血浆或者血清蛋白的分离的制作方法

专利名称：血浆或者血清蛋白的分离的制作方法
技术领域：
本发明涉及从蛋白质溶液中大规模分馏(fractionatin)和分离(isolation)蛋白质如人血浆或者血清蛋白。具体地，本发明涉及使用偶联捕获蛋白质的配体的吸附剂从蛋白质溶液中大规模生产来自如血液、血浆、血清或者其它血源(blood derived source)的治疗用血浆或者血清蛋白。
背景技术：
和现有技术人和动物血液含有许多蛋白质和酶，它们有治疗和潜在地挽救生命的特性。有些蛋白质可以在红细胞中找到，而其它的蛋白质可以在血浆或者血清的溶液中找到。自从20世纪中期，这类蛋白质已经成为大规模地和特异分离的目标，其目的是提纯和标准化用作人治疗剂的蛋白质。目前可以用作分离的治疗产品的主要血蛋白的例子是白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、凝血因子VIII和α-1-蛋白酶抑制剂。有些蛋白质以每年几千克的规模被生产(白蛋白和免疫球蛋白G)，而其它的蛋白仅以每年以克到千克的规模被生产。然而，从全世界来看，为了分离这些蛋白质，每年处理了几百万升的血液。
血液、血浆和血清是非常复杂的含有蛋白质的溶液，其含有许多其它类的并非所感兴趣的蛋白质或者酶的化合物，其全部被精细地平衡和调节在血流中的以非常广泛范围的生化上复杂的功能(如氧运输、免疫防卫和防止伤口过量出血的凝血系统)进行工作。特别是当血是从动物上流出并且暴露在大气和不同类型容器的表面，它会变得非常不稳定。尽管可以加入化学试剂如肝磷脂和柠檬酸钠以增加其稳定性，并且在一定程度上，防止通过分离血细胞所获得的血浆的凝结，但是血浆仍然是非常脆弱，很浓的和粘滞的蛋白质溶液液还包括大量的脂质。除了添加稳定剂，血浆组分的任何处理或者改变会导致意外不稳定的风险，它可以引起阶式凝固器的活化、沉淀如脂质组分和使目标蛋白变性，因此使血液很难与其一块起作用。因此，从血液或者血源溶液中分离蛋白所使用的任何方法必须考虑溶液和蛋白质自身固有的不稳定性。已经证明这对于从血液中大规模生产治疗产品是一个重大的挑战。
进一步，从技术方面来看，血液的复杂性和不稳定性使离析(separation)和分离(isolation)血蛋白比从其它类型的蛋白溶液如哺乳动物细胞培养的上层清夜和从遗传改性的微生物体中发酵的原汤(broth)中分离蛋白质(如在生物技术工业中典型使用的)更复杂和经济上更高要求。而且，生物技术工业典型地从细胞培养的上层清夜中仅分离一种特定产品，而由于经济和伦理的原因，治疗血液分离工业通常必须从有限的血源中分离尽可能多的产品。
血液、血清和血浆的成本在最近几十年已经大量增加，主要的原因是增加了为防止病毒疾病从血液捐献者传播到血液产品接受者而进行的安全措施成本。在10-20年的时间中，很高的血浆成本和实施消除病毒步骤和其它安全措施而增加的成本已经使血液分离工业承受增加单个产品(如免疫球蛋白G(IgG)和α-1-蛋白酶抑制剂)的每升产量的巨大压力。
而且，通常也强烈要求扩展从相同量血浆中生产出的产品数，即从血浆中生产出更多数目的不同蛋白质，而仍然以可接受的产量生产现有产品。血液分馏工业已经体验到这些长时间所感觉到的需求用已知技术是很难满足的，尽管很长一段时间已经作出尝试使用作为替代已建立的沉淀方法的现代吸附技术，但是从此处所述吸附方法的经济可行性和处理活性(processingrobustness)方面来看仍然存在很多的问题。
分离血浆或者血清蛋白常见使用的方法之一已经描述在美国专利2,390,074(Cohn等人)中，该专利公布了一种大规模分馏血浆或者血清蛋白的方法，它使用乙醇沉淀，并调节温度、pH值、离子强度以及控制某些蛋白质从人血清中沉淀的时间。分馏方法涉及逐步地添加乙醇到血浆原料中，其目的是为了获得几种沉淀物(馏分(fractions))和包含不同浓缩的蛋白质溶液的相应上清夜。
由Cohn等人所公布的乙醇沉淀方法的一个缺点是某些蛋白质在生产过程中趋向于变性，这导致减小分离的蛋白质产量，并且沾染上了聚集物，而该聚集物在获得可接受的治疗产物之前必须移除掉。而且，在该分馏方法期间，沉淀的蛋白质不得不再溶解以进一步处理。该再溶解的蛋白质溶液可以包含大量的不能溶解(失活)的蛋白质和脂质材料，这使获得目标产品变得很困难和很耗费时间，这也是有价值产品损失的重要原因。另外，该方法的特征是在逐步添加乙醇期间特定蛋白质可以分成几个所获得的馏分，这再一次导致低产量的和耗费时间的获得重新组合的蛋白质馏分。
在使用Cohn等人所述的分馏方法分馏如α-1-蛋白酶抑制剂或者免疫球蛋白如IgG中，α-1-蛋白酶抑制剂的产量低至10-20％，IgG的产量低至40-50％。然而，因为这些产品是非常急需的，并且为满足病人需求的产品供应不足，所以非常需要用于分离这种蛋白质的、产品损失减小的新型方法。
在最近几十年，已经尝试开发一种分馏方法，该方法可以用许多其它技术包括色谱法增加产量。然而，与已知吸附技术相关的缺点如低流速和低粘附容量导致低的生产率、缺少活力(robustness)以及在应用安全清洁程序上的困难性，所有这些使平衡在分离血浆和血清蛋白中所涉及的产量和经济性两方面变得困难。现有工业生产方法的关键仍然是基于Cohn等人的工作。
目前使用的分离和提纯方法已经显示出不适合，并且由于效率低的提纯方法而导致的痕量杂质激发病人的免疫响应。而且，不能分离活性部分和非活性部分产品的提纯方法(如目前所使用的方法)可以导致不可预知的效果和特定的活性，它可以在各种单独的馏分之间变化。
即使尝试开发先进的吸附技术如膨胀床吸附(在二十世纪九十年代初期首次提出)，也未能改善吸附技术的使用。Finette G.M.S，Biotechnol.Prog.，1998，14，286-293中描述了使用具有180μm的平均颗粒直径和密度为1.79g/ml的吸附剂于填充床和膨胀床中从Cohn馏分II和III中吸附α-1-蛋白酶抑制剂。该作者得出结论体积流速为0.2ml/min(相应的线流速为0.1cm/min或者60cm/小时)将得到产量为50％的α-1-蛋白酶抑制剂。该作者进一步地说明更高流速将减小产量，并且干扰在柱中的栓塞流。这种低流速没有经济上的吸引力，因此，避免使用如用于工业分馏血液蛋白的膨胀床吸附。
使用膨胀床吸附来分离人血浆蛋白的其它尝试认可了现有技术所应用的低流速。因此，美国专利6,617,133描述了在应用100cm/小时的原料流速条件下使用流线型SP吸附剂(Amersham Bioscience)来分离人血清白蛋白，根据提供者，该吸附剂的平均体积颗粒直径为200μm，密度为1.20g/ml。这种低流速限制了吸附系统的生产效率，因此，需要非常大的吸附柱，并导致很高的生产每单位人白蛋白的材料成本。
因此，一种用于分馏血清蛋白或者血浆蛋白的方法，它处理快、有活力的(即可靠的在每日操作中的低停机时间)、独特的和安全的，同时在生产过程中提供改进的所关心产物的产量和纯度，因此，与常见使用的方法(如Cohn等人所述的方法)相比，有利于获得在产量和经济性之间改进的和可接受的平衡，并且解决了以上提到的问题，这样的方法是所期望的。本发明此处提供这样的方法。
