专利名称：毛发生长促进活性的评价方法
技术领域：
本发明涉及使用上皮新生毛囊特异性抗体进行毛发生长促进活性评价的方法，以及含有该抗体的毛发生长促进活性评价试剂盒。
背景技术：
有证据显示上皮组织正常形态的形成，受到来自存在于上皮组织周围的间充质细胞的因子控制，另外，因上皮组织形态形成的异常而产生的疾病大多起因于间充质细胞的异常，因此，人们对阐明间充质细胞控制上皮组织的形态形成的机理产生了很大兴趣。但是，与上皮组织形态形成的控制有关的物质群在复杂的系统中，受时间上和空间上的控制而表达，分离这些物质并分析其机能是极为困难的，另外，将上皮组织的形态形成构建成单纯的模型试验系统也是很难的，因此，该领域的研究至今未见有大的进展。为了阐明起因于上皮组织的形态形成的疾病的发病机理、以及确立这些疾病的治疗方法等，人们急切盼望能够阐明上皮组织形态形成的控制机理。
在这种状况下，人们分离并纯化了与上皮组织形态形成的控制有关的上皮形成素(EP0562123号公报)。明确了该物质是以由277-289个氨基酸构成的蛋白质为核心蛋白的生理活性物质，主要由间充质细胞生物合成获得。另外还阐明了上皮形成素具有作用于上皮细胞，促进上皮组织的形态形成的作用，以及上皮形成素不发挥作用时，则不进行正常的组织形成。
关于上皮形成素的结构，发现上皮形成素分子在结构上分成4个大的片段(欧洲专利公开第0698666号)。即，构成上皮形成素全长的多肽由N末端一侧起可分为卷曲螺旋区(1)、功能域(2)、卷曲螺旋区(3)、以及C末端的疏水区。这些片段中，关于功能域(人上皮形成素中由N末端起第104号至第187号氨基酸所特定的区)，显示该区与细胞粘着有关，与上皮形成素的生理活性的表达有密切关系(上述欧洲专利公开)。
上皮形成素具有促进正常的形态形成的作用，因此该物质有望用作预防或治疗起因于形态形成异常的疾病等的药物、或毛发生长促进剂等药物的活性组分。
但是，由哺乳动物得到的天然型上皮形成素难溶于生理盐水等水性介质中，难以作为药物实际应用。因此，人们尝试制备实质上保持有天然上皮形成素的形态形成促进作用，且溶解性优异的上皮形成素衍生物。例如国际公开WO 01/94382公开了pep7作为具有上述毛发生长促进活性的肽。在尝试制备这样新型的上皮形成素衍生物过程中，对于毛发生长促进活性的评价是不可或缺的。
用于评价毛发生长促进活性的具体的方法有以下方法。已知C3H或C57BL/6小鼠在出生后45天至95天前后有持续约50天的毛发生长终期。皮肤的颜色在毛发生长终期为粉红色，在生长期为灰色或黑色，因此容易判定毛发周期。使用该小鼠，给予受试物质，评价其是否促进了向生长期的转变，由此可以评价毛发生长促进活性。但是，人们希望开发一种体外更简便且迅速地评价毛发生长促进活性的方法。
发明内容
本发明的课题在于提供毛发生长促进活性评价的方法，该方法采用了在评价毛发生长促进活性时有用、可特异性识别存在于上皮新生毛囊中的蛋白质的抗体；以及含有上述抗体的毛发生长促进活性评价试剂盒。
本发明人为解决上述课题进行了深入地研究，成功地鉴定出在毛周期的生长期强烈表达、可用于判定毛发生长诱导活性的蛋白质的氨基酸序列，并通过使用该蛋白质的抗体，简便且迅速地评价毛发生长促进活性，从而完成了本发明。
即，本发明提供毛发生长促进活性评价的方法，该方法采用了对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段。上述抗体中包含用含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质对除人以外的动物进行免疫而获得的抗体。
优选提供包括下述步骤的毛发生长促进活性评价方法在受试物质存在下培养来自生物体的皮肤组织片；回收该皮肤组织片，使其与对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段反应的步骤；以及检出或测定与皮肤组织片反应的该抗体或其片段的步骤。上述抗体中包含用含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质对除人以外的动物进行免疫而获得的抗体。
本发明的另一方面提供毛发生长促进活性评价试剂盒，该试剂盒包含对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段。上述抗体中包含用含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质对除人以外的动物进行免疫而获得的抗体。
附图简述
图1表示本发明中使用的抗体所识别的抗原的部分序列。
图2表示用本发明的方法评价毛发生长促进活性的结果。
实施发明的最佳方式以下对本发明的实施方式进行详细说明。
(1)使用对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段进行的毛发生长促进活性评价的方法本发明的毛发生长促进活性的评价方法是使用对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段的方法，更具体地说，在受试物质存在下培养来自生物体的皮肤组织片，回收该皮肤组织片，使其与对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段反应，检出或测定与皮肤组织片反应的该抗体或其片段，由此评价毛发生长促进活性。
具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质在数据库(NCIB(GeneBank))中以登记号XM_177952(小鼠，与毛透明蛋白相似)登记，与人毛囊的毛根鞘蛋白毛透明蛋白具有一些同源性。该蛋白质的功能、表达至今尚未为人知，不过本发明证实其在生长期的毛囊中，表达特异性高。已知在生长期的毛囊中有高表达的其它蛋白质有毛发角蛋白、Hac1-1等，将具有毛发生长诱导活性的物质加入皮肤组织的培养系统中，使用抗体研究它们的表达升高情况，发现培养系统中，通过添加毛发生长诱导物质，本发明的蛋白质的表达反应最为敏感(表达升高)。
本发明中使用的抗体的特征是对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别。上述抗体中包含用含有序列表中SEQ IDNo.1的氨基酸序列的蛋白质对除人以外的动物进行免疫而获得的抗体。
本发明中使用的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。本说明书中所述抗体，不仅指全长的抗体，也包括抗体的片段，抗体的片段优选功能性片断，例如有F(ab’)2、Fab’等。
