专利名称：用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，具体涉及天然物质的提取分离领域。
背景技术：
脱落酸(Abscisic acid)是一种具有全面生理功能的内源植物激素。随着对脱落酸生理功能研究的深入，到目前已证实它在植物的生长发育过程中起多方面作用，如对种子的发育和成熟、环境逆因子的应答，以及基因表达的调控等诸多方面具有重要的调节功能。能促进果实类、谷类、豆类等的成熟发育，能大幅度提高其产量和质量，又能大大增强其耐寒、抗旱和抗盐碱能力。然而天然脱落酸来源一直受到极大的限制，尤其是要获得高纯度，可以用于植物生理功能研究的天然脱落酸就更困难。因此现在高纯度天然脱落酸的价格仍然极高，2005年，美国Sigma公司的98％天然脱落酸(商品号A4906-1MG)1毫克价格为人民币3600元。
脱落酸有两种光学构型，但具有生理功能、存在于植物体内的天然脱落酸光学构型为(s)-(+)-脱落酸，其结构式为 (+)-2-顺式-4-反式-脱落酸而据报道人工合成脱落酸得到的是外消旋体，生物活性较低。
至今报道的天然脱落酸制备都是利用植物原料提取和微生物发酵生产。
利用植物原料提取天然脱落酸，首先将植物细胞磨碎，用有机溶剂抽提，碳酸氢钠水溶液萃取，提取液浓缩，再进行多种柱层析后，结晶得到天然脱落酸。该方法提取过程繁琐，而且由于每1公斤干植物仅含1-0.5毫克天然脱落酸，其植物中的天然脱落酸含量很低，因此用植物提取天然脱落酸势必耗费大量的植物资源，成本也高。
近二十年来，微生物学专家一直在研究利用微生物发酵法生产天然脱落酸，现已有通过用微生物进行液体发酵和固体发酵生产天然脱落酸的报道，主要采用了固体发酵、液体批次发酵和连续流加补料出料工艺等多种发酵方法，如JP-A-63-296697公开的固体培养法的含量为82mg/100g培养基，微生物发酵15天然脱落酸的浓度为63mg/升发酵液(JP-A-3-6139)；最高的产量达300mg/升发酵液(如JP-A-6-247927、JP-A-6-197775)。由于天然脱落酸的发酵产量一直比较低，因此，“微生物发酵生产脱落酸”的方法是各家的研究方向，其重点在于菌株的筛选和培养，有关从微生物发酵产物中分离提取天然脱落酸的工作开展得不多，尤其从微生物发酵液中提取天然脱落酸的方法报道更少。例如，JP-A-60-6629公开的用大量溶剂萃取天然脱落酸，其产品收率约54％。JP-A-3-6139公开的产品收率为73％。而且高纯度天然脱落酸的提取方法涉及很少。因此，直到现在高纯度天然脱落酸的制备都没有一种简单有效的方法，长期以来高纯度天然脱落酸的较高售价，极大地影响了天然脱落酸用于对植物生理作用方面的研究，从而影响了天然脱落酸这种具有全面生理功能的内源植物激素在农业生产上的应用。
本发明人通过多年对“微生物发酵生产脱落酸”方法的研究，针对微生物发酵生产天然脱落酸方法中存在的发酵产率低、收率低、生产成本高等不足，筛选得到产天然脱落酸的高产菌株，并且优化了发酵工艺，突破了发酵技术这一关(见CN1182798)，天然脱落酸的最高产量达到1.2克/升发酵液，该发酵水平已接近或达到了工业化开发的要求。虽然在微生物发酵生产天然脱落酸的产量和规模都取得了显著进步，但是，还需要解决如何简单、有效、低成本地从发酵液中将天然脱落酸提取出来，以及如何对较高纯度的天然脱落酸进行进一步的精制，提取高纯度的天然脱落酸，满足国内外学者研究植物生理作用时对高纯度天然脱落酸的需求，提供较低价格的天然脱落酸标准品。
发明内容
针对以上问题，在取得了微生物发酵生产天然脱落酸的发酵产物规模化提取工艺(专利申请号200410040681.0)的基础上，发明人对提取高纯度天然脱落酸的方法进行了大量的研究，通过反复试验得到了一种工艺成本低，产品纯度高的从微生物发酵液中提取天然脱落酸方法，从而完成了本发明。
本发明公开了一种用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法。
本发明所述的用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中天然脱落酸提取方法指的就是从液体发酵液中将天然脱落酸分离、浓缩、纯化精制的过程。
本发明可以通过以下方式得以实现将能发酵产生天然脱落酸的微生物，通过液体深层定向培养得到含有天然脱落酸的发酵液酸化后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附后用有机溶剂洗脱，洗脱液经浓缩后硅胶拌料进行硅胶层析，用体积比为8/1-1/2的氯仿/乙酸乙酯或石油醚/乙酸乙酯混合液进行洗脱，洗脱液浓缩后得到天然脱落酸粗品；天然脱落酸粗品用溶剂溶解后，用反相色谱柱进行柱层析，洗脱剂采用不同比例的甲醇与水或乙醇与水混合液，收集不同比例的洗脱溶液，减压浓缩，冷却结晶，真空干燥，制得98％以上天然脱落酸结晶体。