本发明概括因此，本发明涉及一种用于分离和/或者分馏蛋白质溶液的方法。本发明方法处理快、有活力的、独特的和安全的，并且在生产过程中提供改进的所关心产品的产量和纯度，因此，与常见使用的方法相比，有利于获得在产量和经济性之间改进的和可接受的平衡。本发明的方法特别适合于大规模生产。
因此，本发明的一个方面是提供一种用于从蛋白质溶液中大规模分离一种或者多种蛋白质的方法，其中，蛋白质溶液是从选自以下组的来源获得，该组包括血液如血清和/或者血浆以及其它血源。该方法包括以下步骤a)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；b)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；c)将所述蛋白质溶液应用于含有吸附剂的吸附柱，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径；d)根据情况清洗吸附柱；e)从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质。
在本发明的另一个方面，提供一种用于从蛋白质溶液中大规模分离一种或者多种血液蛋白如一种或者多种血清蛋白或者一种或多种血浆蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；b)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；
c)将所述蛋白质溶液应用于含有吸附剂的吸附柱，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径；d)根据情况清洗吸附柱；e)从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质。
在本发明的进一步方面，提供一种用于从蛋白质溶液中大规模分离一种或者多种蛋白质的方法，该方法包括以下步骤a)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；b)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；c)将所述蛋白质溶液应用于含有吸附剂的吸附柱，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，吸附剂包括颗粒密度至少为1.5g/ml，平均体积颗粒直径最多为150μm；d)根据情况清洗吸附柱；e)从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质。
其中蛋白质溶液已经被补充了醇。
在本发明的一个方面，提供一种用于从蛋白质溶液中大规模分离一种或者多种蛋白质的方法，该方法包括以下步骤a)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；b)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；c)将所述蛋白质溶液应用于吸附剂，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；d)根据情况清洗吸附剂；e)从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质。
其中蛋白质溶液已经被补充了醇。
5在本发明的另一个方面，提供一种用于从蛋白质溶液中大规模分离一种或者多种蛋白质的方法，该方法包括以下步骤
a)提供包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和预设的离子强度或电导率；b)在使蛋白质溶液与吸附剂接触之前，对蛋白质溶液进行至少一次消除病毒的处理；c)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；d)根据情况清洗吸附剂；e)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种蛋白质。
在本发明的另一个方面，提供一种用于从蛋白质溶液中大规模分离一种或者多种蛋白质的方法，该方法包括以下步骤a)提供包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和预设的离子强度或电导率；b)在使蛋白质溶液与吸附剂接触之前，对蛋白质溶液进行至少一次消除病毒的处理；c)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；d)根据情况清洗吸附剂；以及e)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种蛋白质。
在本发明的一个方面，提供一种用于从蛋白质溶液中大规模分离或者离析α-1-蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述α-1-蛋白酶抑制剂的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述的α-1-蛋白酶抑制剂。
在本发明的一个方面，提供一种用于大规模分离或者离析α-1-蛋白酶抑制剂的方法，该方法包括以下步骤
a)提供一种包含所述的α-1-蛋白酶抑制剂的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述的α-1-蛋白酶抑制剂。
在本发明的另一方面，提供一种用于从蛋白质溶液中大规模分离或者离析人白蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述人白蛋白的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述的人白蛋白。
10在本发明的进一步方面，提供一种用于大规模分离或者离析纤维蛋白原的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述纤维蛋白原的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述纤维蛋白原。
在本发明的一个方面，提供一种用于大规模分离或者离析纤维蛋白原的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述纤维蛋白原的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述纤维蛋白原。
在本发明的另一方面，提供一种用于大规模分离或者离析转铁蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述转铁蛋白的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述转铁蛋白。