F(ab’)2、Fab’是将免疫球蛋白用蛋白质分解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等)处理来制备，是对存在于铰链区中的2条H链之间的二硫键的前后进行消化而生成的抗体片段。并且，本说明书中所述的抗体片段也包括含有来自编码该抗体的基因的抗原结合部位的蛋白质。
例如，用木瓜蛋白酶处理IgG1，则存在于铰链区中的2条H链之间的二硫键的上游被切断，由VL(L链的可变区)和CL(L链的恒定区)构成的L链、以及由VH(H链的可变区)和CHγ1(L链的恒定区中的γ1区)构成的H链片段，它们可以制备在C末端区通过二硫键结合的同源的2个抗体片段。这2个同源抗体片段分别称为Fab’。另外，用胃蛋白酶处理IgG，则存在于铰链区中的2条H链之间的二硫键的下游被切断，可制备比上述2个Fab’经铰链区连接的片段稍大的抗体片段。该抗体片段称为F(ab’)2。
本发明中，上述抗体可以作为固定于固相载体等不溶性载体上的固定化抗体使用，也可以作为用标记物标记的标记抗体使用。固定化抗体是指通过物理吸附或化学键等，担载于不溶性载体上的状态的抗体。这些固定化抗体可用于检出、定量、分离或纯化试样(例如体毛、毛囊或它们的提取物等)中含有的抗原(含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质)。可用于固定抗体的不溶性载体例如有(1)由聚苯乙烯树脂、聚碳酸酯树脂、硅树脂或尼龙树脂等构成的塑料、或玻璃等所代表的、有水不溶性物质构成的板、试管或管子等具有内容积的载体，珠，球，滤器或膜等，以及(2)纤维素类载体、琼脂糖类载体、聚丙烯酰胺类载体、葡聚糖类载体、聚苯乙烯类载体、聚乙烯醇类载体、聚氨基酸类载体或多孔性二氧化硅系载体等可用于亲和层析的不溶性载体。
标记抗体是指用标记物标记的抗体，这些标记抗体可用于检出获定量试样(例如体毛、毛囊或它们的提取物等)中含有的抗原(含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质)。可用于本发明的标记物只要是通过物理结合或化学键合等结合在抗体上，可以检测它们的存在的物质即可，并没有特别限定。标记物的具体例子有酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、抗生物素蛋白或放射性同位素等，更具体地说，有过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、青霉素酶、过氧化氢酶、脱辅基葡糖氧化酶、脲酶、萤光素酶或乙酰胆碱酯酶等酶；异硫氰酸荧光素、藻胆蛋白、稀土类金属鳌合剂、丹磺酰氯或四甲基罗丹明异氰酸酯等荧光物质；3H、14C、125I或131I等放射性同位素；生物素；抗生物素蛋白；或化学发光物质。标记物与抗体的结合方法可以采用戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶二硫化物法或高碘酸法等公知的方法。
这里，放射性同位素和荧光物质可以产生可单独检测的信号，但酶、化学发光物质、生物素和抗生物素蛋白不会产生可单独检测的信号，因此通过与另一种或以上的物质反应，来产生可检测的信号。例如，当使用酶时，至少需要底物，根据测定酶活性的方法(比色法、荧光法或化学发光法等)，可使用各种底物。另外，当使用生物素时，通常至少与抗生物素蛋白或酶修饰的抗生物素蛋白反应。根据需要，还可以根据该底物使用各种显色物质。
本发明中使用的抗体为单克隆抗体时，可使用杂交瘤制备该单克隆抗体。杂交瘤可通过如下所述的常规方法制备。
首先，以具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质或含有该蛋白质的试样(由生长期的皮肤采集毛，由其中提取蛋白质和/或生长期的触须毛囊等)作为免疫原，免疫哺乳动物，由此在动物体内制备抗体生成细胞。对于哺乳动物的种类没有特别限定，通常有小鼠、大鼠、牛、兔、山羊、绵羊等，优选小鼠、大鼠、兔等啮齿类，更优选小鼠或大鼠。小鼠的例子有A/J系统、BALB/C系统、DBA/2系统、C57BL/6系统、C3H/He系统、SJL系统、NZB系统、CBA/JNCrj系统的小鼠。BALB/C系统的小鼠在制备杂交瘤时，可构建来自同一系统的骨髓瘤的细胞株，因而优选。
免疫前，为了增强免疫应答，免疫原可以与佐剂混合。佐剂的例子有油包水型乳剂(例如不完全弗氏佐剂)、水包油包水型乳剂、水包油型乳剂、脂质体、氢氧化铝凝胶、二氧化硅佐剂、粉末皂土和木薯粉佐剂；除此之外还有BCG、疮疱丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)等菌体、细胞壁以及海藻糖二分支菌酸(TDM)等菌体成分；革兰阴性细菌的内毒素——脂多糖(LPS)和脂质A组分；β-葡聚糖(多糖体)；胞壁酰二肽(MDP)；苯丁抑制素；左旋咪唑等合成化合物；胸腺激素、胸腺激素液性因子和taftsin等来自生物体成分的蛋白质或肽类物质；以及它们的混合物(例如完全弗氏佐剂)等。这些佐剂根据给予途径、给予量、给予时间等而显示对免疫应答的增强或抑制效果。并已证实根据佐剂种类的不同，血液中相对于抗原的抗体生成、细胞免疫的诱导、免疫球蛋白的分类等有差异。因此，优选根据目标免疫应答来适当选择佐剂。通过佐剂进行处理的方法是本领域公知的。
哺乳动物的免疫按照本领域公知的方法进行。例如抗原注射于哺乳动物的皮下、皮内、静脉或腹腔。免疫应答根据接受免疫的哺乳动物的种类和系统而不同，因此免疫时间表可结合所用动物适当设定。抗原的给予要在初次免疫后反复进行几次。追加免疫例如可在初次免疫的4周后、6周后和半年后进行。
免疫后，由哺乳动物采血，对得到的血液进行测定，确定其毛囊结合活性的存在，由此确认在哺乳动物体内生成了毛囊抗体。测定方法有酶联免疫测定法(ELISA法)、放射免疫测定法(RIA)、荧光抗体法等公知的方法。
确认生成了毛囊结合性抗体后，为了使具有特异抗体生成能力的免疫细胞处于适合细胞融合的状态，可以进行加强(追加注射免疫原)。对于加强给予的免疫原的量没有特别限定，优选为初次免疫量的约4-5倍。通常可以使用免疫原和不完全弗氏佐剂的乳液进行加强。给予途径可从皮下、皮内、静脉或腹腔内适当选择。
最终免疫后，从接受了免疫的哺乳动物体内摘除脾细胞，使其与来自骨髓瘤的细胞株进行细胞融合。细胞融合时，优选使用繁殖能力高的细胞株，另外优选来自骨髓瘤的细胞株与来自要融合的脾细胞的哺乳动物具有适应性。来自小鼠骨髓瘤的细胞株有P3U1、P3X63-Ag8.653、Sp2/O-Ag14、FO·1、S194/5.XXOBU.1、P3/NS1/1-Ag4-1等。
细胞融合可按照本领域公知的方法进行。细胞融合的例子有聚乙二醇法、使用仙台病毒的方法、利用电流的方法等。
所得融合细胞可以按照本领域公知的条件使其繁殖。根据生成的抗体的结合力来选择所希望的融合细胞。