本发明中的发酵液是用能生产天然脱落酸的微生物(如葡萄孢霉属、尾孢霉属等)通过液体发酵得到的。
发酵液的酸化是加入硫酸或盐酸处理0-5小时，最优处理时间范围为0.5-3小时，控制发酵液的Ph值范围为2.0-5.0。
发酵液酸化后过滤除去杂质，利用101大孔阳离子交换吸附树脂吸附发酵液中的天然脱落酸组分，再用有机溶媒如40-85％的甲醇水溶液或50-95％的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱。
洗脱液经减压浓缩后硅胶拌料进行硅胶层析，浓缩后得到天然脱落酸粗品。
在天然脱落酸粗品中加入一定比例的甲醇与水或乙醇与水混合溶剂，用反相色谱柱进行柱层析，载体为ODS-A型C18硅胶(50μm，120，日本YMC化学公司)，收集不同比例的洗脱溶液，减压浓缩，冷却结晶，真空干燥，制得98％以上天然脱落酸结晶体。反相色谱洗脱收集液，采用薄层层析或高压液相色谱检测识别。
由于天然脱落酸是光敏化合物，整个操作过程都在避光条件下进行，减少或避免天然脱落酸的异构及分解，提高天然脱落酸的回收率和纯度。
本方法与现有报道的提取方法相比，本发明具有如下优点1、提取方法简单合理、可行；2、本方法首次采用反相色谱分离提取微生物发酵液中的天然脱落酸。
3、本方法第一步用离子交换层析吸附发酵液中的天然脱落酸，方法简单，天然脱落酸吸附率高，达到95％以上。并且，随后再经硅胶层析，使用反相色谱分离提取高纯度天然脱落酸成为了可能。
4、本发明方法得到的高纯度天然脱落酸产品，纯度大于98％，收率大于60％。
5、本方法的提取过程中纯度小于98％的天然脱落酸易于回收，作为天然脱落酸原药，因此本提取方法天然脱落酸总收率大于83％。
下面结合附图详细说明本发明方法发酵液经酸化后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附后用有机溶剂如甲醇或乙醇洗脱，洗脱液经浓缩后硅胶拌料，硅胶柱层析，洗脱液减压蒸馏，浓缩至干得粗品。
用甲醇与水混合溶剂溶解粗品，进行反相色谱柱层析分离，甲醇与水或乙醇与水混合溶剂进行洗脱，收集液中含有高纯度天然脱落酸部分合并，浓缩结晶，真空干燥，制得98％以上的高纯度天然脱落酸结晶体。结晶母液及其它含有天然脱落酸的收集液合并浓缩，得到95％以上天然脱落酸，可以作为天然脱落酸原药使用。
具体实施例方式
实施例11000mL发酵培养基成分糊精5.0％，麦麸0.3％，乙二醇0.02％，葡萄糖2.0％，蔗糖3.0％，豆饼粉1.0％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.05％。
将以上培养基1200mL分装4个1000mL三角瓶，每瓶装300mL，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢TBI-9孢子悬液，于23-29℃下进行发酵培养。振荡速度150rpm，振幅20cm。发酵时间8-12天，天然脱落酸浓度达到0.14％。
取1000克发酵液(天然脱落酸含量为1.431克)，加入3N硫酸溶液调节Ph至2.0-5.0，进行酸化处理30分钟。酸化后的发酵液在室温下离心10分钟，离心速度为5000-9000rpm，除去发酵液中的菌体和杂质后，利用200-1000克101大孔阳离子交换树脂接触富集酸化液体中的天然脱落酸1小时后，再用1000-5000mL 40-85％甲醇水溶液洗树脂30分钟，收集含天然脱落酸的甲醇液，甲醇水溶液中的天然脱落酸含量是1.412克。
洗脱甲醇水溶液在Buchi R-3000型旋转蒸馏装置上减压蒸馏，真空度保持在0.06-0.09Mpa，水浴温度40-60℃，蒸馏速度控制在5-12mL/min，浓缩干后，用1-20mL的乙酸乙酯溶解，加入1-10克硅胶拌料，风干后，用硅胶柱层析，载体为200-300目硅胶，载体重10-200克。洗脱液为石油醚/醋酸乙酯(体积比V/V)＝3/1-1/3。收集含有天然脱落酸的洗脱液，在旋转蒸馏装置上减压蒸馏，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴温度40-50℃，浓缩至干得粗品。本步操作收率达93％。
在天然脱落酸粗品中加入1-5mL甲醇/水(体积比V/V)＝2/8混合溶剂或相同比例的乙醇与水混合溶剂，用反相色谱柱进行柱层析，载体为ODS-A型C18硅胶(50μm，120，日本YMC化学公司)，载体重15-150克，用不同比例的甲醇与水或乙醇与水混合溶剂进行洗脱，收集不同比例的洗脱溶液，见表1。收集的洗脱溶液采用薄层层析或高压液相色谱(HPLC)检测识别，薄层层析展层剂用氯仿或石油醚/醋酸乙酯(体积比V/V)＝1/2.5。将含有天然脱落酸的收集部分减压浓缩，真空度保持在小于0.085Mpa，水浴温度40-70℃，冷却结晶，真空干燥，制得0.342克纯度为95.5％的天然脱落酸和0.879克纯度为99.3％天然脱落酸结晶体。