在本发明的进一步方面，提供一种用于大规模分离或者离析转铁蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述转铁蛋白的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述转铁蛋白。
在本发明的一个方面，提供一种用于大规模分离或者离析α-1-酸-糖蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述α-1-酸-糖蛋白的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述α-1-酸-糖蛋白。
15在本发明进一步方面，提供一种用于大规模分离或者离析α-1-酸-糖蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述α-1-酸-糖蛋白的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述α-1-酸-糖蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种用于大规模分离或者离析一种或者多种凝血或抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白质的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述一种或者多种凝血因子的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种凝血因子。
在本发明的一个方面，提供一种用于大规模分离或者离析一种或者多种凝血或抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白质的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述一种或者多种凝血因子的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种凝血因子。
在本发明另一个方面，提供一种用于同时大规模分离至少3种、如4种、如6种选自以下的蛋白质α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原的方法，该方法包括以下步骤a)提供包括至少三种所述α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原的蛋白质溶液，其具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触；以及c)从所述吸附剂中获得至少3种、如4种、如5种、如6种选自由以下组成的组的蛋白质α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原，它们相互之间分离为单个的蛋白质馏分。
本发明详细公开在最近的几十年期间，在膨胀床吸附技术中的开发已经越来越重视，这是因为它可应用于大规模的提纯。蛋白质可以从粗蛋白质溶液中提纯，而不需要为移除颗粒物质的单独的净化、浓缩以及其它类型的初步提纯。用于膨胀床吸附的吸附剂使用相同的原理如亲和层析法、离子交换层析或者疏水作用色谱法来捕获目标分子。
在膨胀床吸附领域中的基本概念与现有技术已经描述在如EP 0722771、WO 01/85329、WO 92/18237、WO 2000/25884、WO 02/05923、WO 99/65586和WO 00/57982专利中，它们公布了不同类型的膨胀床吸附装置和设备以及不同类型的吸附颗粒，本发明者发现这些非常适合于改装或者进一步开发用来分离本发明所描述的血清蛋白或者血浆蛋白。所有这些文献此处引入作为参考。
在本发明的实施方式中，本发明的方法可以大规模地进行操作。在本文中，术语“大规模地”涉及处理原料的量为至少1升/吸附循环如至少5升/吸附循环、如至少10升/吸附循环、如至少25升/吸附循环、如至少100升/吸附循环、如至少1000升/吸附循环，因此，本发明是区别于其它任何分析和小规模的实验，它并不涉及严格地要求如在工业大规模生产环境中所要求的活性和可重复性。
蛋白质溶液根据本发明，可以从蛋白质溶液中离析和分离所关心的蛋白质。在本文中，术语“蛋白质溶液”涉及液体的、包含所关心的蛋白质的任何类型溶液，并且从该溶液，可以离析和分离出蛋白质。在本发明的实施方式中，蛋白质溶液可以从选自以下组成的来源来获得血液、血清、血浆或者其它的血源。血液、血清、血浆或者其它的血源可以从人或者动物如牛、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、斑马、鸡、鱼或者鸵鸟来获得。在本发明的实施方式中，所选择的动物能够制造或者可能改良制造所关心的蛋白质。在本发明的可选择实施方式中，蛋白质溶液可以从哺乳动物的细胞培养、或者微生物发酵原汤(其中，哺乳细胞或者微生物体能够或者已经改良制造所关心的蛋白质)或者植物汁(其中，植物能够制造或者已经改良制造所关心的蛋白质)中获得。
在本发明的实施方式中，所使用的蛋白质溶液可以被补充醇。
在本文中，术语“被补充醇”涉及添加醇到蛋白质溶液中，目的是实现离析在蛋白质溶液中出现的至少两种组分，借此，一种组分将会出现在上清液中，其它组分将会出现在馏分中。特别地，这种蛋白质溶液的离析涉及逐步地增加加入到蛋白质溶液中的乙醇量，从而，从蛋白质溶液中离析至少一种血清蛋白或者血浆蛋白。在离析方法过程中，所关心的蛋白质可以出现在上清液或者馏分中。在本发明的的实施方式中，蛋白质溶液是用包含至少0.1体积％体积％的醇来补充，如至少0.5体积％、如至少0.75体积％、如至少1.0体积％、如至少1.5体积％、如至少2.0体积％、如至少3.0体积％、如至少5.0体积％、如至少7.5体积％、如至少10.0体积％、如至少20体积％、如至少25.0体积％、如至少40体积％、如至少50.0体积％、如至少60体积％、如至少75.0体积％。
在本发明的实施方式中，蛋白质溶液具有总的醇含量为至少0.1体积％的醇如至少0.1体积％、如至少0.5体积％、如至少0.75体积％、如至少1.0体积％、如至少1.5体积％、如至少2.0体积％、如至少3.0体积％、如至少5.0体积％、如至少7.5体积％、如至少10.0体积％、如至少20体积％、如至少25.0体积％、如至少40体积％、如至少50.0体积％、如至少60体积％、如至少75.0体积％、如至少77体积％。
在本发明文中，术语“上清液”涉及一种在依据本发明通过加入乙醇到蛋白质溶液中所获得的液体馏分、沉积物馏分或者沉淀物馏分上的液相。
在本文中，术语“馏分”涉及可从上清液中通过分馏方法如过滤、微量过滤、离心过滤、蒸馏或者色谱法离析出来的蛋白质溶液部分，该馏分可以是化合物的组合或者纯化合物。在本发明的实施方式中，馏分可以是液体(液体馏分)、沉积物(沉积馏分)或者沉淀物(沉淀馏分)。
