专利名称：一种人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有人角质细胞生长因子2或其衍生序列的表达质粒载体。
背景技术：
重组人角质细胞生长因子2及其衍生序列在大肠杆菌中表达，在多篇文献中已涉及。专利US6077692中使用Human Genomics Science公司的pHE4进行表达，启动子为噬菌体启动子并受一前一后两个lacO操作子的调控，ColE1复制子，卡那霉素抗性。专利WO9625422中使用的是Qiagen公司的pQE-60表达载体，启动子为噬菌体T5启动子并受两个位于3’端的lacO操作子的调控，ColE1复制子，氨苄青霉素抗性。还有使用Novogene公司的pET系列载体进行表达的(H.Emoto et.al，J.Bio.Chem.272(37)23191-23194，1997；S.Bagai.et.al，J.Bio.Chem.277(28)23828-23837，2002)，还有使用invitrogen公司的pSE载体进行表达的(马雁彬等，中国生物化学与分子生物学报，17(6)761-765，2001)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有人角质细胞生长因子2或其衍生序列并且能够高效表达重组人角质细胞生长因子2蛋白的质粒载体。
本发明所述的人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体含有一个Trc启动子；两个lacO操作子；一编码人角质细胞生长因子2蛋白的基因序列或其衍生序列；还含有RBS-ATG序列、转录终止子、卡那霉素编码序列、复制子、lacI阻遏蛋白编码序列及其它连接序列。
在专利申请号200410022645.1中我们描述了一种KGF-2表达方法，使用invitrogen公司的pThioHisA载体，发现其本底表达很高，提示可能由于KGF-2基因序列结构原因导致lacI阻遏蛋白不能有效地结合在lacO操作子上，导致较高的本底转录。KGF-2蛋白对大肠杆菌有毒性，较高的本底表达导致宿主菌生长停滞，决定了氨苄青霉素不宜作为筛选基因。因此，选用一种低拷贝数的双lacO操作子调控的卡那霉素抗性质粒用于KGF-2表达是比较合适的，基于以上分析我们构建了本发明中描述的表达质粒载体。
本发明所述的质粒载体呈卡那霉素抗性，携带阻遏蛋白lacI编码基因，复制子为ColE1，启动子为Trc启动子，由-35区序列5’TTGACAATTAAT3’和-10区序列5’TATAAT3’组成。在Trc启动子的5’端和3’端分别有一lacO操作子，由序列5’TGTGAGCGGATAACAAT3’组成，第一个起始于-60至-51区域，第二个起始于+1至+10区域。角质细胞生长因子2基因序列为编码蛋白序列如SEQ ID No.1或其衍生序列。
本发明所述的人KGF-2蛋白表达质粒载体中具有代表性的质粒载体pTiK226其结构如图1所示，其序列如SEQ ID No.2。
用上述的质粒载体pTiK226表达时，其本底表达水平比另一类似质粒载体pTrc217的本底表达水平低，如图2所示。pTrc217质粒载体与pTiK226非常相似，只是将SEQ ID No.2中的4540-4561片断替换为序列(5’CATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCT 3’)，从而缺少质粒pTiK226中位于Trc启动子5’端的lacO操作子，只含3’端的lacO操作子。证实了两个lacO操作子在控制本底表达方面比一个操作子强。
我们同时构建了另一种双lacO操作子调控的T7启动子启动转录的表达质粒pT7DL201，此质粒将SEQ ID No.2中的4540-4597片断替换为序列(5’AAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTT 3’)，此表达载体将pTiK226质粒中的Trc启动子替换为T7启动子，并由两个位于其3’端的lacO操作子调控，其本底表达比质粒pTrc217低，但高于质粒pTiK226，如图2所示。这种差异在一定程度上可能因启动子的强弱不同以及两个lacO操作子所处位置不同造成，但非常可能的原因是启动子与待表达基因间的距离不同造成。Trc启动子与目的基因间的距离较长，消弱了目的基因不利结构的影响。
KGF-2蛋白在大肠杆菌中的表达，Michael等(Biotechnol.Prog.2044-50，2004)表明ompT蛋白对KGF-2的表达纯化有非常重要的影响，BL21系列大肠杆菌为ompT和lon蛋白酶缺陷型菌株，比较适合作为pTiK226质粒的宿主菌。
本发明构建的质粒载体用于在大肠杆菌中高效表达重组人KGF-2蛋白。
图1是重组表达质粒载体pTiK226的结构示意图。
图2是重组表达质粒载体pT7DL201、pTiK226、pTrc217本底表达示意图。
图3是重组人KGF-2蛋白的表达纯化电泳图谱。
图4是重组KGF-2蛋白细胞活性。
具体实施例方式
