用量为浓缩液体积的1-5倍，壳聚糖的用量为0.01～3.0％。
4.根据权利1要求所述的一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法，其特征在于所述的盐析法中所用的试剂可为醋酸锌、硫酸锌、硫酸钠、氯化钠、柠檬酸钠等。
5.根据权利1要求所述的一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法，其特征在于所述的凝胶柱层析法所用的凝胶为交联葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶。交联葡聚糖凝胶包括Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75，聚丙烯酰胺凝胶包括Bio-Gel P-4、Bio-Gel P-6、Bio-Gel P-10、Bio-Gel P-30。
6.根据权利1要求所述的一种从茶叶中综合提取茶多糖、咖啡碱、茶多酚、茶氨酸的方法，其特征在于过滤、浓缩、干燥分别可以是离心分离、过滤分离、真空蒸馏、薄膜蒸馏、冷冻干燥、喷雾干燥。
全文摘要
本发明公开了一种从茶叶中综合提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱的方法。步骤如下1)茶叶粉末经水或有机溶剂水溶液，在微波作用下提取，提取液经浓缩、添加沉淀剂，水溶解多糖沉淀后，盐析法除蛋白，经凝胶柱层析、干燥得到茶多糖。2)多糖提取后余液，氯仿萃取，氯仿萃余相用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取相干燥可得到茶多酚。3)乙酸乙酯萃余相，经732阳离子交换树脂柱、浓缩、结晶、干燥可得到茶氨酸。4)氯仿萃取相，经结晶、干燥可得到咖啡碱。本发明的优点1)微波强化提取时间短、提取率高、活性物质损失少；2)同时提取茶多糖、茶多酚、茶氨酸、咖啡碱等四种成分；3)凝胶柱层析精制含量高、效果好。
文档编号C07D473/12GK1557841SQ20041001590
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月14日 优先权日2004年1月14日
发明者江和源, 王川丕 申请人:中国农业科学院茶叶研究所