在本发明的实施方式中，蛋白质溶液可以用选自由以下组成的组的醇来补充甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、亚甲基二醇、乙二醇、丙二醇、二甘醇、亚甲基-乙二醇(methylene-ethyleneglycol)以及二亚甲基二醇(dimethylene glycol)。
在本发明优选的实施方式中，蛋白质溶液包括血浆或者血清，特别是来源于人的。在本发明的实施方式中，蛋白质溶液包括血清或者血浆馏分和/或者血浆或者血清上清液，特别是来源于人类的。
而且，在本发明实施方式中，从再溶解的沉淀物中所获得的馏分可以通过逐步地添加醇到蛋白质溶液中获得。特别地，血浆或者血清馏分可以从通过添加醇到血浆或者血清中所获得的可再溶解的沉淀物来提供。
根据本发明，蛋白质溶液可以从蛋白质溶液中获得，并且可以包括一种或者多种上清液和/或一种或者多种可再溶解馏分的组合。特别地，人或者动物的血浆或者血清蛋白质溶液可以通过重组由加入醇到人或者动物血浆或血清中所获得的一种或者多种上清液和/或一种或者多种可再溶解的沉淀物来获得。
在本发明的实施方式中，蛋白质溶液的温度可以在-5℃-50℃温度范围，更优选在-5℃-40℃温度范围，更优选在-5℃-30℃温度范围，更优选在-5℃-20℃温度范围，更优选在0℃-10℃温度范围或者在0℃-50℃温度范围，更优选在10℃-50℃温度范围，更优选在20℃-50℃温度范围，更优选在30℃-50℃温度范围，更优选在40℃-50℃温度范围。
分馏/离析方法如上所述，分馏蛋白质溶液的常见方法涉及Cohn等人所描述的方法，Cohn等人方法涉及逐步地加入醇到蛋白质溶液中，从而，所关心的蛋白质逐步地从蛋白质溶液中离析出来。该方法已经更详细地描述在以下文章中Cohn等人，“Separation into Fractions of Protein and Lipoprotein Components”，J.Am.Chem.Soc.，68，459-475，1946；E.J.Cohn等人，Preparation and Properties ofSerum and Plasma Proteins，IVA system for the Sparation into Fractions of theProtein and Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids，the Journalofthe American Chemical Society，vol.LXVIII(Jan.-Jul.1946)，pp459-475；美国专利2,390,074和2,469,193，它们在此处引入作为参考。
在本文中，术语“分馏”和“离析”可以互换使用，它涉及在其与吸附剂接触以分离所关心的蛋白质之前制备蛋白质溶液的方法。
在本发明的实施方式中，通过加入醇到所获得的蛋白质中所进行的蛋白质溶液的逐步分馏可以通过一种或者多种以下操作来说明(i)蛋白质溶液如血浆可以开始进行冷冻，然后经过慢慢的、控制的解冻程序，从而形成一种冷凝蛋白质，它包括凝血因子VIII(与冯维勒布兰德因子vWF复合)和纤维蛋白原，包含大量蛋白质的上清液保留在血浆中(称为cryo-poor血浆)。
(ii)在(i)中所获得的冷凝蛋白质馏分可以再溶解以形成蛋白质溶液，该蛋白质可以通过使其与吸附剂接触来分离。特别地，蛋白质如凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子vWF和纤维蛋白原可以从由再溶解的馏分所获得的蛋白质溶液中分离。
(iii)在(i)步中的上清液、cryo-poor血浆可以被补充醇，并且形成馏分I(沉淀物)和上清液I。
(iv)上清液I可以用更多的醇补充，形成沉淀馏分II+III和上清液II+III。馏分II+III可以离析和再溶解以形成一种蛋白质溶液，所关心的蛋白质可以通过使其与吸附剂接触来分离。特别地，蛋白质如免疫球蛋白(如IgG)可以从由馏分II+III所获得的蛋白质溶液中分离，上清液II+III主要地包括白蛋白和α-1-蛋白酶抑制剂。
(v)上清液II+III可以进一步地用醇补充，形成上清液IV-1，并且沉淀馏分IV-1。馏分IV-1可以离析和再溶解，并且形成一种蛋白质溶液，蛋白质可以通过使其与吸附剂接触来分离。特别地，血浆蛋白如α-1-蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III与凝血因子IX的复合物可以从由馏分IV-1所获得的蛋白质溶液中分离。
(vi)上清液IV-1可以用更多的醇补充，以形沉淀馏分IV-4和上清液IV-4。馏分IV-4可以离析和再溶解，形成一种蛋白质溶液，所关心的蛋白质可以通过使其与吸附剂接触来分离。特别地，丁酰胆碱酯酶可以从由馏分IV-4所获得的蛋白质溶液中分离。
(vii)上清液IV-4可以进一步地用醇补充以提供沉淀的馏分V，它可以离析和再溶解以形成一种蛋白质溶液，所关心的蛋白质可以通过使其与吸附剂接触来分离。特别地，白蛋白可以从由馏分V所获得的蛋白质溶液中分离。
在本发明的实施方式中，蛋白质溶液可以选自由以下组成的组cryo-poor血浆、上清液I、上清液II+III、上清液IV-1、上清液IV-4、重新溶解的冷凝蛋白质、重新溶解的馏分I、重新溶解的馏分II+III、重新溶解的馏分IV-1、重新溶解的馏分IV-4、重新溶解的馏分V以及其任何组合。
在本发明的一个特定实施方式中，蛋白质溶液可以选自由以下组成的组上清液I、上清液II+III、重新溶解的馏分IV-1以及其任何组合。
在本发明的一个特定的实施方式中，蛋白质溶液可以选自由以下组成的组上清液I、上清液II+III、上清液I+II+III、重新溶解的馏分IV-1以及其任何组合。
在本发明的进一步特定实施方式中，蛋白质溶液可以选自由以下组成的组上清液I、重新溶解的馏分II+III以及其任何组合。
沉淀的馏分可以在广泛范围的水溶液(包括纯水)中重新溶解。在许多优选的实施方式中，重新溶解的媒介可以是水缓冲溶液，它具有可适合于如下的下游处理步骤如根据本发明的吸附步骤的pH值和离子强度。
在本发明的实施方式中，沉淀的馏分可以通过过滤、离心分离、移注、超滤和/或者沉降从上清液来获得。
在本发明的实施方式中，蛋白质溶液可以通过在以下文献中由Cohn等人所描述的Cohn分馏方法来获得“Separation into Fractions of Protein andLipoprotein Components”，J.Am.Chem.Soc.，68，459-475，1946；E.J.Cohn等人，Preparation and Properties of Serum and Plasma Proteins，IVA system forthe Sparation into Fractions of the Protein and Lipoprotein Components ofBiological Tissues and Fluids，the Journal of the American Chemical Society，vol.LXVII(Jan.-Jul.1946)，pp459-475；美国专利2,390,074和2,469,193。