实施例1、重组表达质粒pT7DL201、pTiK226、pTrc217的构建以K2O(5’CCCTCTAGAAATAATTTTGTTAATTGTGAGCGGATAACAATTTC)和K2R(5’GCACTCGAGTGTAAAACGACGGCCAGTGC)作引物，以质粒pTrcKGF2(其构建详见专利申请号200410022645.1)作模板，PCR扩增产物用XhoI/XbaI酶切后与载体pET41b(Novagene)的XhoI/XbaII双酶切大片断相连接，筛选得到表达质粒pT7DL201。
以SphI_lacO_K2F(5’CGTGCATGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATGTTGACAATT AATCATCCGG)和K2R作引物，以质粒pTrcKGF2作模板，PCR扩增产物用SphI/XhoI酶切后与载体pET41b(Novagene)的SphI/XhoI双酶切大片断相连接，筛选得到表达质粒pTiK226，其结构如图1所示，序列如SEQ ID No.2。
以SphI_K2F(5’CTTGCATGCCATCATAACGGTTCTGGCAA)和K2R作引物，以质粒pTrcKGF2作模板，PCR扩增产物用SphI/XhoI酶切后与载体pET41b(Novagene)的SphI/XhoI双酶切大片断相连接，筛选得到表达质粒pTrc217。
本发明所述的质粒载体转化的宿主细胞为大肠杆菌细胞，最佳的大肠杆菌为BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)placI。表达质粒pT7DL201、pTiK226、pTrc217转化入大肠杆菌BL21(DE3)placI，用含25ug/ml卡那霉素的LB培养基在37℃培养至OD600约为0.4，加入终浓度1mM IPTG诱导，表达产物跑SDS-PAGE电泳，如图2所示。
pT7DL201、pTiK226、pTrc217此三种表达质粒的RBS-ATG序列都相同，其序列为5′AGAGGTATATACATATG3′；转录终止子都是T7启动子，复制子都是ColE1复制子，卡那霉素编码序列和lacI阻遏蛋白编码序列及其它连接序列都相同，不同的只是启动子和lacO操作子的个数及位置。由图2可见，pTiK226的本底表达最低，pT7DL201次之，pTrc217的本底表达最高，可见质粒载体pTiK226最适于KGF-2蛋白的表达。另外，pTiK226表达质粒采用了卡那霉素抗性，这比使用氨苄青霉素抗性更适合生产应用，因为尽管其本底表达很低，但还是存在一定的本底表达，如果使用氨苄青霉素抗性在生产上扩大培养时会带来一定问题，可能使生产菌株不稳定。pTiK226表达质粒携带了lacI阻遏蛋白编码序列，可以很方便地转化入不同的宿主菌，如果不携带此序列，选择合适的宿主菌，比如BL21(DE3)placI也能获得高效表达。pTiK226表达质粒采用ColE1复制子，此复制子的拷贝数中等。选用高拷贝数的复制子，本底表达会升高，表达菌株不稳定；选用低拷贝数的复制子，有可能降低本底表达，但很可能影响最终的表达量。pTiK226表达质粒采用的RBS-ATG序列并不是唯一可选的序列，通过形成二级结构阻碍翻译顺利进行从而降低本底表达并不是一种可行方法，因可能造成表达量降低。pTiK226表达质粒采用的RBS-ATG可以使翻译顺利进行，在此序列上所作的修改或采用其它的序列，对KGF-2的高效表达都没有决定性的意义。除上述这些必要序列外，连接这些必要序列的其它序列对KGF-2的高效表达没有决定性的意义，对其所作的任何修改在不影响表达质粒载体结构稳定性的前提下都没有实质意义。
2、重组KGF-2蛋白的制备将表达质粒pTiK226转化入大肠杆菌BL2(DE3)或BL2(DE3)placI后，用含25ug/ml卡那霉素的LB培养基在37℃培养至OD600约为0.6，加入终浓度1mM IPTG诱导4小时后离心收菌，悬浮于50mMTris/0.15MNaCl/1mMEDTA/pH8.0缓冲液中，超声破碎后离心去除沉淀，将上清过肝素亲和层析柱，大约在1.0M NaCl浓度洗脱得到重组KGF2蛋白。用羊抗人KGF2多抗(USB公司，F4212)作免疫印迹证实表达产物为人KGF2蛋白。如图3所示。
用原代培养的人角质细胞测定重组KGF2蛋白的效价。取手术后包皮组织，剪成小片，用dispase酶消化，分离出表皮，表皮再用trypsin消化，然后用soybean trypsin inhibitor终止消化，离心收集，用completed k-SFM(invitrogen公司)培养至长满60％培养瓶以上。消化后在96孔培养板中每孔接种1000-2000细胞，用completed k-SFM培养24小时或更长，用K-SFM洗一至两次，然后用K-SFM培养24小时，然后换成加有不同浓度重组KGF2的培养基，继续培养2-3天，然后加入含10％alamarBlue(Biosource公司)的K-SFM培养直至颜色改变，测OD570和OD630值。测得的EC50与文献报道的基本相同，如图4所示。