由融合细胞产生的抗体的结合力可按照本领域公知的方法测定。本发明中，为了获得生成具有毛囊特异性且高结合力的抗体的融合细胞，根据与毛囊的结合力进行选择，克隆目标细胞株。抗体的结合力的测定与上述关于抗体生成的确认的方法一样，可使用ELISA法、RIA法、荧光抗体法等方法进行测定。ELISA法简便且灵敏度高，因而优选。
融合细胞的克隆可以适用本领域公知的方法进行。克隆方法有有限稀释法、软琼脂法等，有限稀释法操作简便、再现性高，因而优选。为了有效地从细胞融合得到的很多融合细胞中选择高效的有用的细胞，优选细胞的筛选在克隆初期阶段进行。这样，可以最终筛选出生成具有所希望的结合力的抗体的融合细胞株。
如上所述，通过大量培养筛选出的单克隆抗体生成细胞株，可以大量生成本发明中使用的单克隆抗体。单克隆抗体生成细胞株的大量培养的方法有体内或体外培养。在体内的大量培养的例子有将融合细胞注射到哺乳动物的腹腔内，使其繁殖，在腹水中生成抗体的方法。体外培养时，将融合细胞在培养基中培养，在培养基中生成抗体。
可使用本领域公知的方法，由大量培养得到的腹水或培养上清中纯化本发明的单克隆抗体。为了纯化，可以将DEAE阴离子交换层析、亲和层析、硫酸铵分级分离法、PEG分级分离法、乙醇分级分离法等适当组合使用。本发明的抗体可以纯化为约90％的纯度、优选约95％的纯度、更优选约98％的纯度。
使用对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的多克隆抗体时，该多克隆抗体的制备可以按照规定的方法进行。
例如多克隆抗体可如下获得以具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质或含有该蛋白质的试样(由生长期的皮肤采集毛，由其中提取蛋白质和/或生长期的触须毛囊等)作为免疫原，免疫哺乳动物，使其致敏，由该哺乳动物采血，由采集的血液中分离、纯化抗体。例如可以免疫小鼠、仓鼠、豚鼠、鸡、大鼠、兔、狗、山羊、绵羊、牛等哺乳动物。免疫致敏的方法是本行业人员所公知的，例如可通过给予1次或以上的抗原来进行。抗原的给予例如可以是间隔7-30天给予2-3次。给予量可以为每次给予约0.05-2mg左右。给予途径并没有特别限定，可以适当选择皮下给予、皮内给予、腹膜腔内给予、静脉内给予或肌内给予等，优选通过静脉、腹腔内或皮下注射给予。另外，抗原可以溶解于适当的缓冲液、例如含有完全弗氏佐剂或氢氧化铝等通常使用的佐剂的适当的缓冲液中，但根据给予途径、条件等，也可以不使用佐剂。
将免疫致敏的哺乳动物饲养一定期间，然后取该哺乳动物的血清，测定抗体滴度。如果抗体滴度升高，则例如使用10μg-1000μg的抗原进行追加免疫。最终给予1-2个月后，由免疫致敏的哺乳动物中采血，将该血液通过离心，使用硫酸铵或聚乙二醇的沉淀，凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等层析等常规方法进行分离纯化，可以多克隆抗血清的形式得到本发明的识别蛋白质的多克隆抗体。例如对血清在56℃处理30分钟，可以使其补体系统失活。
本发明的毛发生长促进活性评价方法只要是使用上述抗体进行测定、即免疫测定即可，可以是任意的方法，例如有蛋白质印迹法、酶联免疫测定法(ELISA)、荧光免疫测定法、放射免疫测定法(RIA)、发光免疫测定法、免疫酶法、免疫荧光法、免疫比浊度法、乳胶凝集反应、乳胶比浊度法、红细胞凝集反应或颗粒凝集反应等。
接受本发明的评价方法的受试物质的种类并没有特别限定，可以是寡肽，也可以是低分子有机化合物。例如可以使用具有已证实具有毛发生长促进活性的上皮形成素的部分氨基酸序列的寡肽等。
通过酶联免疫测定法、荧光免疫测定法、放射免疫测定法或发光免疫测定法等使用标记抗体的免疫测定法而实施本发明的毛发生长促进活性的评价方法时，可通过夹心法或竞争法进行，通过夹心法进行时，只要固相抗体或标记抗体中的至少一种为本发明的抗体即可。
固相载体与固相抗体相关，可以使用本说明书中作为不容性载体的具体例子而记载的载体。另外标记物与标记抗体相关，可以使用本说明书中记载的物质。
测定的操作方法可通过公知的方法(北川常广等人编《蛋白质核酸酶另册No.31酶联免疫测定法》，共立出版，1987年等)。
例如，可使固相抗体与试样反应，同时与标记抗体反应，或洗涤后与标记抗体反应，形成固相抗体-抗原-标记抗体的复合物。然后洗涤分离未结合的标记抗体，由结合的标记抗体的量测定试样中的抗原量。具体来说，采用酶联免疫测定法(ELISA)时，在最佳条件下使底物与标记酶反应，通过光学方法测定该反应产物的量。采用荧光免疫测定法时，测定荧光标记物产生的荧光强度；采用放射免疫测定法时，测定放射性标记物产生的放射线的量。采用发光免疫测定法时，测定发光反应系统产生的发光量。
通过用光学方法或用目视的测定方法对免疫比浊度法、乳胶凝集反应、乳胶比浊度法、红细胞凝集反应或颗粒凝集反应等生成的免疫复合物凝集物进行其透射光和散射光的测定，从而实施本发明的检出和/或定量方法时，采用目视测定方法时，可以使用磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液或Good缓冲液等作为溶剂，还可以使其含有聚乙二醇等反应促进剂或非特异性反应抑制剂。
使固相载体致敏来使用抗体时，固相载体可以使用由聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯类聚合物、乳胶、明胶、脂质体、微胶囊、红细胞、二氧化硅、氧化铝、碳黑、金属化合物、金属、陶瓷或磁性体等材质构成的颗粒。
该致敏方法可以使用物理吸附法、化学结合法或将这些方法联合使用等公知的方法。测定的操作法可通过公知的方法进行，例如通过光学方法进行测定时，使试样与抗体、或使试样与致敏了固相载体的抗体反应，通过终点法或比例法测定透射光或散射光。
另外，目视测定时，在孔板或微量滴定板等容器中，使试样与致敏固相载体的抗体反应，目视判定凝集的状态。也可以使用微量滴定板读数仪等机器测定，以代替目视测定。
(2)包含对含有序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段的毛发生长促进活性评价试剂盒本发明的试剂盒含有对含有序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段。这里所述的单克隆抗体、多克隆抗体或其片段也可以是本说明书中所述的固定抗体或标记抗体。