在本发明的实施方式中，蛋白质溶液包括至少一种从通过添加乙醇如原始的Cohn分馏方法或者与其不同的Cohn-Oncley方法来分馏血浆或者血清所获得的血浆或者血清蛋白。
蛋白质在本发明优选的实施方式中，待分离的蛋白质是一种血液蛋白如血浆蛋白或者血清蛋白。在本文中，术语“血浆或者血清蛋白”涉及生产的或者人或动物身体所需要的蛋白质。通常，这些血浆或者血清蛋白包含在动物或者人的血液中，特别是某些蛋白质最初在红细胞中发现，而其它的蛋白可以在血浆或者血清的溶液中找到。
血浆是血液的一个组分，它是液体的，血细胞悬浮在该液体中。血浆含有蛋白质、脂质、营养物、新陈代谢最后产物、荷尔蒙以及无机电解质。血浆典型地通过加入抗凝血剂如柠檬酸钠、肝磷脂和EDTA使其稳定。
血清是与血浆相同，除了凝血因子(如纤维蛋白原和凝血因子VIII)已经被移除。
在本发明的实施方式中，血浆或者血清蛋白是人或动物的血浆或者血清蛋白。
在本发明的实施方式中，待分离的一种或者多种血浆或者血清蛋白是选自由以下组成的组白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、α-1-蛋白酶抑制剂(类似于α-1-蛋白酶)、前凝血蛋白(blood pro-coagulation protein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、载脂蛋白、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、纤连蛋白、β-2-酸-糖蛋白I、血纤蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶激活物、纤溶酶抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、内-α-胰岛素抑制剂(内-α-胰岛素抑制剂(inter-alpha-trypsin inhibitor))、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血结素、补体C3、转铁蛋白、尿激酶、α-1-酸-糖蛋白以及凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质。吸附柱能够捕获一种或者多种蛋白质的吸附剂保存在吸附柱中，或者它可以不保存载吸附柱中。在本文中，术语“吸附柱”涉及可以为将蛋白质应用于吸附柱和随后洗提蛋白质提供至少一个入口和至少一个出口的任何类型的容器。对于某些吸附柱，该入口和出口可以相同(如分批吸附槽)。吸附柱可以是膨胀床(Expanded bed adsorption，EBA)吸附柱、填充床吸附柱、流化床吸附柱、悬浮床吸附柱、膜反应器或者分批吸附槽的形式。吸附柱可以以分批处理系统或者连续系统来使用。典型地，填充床吸附柱和膨胀床吸附柱是在塞流(plug flow)条件下(即在吸附床中没有液体反向混合和湍流)操作，而悬浮床吸附柱和分批吸附槽是以高度地混合至少大部分的吸附柱体积来操作。
EBA技术通常可以用非澄清的蛋白质溶液高效率地工作，这使得它对于分离蛋白质很有吸引力。与基于填充床吸附技术的方法相比，膨胀床吸附技术EBA可以提供包括很少步骤的、有活力的方法，因此，导致增加产量和改进方法的经济性。由于在实施EBA方法期间吸附剂床的膨胀，EBA柱可以进一步地放大至工业规模，而不需要考虑任何关于增加反压或者由于系统的阻塞所导致方法的崩溃(当使用填充床吸附柱时，这经常是个问题)。
根据本发明，蛋白质溶液应用于含有吸附剂的填充床吸附柱或者膨胀床吸附柱。
在本文中，术语“填充床”涉及以下实施方式在该实施方式中，吸附剂颗粒应用在吸附柱中，吸附柱是以颗粒在沉降或者填充的状态(在该状态中，所有颗粒固定在相互间的顶部)进行操作。经常地，填充床吸附柱装备有顶部和底部的转接器，限定和固定整个吸附剂床，以避免在操作期间颗粒的任何移动。
在本文中，术语“膨胀床”涉及以下实施方式在该实施方式中，吸附剂颗粒应用在吸附柱中，吸附柱允许吸附剂膨胀，并且向上的液体流流经吸附柱。吸附柱设计为在吸附柱中避免过量液体混合和湍流，而单个吸附剂颗粒保持在非固定的活动状态，仅在吸附柱中很窄的局部区域移动。而优选的膨胀床在吸附柱的底部具有很小的混合区域，其中，引入的液体分布在整个吸附柱的横截面，膨胀床通常在类似于填充床的塞流条件下操作。在本发明的实施方式中，吸附剂保存在膨胀床吸附柱中，并且优选用来从蛋白质溶液中大规模地分离一种或者多种蛋白质。
在吸附剂不是保存在吸附柱中的情况下，它可以是固相如用于膜为基的吸附如薄膜滤器、纤维或者薄片，对此配体偶联。
每当吸附剂是以渗透或者半渗透的膜、纤维或者薄片的形式，吸附剂与蛋白质溶液之间的接触一般可以通过泵/施加压力使蛋白质溶液经过表面和/或流经多孔结构的膜或者薄片，以确保一种或者多种血浆或者血清蛋白在表面和/或者在吸附剂中与共价键附着的官能团紧密接触。
吸附剂本发明的进一步目标是提供一种基于对任何类型固相材料(任何形状和格式)的吸附包括填充床吸附、分批吸附、悬浮床吸附、膨胀床吸附(EBA)、流化床吸附和基于膜的吸附从蛋白质溶液中分离蛋白质的方法。而且，该吸附的特征是可以使用选择性的吸附剂和/或配体化学，它们能进行特定的结合并随后洗提充分地仅有一种生物分子，或者选择性地能进行一组特定的结合许多生物分子物质并随后通过选择性地和连续地从吸附剂中洗提一种或者多种物质。
吸附剂包括适合用于结合一种或者多种所关心的蛋白质的配体。在本发明的实施方式中，吸附剂可以用一种或者多种清洗缓冲液和/或平衡缓冲液来选择性地清洗和/或平衡。
对于广泛范围的本发明优选实施方式，关键重要的是，吸附剂是在尺寸和密度方面具有组合特征的颗粒。因此，已经发现，对于高浓度的蛋白质溶液如血浆或者血清，非常期望的是，为了获得快的和效率高的蛋白质结合(这对于生产率和生产工厂的经济性来说很重要)，使用具有体积平均颗粒直径小于150μm的颗粒。然而，进一步地发现，吸附剂颗粒的小直径(低于150μm)与吸附剂颗粒的某些最小密度(大于1.5g/ml)的组合能使在生产工厂的生产率方面有重大改进。因此，可以获得一种快的和高效率的蛋白质结合与流经本吸附方法所使用的吸附柱的高液体流速的独特组合。特别是对于非填充吸附柱如膨胀床吸附柱和悬浮床吸附柱，根据本发明所获得的高液体流速与吸附剂很重要。很小吸附剂颗粒具有高的密度，高的密度在填充和再填充过程中提供快沉降速度，否则是慢的和过分苛求的方法步骤，这对于填充床吸附柱是很明显的优点。通常地，发现更小平均体积直径的颗粒可以期望得到更高密度的颗粒。
可以应用于本发明的某些实施方式中的商业吸附剂颗粒的例子有
-FastLine UFC NNSDW(UpFront Chromatography A/S，Denmark)，其体积平均颗粒直径为70μm，密度为2.9g/ml。