表1反相色谱洗脱条件
以上操作过程都在避光条件下进行。
实施例2发酵液的制备方法同实施例1，取1000克发酵液(天然脱落酸含量为1.410克)，加入9.0升水，使液体中天然脱落酸的浓度为0.014％，用此溶液代替原始发酵液进行提取分离。加入3N盐酸溶液调节Ph至2.0-5.0，在室温下5000-9000rpm离心10分钟，收集上清液。离心后的上清液与200-1000克101大孔阳离子交换树脂接触1小时后，再用1000-5000mL 40-85％甲醇洗树脂30分钟，收集含天然脱落酸的甲醇液，甲醇液的天然脱落酸含量是1.387克。
洗脱甲醇液在Buchi R-3000型旋转蒸馏装置上减压蒸馏，真空度保持在0.06-0.09Mpa，水浴温度40-60℃，蒸馏速度控制在5-12mL/min，浓缩干后，用1-20mL的乙酸乙酯溶解，加入1克-10克硅胶拌料，风干后，用硅胶柱层析，载体为200-300目硅胶，载体重10-200克。洗脱液为石油醚/醋酸乙酯(体积比V/V)＝3/1-1/3。收集含有天然脱落酸的洗脱液，在旋转蒸馏装置上减压蒸馏，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴温度40-50℃，浓缩至干得粗品。本步操作收率达93％。
在天然脱落酸粗品中加入1-5mL甲醇/水(体积比V/V)＝2/8混合溶剂或相同比例的乙醇与水混合溶剂，用反相色谱柱进行柱层析，载体为ODS-A型C18硅胶(50μm，120，日本YMC化学公司)，用不同比例的甲醇与水或乙醇与水混合溶剂进行洗脱，收集不同比例的洗脱溶液，将含有天然脱落酸的收集部分减压浓缩，真空度保持在小于0.085Mpa，水浴温度40-70℃，冷却结晶，真空干燥，制得0.318克纯度为96.0％的天然脱落酸和0.883克纯度为99.0％天然脱落酸结晶体。以上操作过程都在避光条件下进行。
实施例3发酵液的制备方法同实施例1，取3000克发酵液，发酵液中天然脱落酸含量为4.248克。减压浓缩至1000克，使其发酵液浓度为0.423％，用此溶液代替原始发酵液进行提取分离。提取分离操作基本同实施例1。最后制得1.006克纯度为95.8％的天然脱落酸和2.623克纯度为99.1％天然脱落酸结晶体。
权利要求
1.用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法，包括以下步骤取能发酵产生天然脱落酸的微生物定向培养得到的发酵液酸化后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附后用有机溶剂洗脱，洗脱液经浓缩后硅胶拌料进行硅胶层析再经浓缩后得粗品；天然脱落酸粗品用溶剂溶解后，用反相色谱柱进行柱层析，甲醇与水或乙醇与水混合液洗脱，收集洗脱溶液，减压浓缩，冷却结晶，真空干燥，制得98％以上天然脱落酸结晶体。
2.根据权利要求1所述的用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法，其特征是吸附于大孔阳离子交换树脂的天然脱落酸洗脱后，用200-300目硅胶作为载体进行硅胶层析，洗脱溶剂用氯仿/乙酸乙酯或石油醚/乙酸乙酯，体积比为8/1-1/2。
3.根据权利要求1所述的用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法，其特征是采用C18硅胶进行反相色谱分离，载体型号为ODS-A型。
4.根据权利要求1所述的用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法，其特征是反相色谱分离时洗脱用的有机溶媒优选为40-85％的甲醇水溶液或50-95％的乙醇水溶液。
5.根据权利要求1所述的用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法，其特征是反相色谱洗脱收集液，采用薄层层析或高压液相色谱检测识别。
6.根据权利要求1所述的用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法，其特征是整个操作过程都在避光条件下进行。
全文摘要
本发明公开了用离子交换和反相色谱分离提取发酵液中脱落酸的方法，通过以下方式实现首先利用大孔吸附树脂吸附发酵液中的脱落酸，对发酵液中的脱落酸进行初步的提取、浓缩；再用硅胶层析除去大量的发酵副产物，得到纯度较高(＞90％)的天然脱落酸产品，将其经C
文档编号C07C51/42GK1944385SQ20051002182
公开日2007年4月11日 申请日期2005年10月8日 优先权日2005年10月8日
发明者周金燕, 谭红, 杨杰 申请人:中国科学院成都生物研究所