例如，将含有本发明提供的对含有序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体作为初次抗体使用时，本发明的试剂盒中可以含有用于检出抗原抗体结合反应形成的复合物的二次抗体。为了可以高效且简便地利用，本发明的试剂盒中还可以含有除这些抗体以外的各种助剂。助剂例如有溶解固体状二次抗体的溶解剂、用于洗涤不溶载体的洗涤剂、使用酶作为抗体的标记物时用于测定酶活性的底物、其反应终止剂等免疫学测定试剂盒中通常所使用的试剂。本发明的试剂盒还可以含有用于进行毛发生长促进活性评价的说明书。
实施例以下，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明的范围并不受实施例限定。
实施例1在毛发周期的生长期中强烈表达的蛋白质(1)表达文库的构建按照TRIZOL(GIBCO15596-018)所附的手册，使用TRIZOL，从处于毛发周期生长期(出生后35天)的C57BL小鼠背上制备总RNA。使用Amersham Pharmacia制造的Quick PrepTM微量mRNA纯化试剂盒，由制备的总RNA中制备mRNA(20μg)。使用5μg mRNA，使用AmershamPharmacia制造的Time Saver cDNA合成试剂盒27-9262-01中的随机引物合成cDNA。由于使用了试剂盒所附的连接物，因此制备的cDNA的两端具有EcoRI和NotI位点。将所得cDNA插入Amersham Pharmacia制造的λExCell EcoRI/CIP(27-5011-01)，构建表达文库。
用上述制备的表达文库感染大肠杆菌MN522，撒LB板上，获得2万噬菌斑/板。将LB板浸渍于10mM的IPTG溶液中，使其风干。其上覆盖硝基纤维素，静置过夜。
(2)新生毛囊特异性单克隆抗体的制备从B57BL小鼠的生长期(第48天至第50天)的皮肤上取毛，在含有8M尿素、2％SDS、100mM DTT的PBS中、在37℃孵育过夜，提取蛋白质。另外，通过实体显微镜采集B57BL小鼠触须毛囊(毛球部附着色素的部分；生长期)，在PBS中匀浆。将上述2种试样(蛋白质量为0.5mg)混合，再与等量的完全佐剂混合，制备胶团。
将上述得到的胶团(0.2mg)分开给予大鼠(Wister)的皮下(3处)，进行免疫。初次免疫1个月后，与上述同样地进行追加免疫。再在2周后与上述同样地进行第2次追加免疫。第2次追加免疫3天后，取出免疫大鼠的脾，用筛孔回收血细胞成分。该血细胞成分中含有抗体生成细胞。用聚乙二醇1500将上述回收的血细胞成分(总量)和小鼠骨髓瘤P3U1(Dulbecco/Hum F12混合培养基)混合，悬浮于Dulbecco/Hum F12混合培养基中(107细胞/ml)，铺于96孔板，使每孔为100μl。第二天，向各孔中加入等量(100μl)的HAT培养基(Sigma)。2天后由各孔中分别吸取150μl并舍弃，向各孔中加入150μl新培养基。将96孔板在37℃的CO2培养箱内静置。
使用超声波粉碎机，将生长期的B57BL小鼠触须毛囊溶解于8M尿素中。将硝基纤维素膜浸渍该溶液中5分钟，用PBS充分洗涤，将其装入Biorad斑点印迹仪，使用该膜，对由上述96孔板的各孔中回收的杂交瘤上清进行初次筛选。首先，将上述制备的装入Biorad斑点印迹仪的硝基纤维素膜用溶解了5％脱脂乳的Tris缓冲液(TBST)进行阻断，然后向96孔板的各孔中添加100μl杂交瘤上清。培养1小时后，用Tris缓冲液洗涤，添加二次抗体——辣根过氧化物酶标记抗大鼠IgG(以1mg/ml溶解于TBST中)。添加显色底物ECL试剂，通过有无显色来筛选与生长期的触须毛囊反应的抗体(共50种)(初次筛选)。
使用生长期触须毛囊的冷冻切片(10μm)，从由上述初次筛选选出的抗体(50种)中选出有特异性反应的抗体(二次筛选)。具体来说，将生长期触须毛囊的冷冻切片置于载玻片上，添加由初次筛选选出的杂交瘤上清，用二次抗体使其显色。具体讲，将由恒冷箱切片机(Bright)制备的生长期触须毛囊的冷冻切片在-20℃用甲醇处理，用TBST进行1小时的阻断，然后与杂交瘤上清反应1小时。用Tris缓冲液洗涤，然后与FITC标记抗大鼠IgG(以100μg/ml溶解于TBST中)反应。用Tris缓冲液洗涤，然后盖上盖玻片，用荧光显微镜进行观察。
二次筛选的结果，共选出了8种抗体。这些抗体不与表皮进行反应，与毛囊特异性反应。用有限稀释法克隆这8种抗体。
以生长期触须毛囊或终止期触须毛囊为样品，通过蛋白质印迹法对这8种抗体的反应性进行了研究，并使用正在形成毛囊的14日龄小鼠胎儿皮肤的切片试样对这8种抗体的反应性进行了研究。结果获得了与生长期毛囊和正在形成的毛囊(新生毛囊)特异性反应，与终止期触须毛囊不反应的单克隆抗体——mAb27。生成单克隆抗体mAb27的杂交瘤于2001年11月2日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东一丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-18578；于2002年7月22日转为国际保藏，保藏号FERM BP-8121。
(3)免疫筛选使用上述(2)中制备的单克隆抗体mAb27，对上述(1)中构建的大肠杆菌的表达文库进行免疫筛选。具体说，展开30万个文库(2万噬菌斑/板)，使渗入了IPTG的硝基纤维素紧密贴附于噬菌斑，转印表达基因产物。用1％脱脂乳/TBS(STBS)阻断该硝基纤维素，然后与10μg/ml的mAb27、HRP标记抗大鼠IgG(Amersham)一起培养，用ECL(Amersham)检出。
回收6个所得阳性克隆，确定其核苷酸序列，结果6个克隆全部含有共有序列(图1)。
实施例2数据库检索对实施例1中鉴定出的共有序列(图1)进行数据库检索(NCIB(GeneBank))，结果符合检索号XM_177952(小鼠，与毛透明蛋白相似)。检索号XM_177952的氨基酸序列SEQ ID No.1表示，核苷酸序列SEQ ID No.2表示。图1中的氨基酸序列与SEQ ID No.1中的氨基酸序列第800个-第1135个相对应。只是，SEQ ID No.1中的氨基酸序列第1133个的Leu在图1中为Gln，SEQ ID No.1中的氨基酸序列第1135个的Arg在图1中为His。
实施例3重组蛋白的制备(1)通过PCR制备全长cDNA使用寡聚dT引物和逆转录酶，由生长期皮肤的mRNA构建cDNA文库。以该cDNA文库为模板，使用2种引物5’-atgtctccacttataagaagcattgtagat-3’(SEQ ID No.3)和5’-ttaagggcggtattgagacctctgctcctg-3’(SEQ ID No.4)进行PCR，由此克隆全长cDNA。使用LA TaqTM(Takara)试剂盒，PCR反应条件为94℃1分钟、94℃30秒、60℃30秒、72℃2分钟，将目标cDNA扩增30个循环。
所得克隆含有编码SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的全长cDNA。