-STREAMLINE SP(Amersham Bioscience，Sweden)，其体积平均颗粒直径为200μm，密度为1.2g/ml。
-STREAMLINE Direct CST-1(Amersham Bioscience，Sweden)，其体积平均颗粒直径为135μm，密度为1.8g/ml。
-Q and CM HyperZ离子交换吸附剂(Biosepra SA，France)，其平均颗粒直径为751μm，密度为3.2g/ml。
特别在膨胀床吸附中，流速、颗粒的尺寸和密度都可以对膨胀床的膨胀有影响。当用膨胀床吸附工作时，以保持颗粒在吸附柱里面的方式来控制膨胀的程度是很重要的。膨胀程度可以确定为H/H0，其中，H0是在填充床方式中床的高度(没有物流通过吸附柱时)，H是在膨胀床方式中床的高度(给定的物流通过吸附柱)。在本发明的实施方式中，膨胀程度H/H0是在1.1-6的范围如1.1-5、如1.1-4、如1.2-5、如1.5-4、如2-4、如、如2-3、如3-4。在本发明的另一实施方式中，膨胀程度H/H0为至多1.2如至多1.3、如至多1.5、如至多1.8、如至多2、如至多2.5、如至多3、如至多3.5、如至多4、如至多4.5。在本发明的实施方式中，流速为5cm/min，膨胀程度H/H0为至多1.2如至多1.3、如至多1.5、如至多1.8、如至多2、如至多2.5、如至多3、如至多3.5、如至多4、如至多4.5。在本发明进一步的实施方式中，流速为7cm/min，膨胀程度H/H0为至多1.2如至多1.3、如至多1.5、如至多1.8、如至多2、如至多2.5、如至多3、如至多3.5、如至多4、如至多4.5。在本发明的实施方式中，流速为10cm/min，膨胀程度H/H0为至多1.2如至多1.3、如至多1.5、如至多1.8、如至多2、如至多2.5、如至多3、如至多3.5、如至多4、如至多4.5。在本发明的实施方式中，流速为15cm/min，膨胀程度H/H0为至多1.2如至多1.3、如至多1.5、如至多1.8、如至多2、如至多2.5、如至多3、如至多3.5、如至多4、如至多4.5。在本发明的实施方式中，流速为20cm/min，膨胀程度H/H0为至多1.2如至多1.3、如至多1.5、如至多1.8、如至多2、如至多2.5、如至多3、如至多3.5、如至多4、如至多4.5。
在本发明的实施方式中，填充床吸附柱或者平膨胀床吸附柱的线流速可以为至少2cm/min，更优选为至少3cm/min，更优选为至少4cm/min，更优选为至少5cm/min，更优选为至少6cm/min，更优选为至少7cm/min，更优选为至少8cm/min，更优选为至少10cm/min，更优选为至少12cm/min，更优选为至少15cm/min，更优选为至少20cm/min，更优选为至少25cm/min，更优选为至少30cm/min，更优选为至少40cm/min，更优选为至少50cm/min。在本发明的实施方式中，线流速是在1-75cm/min的范围如2-75cm/min、如7-75cm/min、如10-75cm/min、如15-75cm/min、如20-75cm/min、如30-75cm/min、如40-75cm/min、如50-75cm/min、如1-50cm/min、如2-50cm/min、如2-30cm/min、如3-30cm/min、如3-20cm/min、如3-15cm/min、如4-30cm/min、如4-25cm/min、如4-20cm/min、如4-15cm/min、如5-25cm/min、如5-15cm/min、如5-10cm/min、如5-7.5cm/min、如7.5cm/min。与传统使用的流速相比(特别对于填充床吸附柱)，这些增加的流速可能在很大程度上由于小颗粒直径与吸附剂的高密度相结合。
在特定的本发明实施方式中，将蛋白质溶液应用于吸附剂柱可以在线速度为至少200cm/小时如至少300cm/小时下来操作，更优选为至少400cm/小时如至少500或者600cm/小时、如至少900cm/小时。
在本发明的实施方式中，吸附柱可以包含一种高密度的吸附剂。在本文中“高密度吸附剂”涉及部分组的吸附剂，并涉及出现在吸附柱中的整床吸附剂颗粒。术语“吸附剂颗粒”可以与术语“颗粒”互换使用，并涉及单独的、组成吸附床中的吸附剂的单个颗粒。优选单个吸附剂颗粒的形状为充分地球形。然而，颗粒的全部形状通常不是非常重要，因此，颗粒可以具有其它类型的圆形状如椭圆体、小滴形(droplet)和豆夹形状(bean forms)。然而，对于某些应用(如当颗粒用于装备的流化床时)，优选的是，至少95％的颗粒是充分地圆形。在本文中，术语“颗粒直径”和“颗粒尺寸”可以互换使用，并且涉及围绕颗粒的圆形物的直径，因此，它可以认为在颗粒最宽处的颗粒直径。
吸附剂的密度打算描述吸附剂颗粒在其完全溶剂化(如水合)的状态下的密度，相对的是干燥吸附剂的密度。在本发明中，颗粒的密度可以通过操作以下过程来测量1)通过在真空玻璃过滤器中轻微地抽吸以移除占据在各个颗粒珠之间的空间的缝隙水，抽干吸附剂颗粒。2)称量抽干的颗粒样品，确定颗粒的总质量。3)全部量的抽干颗粒样品加入到已知量的水(在量筒中)中，并读出通过加入抽干的颗粒所获得的总体积增加量。4)通过抽干样品的总质量除以3)项所确定的体积增加量，计算密度。
在本发明的实施方式中，吸附剂颗粒的密度可以在1.5g/ml-20g/ml的范围，更优选在1.9g/ml-20g/ml的范围，更优选在2.0g/ml-20g/ml的范围，更优选在2.1g/ml-20g/ml的范围，更优选在2.3g/ml-20g/ml的范围，甚至更优选在2.5g/ml-20g/ml的范围，甚至更优选在2.8g/ml-20g/ml的范围，甚至更优选在2.9g/ml-20g/ml的范围，更优选在3.0g/ml-20g/ml的范围，更优选在3.5g/ml-20g/ml的范围，更优选在4.0g/ml-20g/ml的范围，更优选在5g/ml-20g/ml的范围，更优选在10g/ml-20g/ml的范围，更优选在15g/ml-20g/ml的范围，更优选在4g/ml-15g/ml的范围，更优选在4g/ml-10g/ml的范围，更优选在1.5g/ml-15g/ml的范围。
EBA吸附剂颗粒的密度对于与吸附剂床的最大膨胀程度(可能在典型的EBA吸附柱中出现，如H/H0最大为3-5)相关的可应用流速来说很重要，EBA吸附剂颗粒的密度至少为1.3g/ml，更优选为至少1.5g/ml，更优选为至少1.8g/ml，更优选为至少1.9g/ml，更优选为至少2.0g/ml，更优选为至少2.1g/ml，更优选为至少2.3g/ml，更优选为至少2.5g/ml，甚至更优选为至少2.8g/ml，甚至更优选为至少2.9g/ml，更优选为至少3.0g/ml，更优选为至少3.5g/ml，其目的是使该方法具有高的生产率。