SEQ ID No.1序列特征1.长度208氨基酸2.类型蛋白质1 MWKWILTHCA SAFPHLPGCC CCCFLLLFLV SSVPVTCQAL GQDMVSPEAT NSSSSSFSSP61 SSAGRHVRSY NHLQGDVRWR KLFSFTKYFL KIEKNGKVSG TKKENCPYSI LEITSVEIGV121 VAVKAINSNY YLAMNKKGKL YGSKEFNNDC KLKERIEENG YNTYASFNWQ HNGRQMYVAL181 NGKGAPRRGQ KTRRKNTSAH FLPMVVHSSEQ ID No.2序列特征1.长度5466碱基 2.类型核酸3.链型单链 4.拓扑学线性1 tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg61 cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc121 ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg181 gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc241 acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt301 ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc361 ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta421 acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt481 tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta541 tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat601 tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa
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权利要求
1.一种人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体，其特征在于含有一个Trc启动子；两个lacO操作子；一编码人角质细胞生长因子2蛋白的基因序列或其衍生序列。
2.按照权利要求1所述的人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体，其特征在于所述的Trc启动子由-35区序列5’TTGACAATTAAT3’和-10区序列5’TATAAT3’组成。
3.按照权利要求1所述的人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体，其特征在于所述的Trc启动子的5’端和3’端分别有一lacO操作子，由序列5’TGTGAGCGGATAACAAT3’组成，第一个起始于-60至-51区域，第二个起始于+1至+10区域。
4.按照权利要求1所述的人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体，其特征在于所述的角质细胞生长因子2基因序列为编码蛋白序列如SEQ ID No.1或其衍生序列。
5.按照权利要求1所述的人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体，其特征在于所述的质粒载体pTiK226其序列如SEQ ID No.2。
6.按照权利要求1所述的人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体，其特征在于所述的质粒载体转化的宿主细胞为大肠杆菌细胞。
7.按照权利要求6所述的人角质细胞生长因子2蛋白表达质粒载体，其特征在于所述的大肠杆菌为BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)placI。
全文摘要
本发明涉及一种含有人角质细胞生长因子2或其衍生序列的表达质粒载体。本发明所述的表达质粒载体含有一个Trc启动子；两个lacO操作子；一编码人角质细胞生长因子2蛋白的基因序列或其衍生序列；还含有RBS－ATG序列、转录终止子、卡那霉素编码序列、复制子、lacI阻遏蛋白编码序列及其它连接序列。本发明具有代表性的质粒载体为pTiK226。本发明构建的质粒载体用于在大肠杆菌中高效表达重组人KGF－2蛋白。
文档编号C07K14/475GK1786174SQ20041007961
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月8日 优先权日2004年12月8日
发明者赵彬, 赵晶 申请人:昆明滇虹药业有限公司