(2)转化将上述(1)中得到的PCR产物插入pTarget vector(Promega)，构建重组表达载体，转染宿主细胞COS-1细胞。使用脂转染胺试剂(GIBCO)，按照所附说明书进行转染。COS-1胞在添加了10％FCS的Dalbecco’s Ham F12培养基中培养。
(3)重组蛋白的提取(a)亲和柱的制备将Afigel 10(Biorad)置于4℃，使凝胶均匀，装入布氏漏斗进行过滤。用凝胶的3倍量、4℃的脱离子水洗涤。洗涤后将凝胶装入烧瓶，加入溶解于PBS的单克隆抗体mAb27的溶液(相对于1ml凝胶，使用0.5ml抗体溶液)。充分搅拌，使其悬浮，一边直接用振荡机缓慢搅拌一边在室温下反应1小时。离心舍去上清，用PBS调节为10ml。每1ml凝胶中加入0.1ml 1M甘氨酸乙酯(pH8)，反应1小时。反应后，将凝胶填充Ecopac柱(Biorad、最大20ml)，用蒸馏水洗涤，直至OD260不能检出反应物。最后，用洗脱液(10mMTris-HCl、1mM MgCl2、1mM EDTA、蛋白质抑制混合剂(Roche、商品名CompleteMini)、0.15M NaCl、0.5％ TritonX-100，用HCl调节为pH 3.0)洗涤。
(b)抗原的纯化在转染的第3天，将表达实施例2中制备的全长cDNA的COS-1细胞的转化体回收，用PBS洗涤，然后加入到100ml 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM MgCl2、1mM EDTA和蛋白质抑制混合剂(Roche、商品名CompleteMini)的混合液中，用匀浆器充分粉碎。接着添加NaCl，使终浓度为0.15M；添加TritonX-100，使终浓度为0.5％，用搅拌器在4℃搅拌3小时。以25000rpm离心10分钟，回收上清，由细胞中提取蛋白质。将100ml所得提取液过上述(1)中制备的亲和柱。
用洗涤液(10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM MgCl2、1mM EDTA、蛋白质抑制混合剂(Roche、商品名CompleteMini)、0.15M NaCl、0.5％TritonX-100)洗涤，然后将洗脱液(将洗涤液用HCl调节至pH 3.0的液体)加到柱中，各回收2ml洗涤液，回收含有蛋白质的流分，其在OD280nm处有吸收。
(c)通过纯化抗原的电泳测定分子量将上述(b)中回收的含蛋白质流分在SDS-PAGE上进行电泳，进行使用单克隆抗体mAb27的蛋白质印迹分析，结果，在220kDa的位置检出带。另外，将上述(b)中回收的含蛋白质流分在SDS-PAGE上进行电泳，将电泳凝胶用考马斯蓝染色，切出220kDa带，由此制备纯化抗原。
实施例4对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的多克隆抗体的制备将实施例3中制备的纯化抗原(即包含含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质的切出的凝胶)回收到20％乙醇中，放置过夜。回收凝胶，将最高含有约100μg蛋白质的试样与Titer Max Gold(CytRX制佐剂)混合，制备乳液，在2个月内对大鼠进行免疫(共3次)。初次免疫的2个月后，从大鼠采血，按照规定的方法制备血清，可以获得对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的多克隆抗体。
实施例5使用对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的多克隆抗体进行毛发生长促进活性的评价评价人的角质形成细胞的分化。由SankoJunyaku购入人角质形成细胞(为皮肤的细胞，混有表皮角化细胞和来自毛囊的细胞等)。细胞存放于培养液中，向细胞培养液中添加ssb7(Ser-Ile-Glu-Gln-Ser-Cys-Asp-Gln-Asp-Glu(SEQ ID No.5)的N末端生物素化(NHS-生物素，Pierce)，将其进行s-s交联而形成的肽)，使其浓度为20μM，在96孔板培养1周。由孔中回收细胞，回收到100μl SDS样品缓冲液(0.02g/ml SDS、0.2g/ml甘油、pH6.8)，通过超声波粉碎机进行溶解。对对照(未添加ssb7培养1周的人角质形成细胞)也同样处理。将上述处理得到的溶液进行SDS-PAGE(丙烯酰胺4-20％)电泳(35mA、1.5小时)，然后转印PVDF膜，在含5％脱脂乳的Tris缓冲液(TBST)中孵育1小时。与SEQ ID No.1的氨基酸序列的部分长、即具有图1的氨基酸序列的蛋白质的单克隆抗体(将血清稀释为1/100所得)反应1小时，然后用TBS充分洗涤，用TBST将过氧化物酶标及抗大鼠IgG(Amersham)稀释为1/1000，以此作为二次抗体反应，充分洗涤，然后用ECL试剂盒(Amersham)研究多克隆抗体的反应强度。
所的结果如图2的右图所示。
图2的右图中，右边的泳道表示对照的结果，右边的泳道表示添加了毛发生长促进剂EPM(ssb7)的结果。图中的AHF表示含有序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质。由图2的结果可知在添加了毛发生长促进剂EPM(ssb7)的样品中，检出了比对照强的条带。这反映出含有序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质的表达量增加。
与上述同样地，通过RNA印迹，对含有序列表SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质在RNA水平的表达。具体来说，首先从背部皮肤中制备总RNA，将10μg总RNA在琼脂糖凝胶中进行电泳，转印到尼龙膜上(HibondN+)(Amersham)。接着，通过DIG(Roche)向AHFcDNA的翻译区引入标志，准备好后，以其为探针，检测转移到上述尼龙膜上的AHFmRNA。
所的结果如图2的左图所示。与图2的右图同样，在添加了毛发生长促进剂EPM(ssb7)的样品中，检出了比对照强的条带。
产业实用性可以通过本发明的方法对受试物质的毛发生长促进活性进行有效的评价。