在本发明的实施方式中，85％体积的单个吸附剂颗粒的直径是在5-200μm的范围，更优选在10-150μm的范围，更优选在15-120μm的范围，更优选在20-100μm的范围，更优选在20-80μm的范围，更优选在80-150μm的范围，甚至更优选在40-120μm的范围。在本发明的实施方式中，吸附剂的平均颗粒直径可以为150μm或者更小，优选为120μm或者更小，甚至更优选为100μm或者更小，甚至更优选为80μm或者更小，甚至更优选为70μm或者更小，甚至更优选为60μm或者更小，甚至更优选为50μm或者更小，甚至更优选为40μm或者更小。
对流速有影响的几个参数可以在EBA方法中实施。吸附剂颗粒的流化性能(它可以通过斯托克斯定律来描述)决定为了膨胀吸附剂并且仍然使吸附剂保持在吸附柱中，哪种流速可以使用。影响这个的主要因素有吸附剂颗粒的直径和密度，以及流经吸附柱的液体流的粘度。然而，对于确保EBA方法的最佳效率和生产率，相应于特定领域的结合和传质动力学是同等重要。例如，根据物理流化性能和物理膨胀性能，它可能以很高的流速运行包含某些EBA吸附剂的EBA吸附柱，而所使用的高流速导致差的和低效率的吸附(即低的动力学容量)，这是因为待结合的目标分子不能与该流速匹配的扩散进出吸附剂颗粒(即传质动力学是限制因素)。
因此，结合特别优选的本发明实施方式，在该实施方式中，在应用蛋白质溶液期间，所使用的线流速高于300cm/小时，平均体积颗粒直径为150μm或者更小。典型地，在某些实施方式中，分馏方法在以下条件下操作所使用的线流速高于500cm/min，平均体积颗粒直径低于120μm，优选低于90μm。典型地，在某些实施方式中，分馏方法在以下条件下操作所使用的线流速高于600cm/min，平均体积颗粒直径低于85μm，更优选低于75μm。
基础地，在本文中颗粒尺寸分布的表示是基于本技术领域中的一般理解的体积，如Malven设备有限公司(Malven Instrument Ltd，伍斯特郡，英国)在它们的Mastersizer 2000E粒度仪操作指南(MAN 0320 Issue 1.0 Mar.2004)所描述的，在该指南中，描述了通过光散射测试颗粒尺寸分布。
当结果显示例如11％的分布是在65-78μm的尺寸范围时，这意思是在上述尺寸范围(在65-78μm的尺寸范围内)的所有颗粒的总体积代表了11％的分布中的所有颗粒的总体积。在本文中所称谓的平均体积直径(或者体积平均直径)涉及体积的平均直径，对于Mastersizer 2000E粒度仪，Malven标记其为“D(4，3)”。每当颗粒尺寸范围称为如“该颗粒具有颗粒直径在X-Yμm的范围”，应当理解为至少90％的颗粒总体积具有直径在X-Yμm的范围，如至少95％、如至少98％、如至少99％。
在本发明实施方式中，以上所述的吸附剂密度、颗粒直径和平均体积颗粒直径可以以任何方式组合，可能提供用于分离一种或者多种所关心蛋白质的最适合的吸附剂。在本发明的实施方式中，吸附剂的密度可以在1.5-10.0的范围，85％体积的单个吸附剂颗粒的直径可以在10-150μm的范围，平均体积颗粒直径可以在15-100μm的范围。在本发明的另一实施方式中，吸附剂的密度可以在2.0-5.0的范围，85％体积的单个吸附剂颗粒的直径可以在20-140μm的范围，平均体积颗粒直径可以在55-85μm的范围。在本发明的实施方式中，吸附剂的密度可以在2.5-3.5的范围，85％体积的单个吸附剂颗粒的直径可以在40-120μm的范围，平均体积颗粒直径可以在60-80μm的范围。
结合优选的实施方式，平均体积颗粒直径可以为120μm或者更小，颗粒密度为至少1.6g/ml，更优选为至少1.9g/ml。当平均体积颗粒直径小于90μm时，密度必须为至少1.8g/ml，或者更优选为2.0g/ml。当平均体积颗粒直径少于75μm时，密度必须为至少2.0g/ml，更优选为至少2.3g/ml，最优选为至少2.5g/ml。
在本发明的实施方式中，吸附剂颗粒包括具有平均体积颗粒直径为至多150μm和颗粒密度为至少1.5g/ml的颗粒，如颗粒密度为至少1.6g/ml、如颗粒密度为至少1.9g/ml、如颗粒密度为至少2.0g/ml、如颗粒密度为至少2.3g/ml、如颗粒密度为至少2.5g/ml、如颗粒密度为至少2.8g/ml、如颗粒密度为至少3.0g/ml、如颗粒密度为至少3.5g/ml、如颗粒密度为至少4.0g/ml、如颗粒密度为至少4.5g/ml。优选的是，吸附剂颗粒包括具有平均体积颗粒直径为至多120μm和颗粒密度为至少1.5g/ml的颗粒，如颗粒密度为至少1.6g/ml、如颗粒密度为至少1.9g/ml、如颗粒密度为至少2.0g/ml、如颗粒密度为至少2.3g/ml、如颗粒密度为至少2.5g/ml、如颗粒密度为至少2.8g/ml、如颗粒密度为至少3.0g/ml、如颗粒密度为至少3.5g/ml、如颗粒密度为至少4.0g/ml、如颗粒密度为至少4.5g/ml。更优选的是，吸附剂颗粒包括具有平均体积颗粒直径为至多100μm和颗粒密度为至少1.5g/ml的颗粒，如颗粒密度为至少1.6g/ml、如颗粒密度为至少1.9g/ml、如颗粒密度为至少2.0g/ml、如颗粒密度为至少2.3g/ml、如颗粒密度为至少2.5g/ml、如颗粒密度为至少2.8g/ml、如颗粒密度为至少3.0g/ml、如颗粒密度为至少3.5g/ml、如颗粒密度为至少4.0g/ml、如颗粒密度为至少4.5g/ml。甚至更优选的是，吸附剂颗粒包括具有平均体积颗粒直径为至多90μm和颗粒密度为至少1.5g/ml的颗粒，如颗粒密度为至少1.6g/ml、如颗粒密度为至少1.9g/ml、如颗粒密度为至少2.0g/ml、如颗粒密度为至少2.3g/ml、如颗粒密度为至少2.5g/ml、如颗粒密度为至少2.8g/ml、如颗粒密度为至少3.0g/ml、如颗粒密度为至少3.5g/ml、如颗粒密度为至少4.0g/ml、如颗粒密度为至少4.5g/ml。甚至更优选的是，吸附剂颗粒包括具有平均体积颗粒直径为至多75μm和颗粒密度为至少1.5g/ml的颗粒，如颗粒密度为至少1.6g/ml、如颗粒密度为至少1.9g/ml、如颗粒密度为至少2.0g/ml、如颗粒密度为至少2.3g/ml、如颗粒密度为至少2.5g/ml、如颗粒密度为至少2.8g/ml、如颗粒密度为至少3.0g/ml、如颗粒密度为至少3.5g/ml、如颗粒密度为至少4.0g/ml、如颗粒密度为至少4.5g/ml。甚至更优选的是，吸附剂颗粒包括具有平均体积颗粒直径为至多50μm和颗粒密度为至少1.5g/ml的颗粒，如颗粒密度为至少1.6g/ml、如颗粒密度为至少1.9g/ml、如颗粒密度为至少2.0g/ml、如颗粒密度为至少2.3g/ml、如颗粒密度为至少2.5g/ml、如颗粒密度为至少2.8g/ml、如颗粒密度为至少3.0g/ml、如颗粒密度为至少3.5g/ml、如颗粒密度为至少4.0g/ml、如颗粒密度为至少4.5g/ml。甚至更优选的是，吸附剂颗粒包括具有平均体积颗粒直径为至多40μm和颗粒密度为至少1.5g/ml的颗粒，如颗粒密度为至少1.6g/ml、如颗粒密度为至少1.9g/ml、如颗粒密度为至少2.0g/ml、如颗粒密度为至少2.3g/ml、如颗粒密度为至少2.5g/ml、如颗粒密度为至少2.8g/ml、如颗粒密度为至少3.0g/ml、如颗粒密度为至少3.5g/ml、如颗粒密度为至少4.0g/ml、如颗粒密度为至少4.5g/ml。