序列表<110>住友电气工业株式会社<120>毛发生长促进活性的评价方法<130>A31583A<160>5<210>1<211>1439<212>PRT<213>小鼠(饲养小鼠)<400>1Met Ser Pro Leu Ile Arg Ser Ile Val Asp Ile Thr Glu Val Phe Asn1 51015Gln Tyr Ala Ser Gln Ser Cys Asp Gly Ala Ser Leu Ser Lys Lys Asp20 25 30Leu Lys Asn Leu Leu Glu Arg Glu Leu Gly Asp Val Leu Gln Arg Pro35 40 45His Asp Pro Glu Thr Ile Asp Leu Thr Leu Glu Leu Leu Asp Arg Asp50 5560Cys Asn Gly Arg Val Asp Phe Asn Glu Phe Leu Leu Phe Leu Phe Lys65 70 75 80Ile Ala Gln Ala Cys Tyr Tyr Ala Leu Asp Gln Ala Ala Glu Leu Gly85 90 95Glu Lys Arg Ala Leu Pro Asn Glu Lys Arg Asn Leu Ser Gln Asp Arg100 105 110Arg Gln Glu Asp Gln Arg Arg Phe Glu Pro Arg Ser Arg Gln Leu Asp115 120 125Glu Glu Pro Gly Arg Arg Ser Trp Gln Lys Arg Arg Glu Gln Glu Glu
130 135 140Arg Ala Glu Glu Gln Arg Leu Glu Gln Arg Tyr Arg Gln His Arg Asp145 150 155 160Glu Glu Gln Arg Leu Gln Arg Arg Glu Leu Gln Glu Leu Glu Glu Arg165 170 175Leu Ala Glu Lys Glu Pro Leu Gly Trp Ser Lys Gly Arg Asp Ala Glu180 185 190Glu Phe Ser Glu Val Glu Glu Gln Gln Arg Gln Glu Arg Gln Glu Leu195 200 205Lys Gly Lys Gly Gln Thr Glu Glu Arg Arg Leu Gln Lys Arg Arg Gln210 215 220Glu Glu Leu Arg Glu Pro Leu Leu Arg Arg Asp Leu Glu Leu Arg Arg225 230 235 240Glu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Gln Arg Arg245 250 255Glu Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg260 265 270Glu Gln Glu Leu Asn Arg Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu275 280 285Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu290 295 300Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu305 310 315 320Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu325 330 335Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu340 345 350
Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu Leu Ala Glu Glu Asp Glu Leu355 360 365Thr Arg Ile Arg Glu Pro Asp Glu Ser Ile Thr Gln Arg Trp Gln Trp370 375 380Gln Leu Glu Asn Glu Ala Asp Ala Arg Gln Asn Lys Val Tyr Ser Arg385 390 395 400Pro Ser Arg Gln Glu Gln Arg Leu Arg Gln Glu Leu Gly Glu Arg Gln405 410 415Leu Arg Glu Gln Glu Glu Gln Arg Arg Asp Leu Gln Gln Glu Arg Pro420 425 430Ala Glu Glu Ala Arg Gln Arg Asn Gln Trp Glu Arg Pro Gln Arg Ala435 440 445Glu Glu Arg Leu Glu Gln Glu Gln Arg Phe Arg Asp Arg Glu Glu Gln450 455 460Arg Phe Arg Glu Glu Lys Leu Gln Arg Ala Glu Leu Gln Asp Ser Leu465 470 475 480Leu Asp Glu Glu Gln Arg Arg Leu Gln Glu Glu Arg Arg Glu Pro Asn485 490 495Arg Ser Arg Gln Leu Arg Glu Glu Ser Gln Arg Arg Arg Thr Leu Tyr500 505 510Ala Lys Pro Ser Gln Arg Gln Gln Arg Arg Arg Leu Gln Gln Glu Arg515 520 525Gln Tyr Gln Glu Glu Asp Leu Gln Arg Leu Arg Asp Glu Asp Gln Arg530 535 540Arg Asp Leu Lys Trp Gln Trp Gln Pro Arg Lys Glu Asn Glu Val Arg545 550 555 560Ser Asn Arg Leu Phe Thr Lys Arg Arg Gly Asp Glu Glu Pro Ile Gln
565 570 575Gln Leu Glu Asp Ser Gln Glu Arg Glu Arg Arg Gln Asp Arg Arg Pro580 585 590Leu Gln Asp Glu Glu Glu Glu Lys Arg Glu Leu Glu Gln Glu Arg Arg595 600 605Arg Arg Gln Gln Arg Asp Arg Gln Ile Leu Glu Glu Glu Gln Phe Gln610 615 620Arg Glu His Gln Arg Glu Ala Arg Arg Arg Asp Glu Thr Phe Gln Glu625 630 635 640Glu Glu Gln Leu Gln Gly Glu Ser Arg Arg Arg Gln Gln Glu Arg Glu645 650 655Gly Lys Phe Leu Glu Glu Glu Arg Gln Leu Arg Thr Glu Arg Glu Glu660 665 670Gln Arg Arg Arg Gln Glu Gln Glu Arg Glu Phe Gln Glu Glu Glu Glu675 680 685His Leu Gln Glu Arg Glu Lys Glu Leu Arg Gln Glu Cys Asp Arg Lys690 695 700Ser Arg Glu Gln Glu Arg Arg Gln Gln Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg705 710 715 720Arg Gln Glu Arg Asp Gln Arg Phe Arg Arg Glu Gln Glu Arg His Leu725 730 735Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Ser Arg Arg Glu Gln740 745 750Glu Arg His Gln Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Ser755 760 765Arg Arg Glu Gln Glu Arg His Gln Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg770 775 780
Asp Arg Pro Ser Arg Arg Glu Gln Glu Arg His Gln Glu Arg Glu Glu785 790 795 800Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Phe Arg Arg Glu Gln Glu Arg Arg Leu805 810 815Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Ser Arg Arg Glu Gln820 825 830Glu Arg His Gln Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg Asp Arg Pro Ser835 840 845Arg Arg Glu Gln Glu Arg Arg Leu Glu Arg Glu Glu Glu Gln Leu Arg850 855 860Asp Arg Ser Phe Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Arg Asp Arg Lys Phe865 870 875 880His Glu Glu Glu Glu Arg Arg Glu Glu Leu Glu Glu Glu Gln Arg Gly885 890 895Gln Glu Arg Asp Arg Leu Arg Val Glu Glu Gln Leu Arg Gly Gln Arg900 905 910Glu Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln Glu Cys Asp Arg Lys Leu His Arg915 920 925Glu Leu Glu Val Arg Gln Glu Leu Glu Glu Glu Arg Leu Arg Asp Arg930 935 940Lys Leu Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Arg Asp Arg Lys Phe His Glu945 950 955 960Glu Glu Glu Arg Arg His Glu Glu Phe Glu Glu Lys Gln Leu Arg Leu965 970 975Gln Glu Pro Asp Arg Arg Phe Arg Arg Glu Gln Glu Leu Arg Gln Glu980 985 990Cys Val Glu Glu Glu Arg Leu Arg Asp Ser Lys Ile Arg Arg Glu Gln
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Phe Arg Phe Glu Glu Gln Gln Arg Arg Arg Gln Glu Arg Glu Gln Gln1220 1225 1230Leu Arg Gln Glu Arg Asp Arg Arg Val Leu Glu Glu Glu Glu Leu Arg1235 1240 1245Gln Glu Arg Glu Glu Leu Leu His Arg Gln Val Gly Gly Arg Lys Phe1250 1255 1260Arg Glu Glu Glu Arg Leu Arg Leu Glu Arg Glu Glu Gln Gln Arg Arg1265 1270 1275 1280Leu Gln Glu Arg Asp Asn Arg Arg Phe Arg Glu Glu Val Glu Leu Arg1285 1290 1295Gln Glu Arg Glu Gly Gln Gln Leu Arg Gln Glu Arg Asp Arg Lys Phe1300 1305 1310Arg Glu Val Glu Glu Leu Arg Gln Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln Glu1315 1320 1325Arg Asp Arg Lys Phe Arg Glu Glu Lys His Pro Arg Glu Glu Arg Glu1330 1335 1340Glu Gln Gln Leu Arg Arg Glu Lys Arg Asp Gly Gln Tyr Leu Ala Glu1345 1350 1355 1360Glu Gln Phe Ala Arg Asp Thr Ile Arg Arg Gln Glu Gln Glu Leu Arg1365 1370 1375Gln Glu Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln Glu Arg Glu Arg Lys Phe Gln1380 1385 1390Glu Glu Gln Ile Arg Arg Arg Gln Glu Glu Gln Arg Arg Arg Gln Ile1395 1400 1405Leu Glu Pro Gly Thr Arg Gln Phe Ala Asn Val Pro Val Arg Ser Ser1410 1415 1420Pro Leu Tyr Glu Tyr Ile Gln Glu Gln Arg Ser Gln Tyr Arg Pro
1425 14301435<210>2<211>4320<212>DNA<213>小鼠(饲养小鼠)<400>2atgtctccac ttataagaag cattgtcgat atcactgaag ttttcaatca atatgcatca 60caaagttgtg atggagcatc acttagcaag aaagacctga aaaacctcct tgagagagaa 120cttggagatg tccttcagag accacatgac cctgagacga tagacctgac cctagaactt 180ctggatcgcg actgcaacgg gcgtgttgat ttcaacgaat tcctcctgtt ccttttcaag 240attgctcaag cttgctatta tgctctcgat caggccgcag agctaggcga gaagagagcc 300ctgcccaatg aaaagaggaa cctgtcacaa gatcgcaggc aagaagacca aaggagattc 360gagccccgaa gcagacaact ggacgaagaa cctgggcgcc gaagctggca gaagagacgt 420gagcaggagg agcgcgctga ggagcagcgg ctggagcagc gctacaggca gcaccgcgat 480gaagagcaga gactgcaaag gcgagaactg caagaactgg aggaacgcct tgcagagaaa 540gagccgcttg gctggagtaa gggtcgtgac gcggaggagt tttctgaggt agaggaacag 600caaaggcaag agaggcagga actcaagggc aagggccaaa cagaagagag aaggctgcag 660aagcgcaggc aagaagagct acgcgaaccc ctgctaaggc gcgatctgga gttgaggcgc 720gaacaagagc taaggcgcga gcaggagttg aggcaggaac agaggcgcga gcaggagcta 780aggcgcgagc aggagctgag gcaagagctg aggcgcgagc aggagctgaa tcgaaggcag 840gagctgaggc gcgaacaaga gctaaggcgc gagcaggagc tgaggcagga gctgaggcgc 900gagcaggagc taaggcgcga gcaggagttg aggcaggaac tgaggcgcga gcaagagcta 960aggcgcgagc aggagttgag gcaggaactg aggcgcgagc aagagctaag gcgcgagcag 1020gagttgaggc aggaactgag gcgtgagcaa gagctaagac gcgagcaaga gctgaggcag 1080gagctggctg aggaggacga gctgacgcgg atccgggaac ccgacgagag cattacccag 1140aggtggcagt ggcagctcga aaacgaggca gacgcccgtc agaacaaggt ctactctagg 1200cctagcaggc aggagcagag gcttcgccag gagctggggg agcgtcagct ccgggagcag 1260
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<213>合成DNA<400>3atgtctccac ttataagaag cattgtagat30<210>4<211>30<212>DNA<213>合成DNA<400>4ttaagggcgg tattgagacc tctgctcctg30<210>5<211>10<212>PRT<213>合成肽<400>5Ser Ile Glu Gln Ser Cys Asp Gln Asp Glu1 5 10
权利要求
1.毛发生长促进活性的评价方法，该方法采用对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段。
2.权利要求1的毛发生长促进活性的评价方法，该方法使用将含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质对除人以外的动物进行免疫而得到的抗体或其片段。
3.权利要求1的毛发生长促进活性的评价方法，该方法包括在受试物质存在下培养来自生物体的皮肤组织片的步骤；回收该皮肤组织片，使其与对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段反应的步骤；以及检出或测定与皮肤组织片反应的该抗体或其片段的步骤。
4.权利要求3的毛发生长促进活性的评价方法，该方法使用将含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质对除人以外的动物进行免疫而获得的抗体或其片段。
5.毛发生长促进活性评价试剂盒，该试剂盒包含对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段。
6.权利要求5的毛发生长促进活性评价试剂盒，该试剂盒包含将含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质对除人以外的动物进行免疫而获得的抗体或其片段。
全文摘要
本发明的目的在于提供毛发生长促进活性评价的方法，该方法使用在评价毛发生长促进活性时有用、可特异性识别存在于上皮新生毛囊中的抗原的抗体；还提供含有上述抗体的毛发生长促进活性评价试剂盒。本发明提供使用对含有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列的蛋白质进行识别的抗体或其片段进行毛发生长促进活性评价的方法。
文档编号C07K16/18GK1723391SQ20048000025
公开日2006年1月18日 申请日期2004年1月7日 优先权日2003年1月8日
发明者武部京子, 平井洋平 申请人:住友电气工业株式会社