根据本发明所使用的吸附剂颗粒必须至少部分渗透到待分离的生物分子物质中，其目的是为了确保很多的结合容量。相比之下，不能渗透的颗粒仅能在其表面粘附目标分子，这导致相对低的结合容量。吸附剂颗粒可以是不同结构、组分和形状的排列。
吸附剂颗粒的高密度在很大程度上是通过在多孔聚合物相中的内含物或者某种比例的致密非多孔的芯材料来获得。非多孔的芯优选具有密度为至少4.0g/ml如至少5.0g/ml、如至少8.0g/ml、如至少10g/ml、如至少15g/ml。典型地，非多孔的芯材料具有在大约4.0-25g/ml范围的密度，如大约4.0-20g/ml、如大约4.0-15g/ml、如大约12-19g/ml、如大约14-18g/ml、如大约6.0-15.0g/ml、如大约6.0-10g/ml。
其它类型的高密度吸附剂颗粒是基于由多孔高密度材料如氧化锆制成的颗粒，在多孔材料中，用于吸附的孔配体可以直接固定在高密度材料或者用高密度材料填充孔的多孔聚合网状结构，参见如美国专利US 6,036,861和国际专利WO 99/51316。尽管是提供高密度和小吸附剂颗粒的有吸引力的方法，但是这类吸附剂通常有一些缺点，这是因为在多孔结构中的扩散限制以及高体积量的高密度相导致低的可达到的蛋白质结合体积(accessible proteinbinding volume)。
对于广泛范围的本发明优选实施方式，根据本发明所使用的吸附剂颗粒具有高的可达到的蛋白质结合体积，这是很关键的。在本文中，术语“颗粒可达到的蛋白质结合体积”涉及任何特定颗粒类型的相对孔体积，并且表示为相对于整个颗粒珠体积的体积百分比(即由孔所占据的体积/颗粒珠的总体积×100％)。因此，如果过多的颗粒体积被高密度材料占据，则只能获得低的体积生产率。
在本发明的实施方式中，吸附剂的颗粒可达到的蛋白质结合体积可以为至少20％，更优选为至少30％，更优选为至少40％，更优选为至少50％，更优选为至少55％，更优选为至少60％，更优选为至少65％，更优选为至少70％，更优选为至少75％，更优选为至少80％，更优选为至少85％，更优选为至少90％。
在本发明的实施方式中，吸附剂在10％的突破点可以具有对所述至少一个特定的蛋白质的动力学结合容量为至少5g/l的沉降的吸附剂，更优选为至少10g/l，甚至更优选为至少15g/l，更优选为至少20g/l，更优选为至少25g/l，更优选为至少30g/l，更优选为至少35g/l，更优选为至少40g/l，更优选为至少50g/l，更优选为至少60g/l。
当蛋白质溶液加入到吸附剂柱时，为了保留吸附剂的高容量以及获得高纯度的待分离的一种蛋白质或多种蛋白质，出现在吸附柱中的吸附剂颗粒与蛋白质溶液的比例可以最优化。在本发明优选的实施方式中，出现在吸附柱中的吸附剂颗粒相对于装载在吸附柱中的蛋白质溶液是以至少1∶100的比例来提供，如为至少1∶50、如为至少1∶30、如为至少1∶15、如为至少1∶10、如为至少1∶5、如为至少1∶1、如为至少1∶0.5，其比例是以体积/体积为基础计量。
因此，吸附剂颗粒可以由许多具有在给定的流速下操作所必须的密度、直径和/或者结合容量的、化学衍生的多孔材料来构成。颗粒可以是具有至少两个由多孔材料所包围的非多孔芯的聚结型颗粒(如在WO 92/00799中所述的)或者具有单个由多孔材料所包围的非多孔芯的薄片型颗粒。
在本文中，术语“聚结型”涉及以下颗粒材料组成的颗粒，该颗粒材料含有不同类型和尺寸的芯材料的、通过聚合物的基体结合一起的颗粒珠，例如芯颗粒包括两个或者两个以上的由所围绕的聚合物的基体(琼脂糖)结合一起的高密度颗粒。
在本文中，术语“薄片型”涉及复合颗粒，在复合颗粒中，每个颗粒包括仅仅一个涂覆有一层多孔聚合物基体的高密度芯材料，如高密度不锈钢的涂覆有琼脂糖的颗粒珠。
因此，术语“至少一个高密度非多孔芯”涉及包括一个单一的高密度非多孔颗粒的薄片芯，或者涉及一种包括一个以上的高密度非多孔颗粒的聚结芯。
吸附剂颗粒如所述的吸附剂颗粒可以包括一个由多孔材料所围绕的高密度非多孔芯，并且所述多孔材料根据情况在其外部表面包括一种配体。
在本文中，术语“芯”涉及非多孔芯的颗粒或者出现在吸附剂颗粒内部的芯颗粒。芯颗粒或者芯颗粒可以偶然地分布在多孔材料内，并不限制其位于吸附剂颗粒的中心。
非多孔芯典型地构成为至多70％的吸附剂颗粒的总体积，如为至多60％，优选为至多50％，优选为至多40％，优选为至多30％，优选为至多20％，优选为至多15％，优选为至多10％，优选为至多5％。
合适的非多孔芯材料的例子有无机化合物、金属、重金属、基本的非金属、金属氧化物、非金属氧化物、金属盐和金属合金等，只要满足在密度标准以上。这种芯材料的例子有金属硅酸盐；金属硼硅酸盐；陶瓷包括二硼化钛、碳化钛、二硼化锆、碳化锆、碳化钨、碳化硅、氮化铝、氮化硅、氮化钛、氧化钇、硅金属粉末以及二硅化钼(molybdenum disilide)；金属的氧化物和硫化物包括镁、铝、钛、钒、铬、锆、铪、锰、铁。钴、镍、铜和银的氧化物；非金属氧化物；金属盐包括硫酸钡；金属元素包括钨、锆、钛、铪、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铟、铜、银、金、钯、铂、钌、锇、铑、铱以及金属元素合金如所述金属元素的合金如不锈钢；结晶和无定形形式的碳包括石墨、碳黑和木炭。优选的非多孔芯材料有碳化钨、钨、钢和钛颗粒珠如不锈钢颗粒珠。
多孔材料是一种聚合物基体，它用作覆盖和保持多个(或者单个)芯材料结合一起并且在吸附剂颗粒内的工具，以及作为结合吸附配体的工具。
聚合物的基体可以在有些类型的天然或者合成的有机聚合物中寻找，该有机聚合物典型地选自i)天然和合成的多聚糖以及其它碳水化合物为基的聚合物包括琼脂、藻酸盐、豆胶、阿拉伯树胶、印度树胶、黄蓍胶、刺梧桐树胶、卡拉胶、黄原胶、琼脂糖、纤维素、果胶、粘蛋白、右旋糖苷、淀粉、肝磷脂、壳聚糖、羟基淀粉、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉、羧乙基淀粉、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素；ii)合成的有机聚合物和生成聚合物的单体包括丙烯酸聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚醚、聚合的乙烯基化合物、聚烯烃以及它们的取代的衍生物、包括多个这种聚合物的共聚物以及它们的取代的衍生物；以及iii)其混和物。
优选组的聚合物基体是多聚糖如琼脂糖。
本发明的研究者已经发现为了确保在高流速条件下有效的吸附，必须使吸附剂颗粒的平均体积颗粒直径最小化。因此，在本发明的优选实施方式中，吸附剂颗粒的的平均体积颗粒直径为至多150μm，典型的平均体积颗粒直径在大约40-150μm的范围。典型的吸附剂颗粒的平均体积颗粒直径为至多120μm，特别是为至多100μm，更优选为至多90μm、80μm或者75μm，更优选为70μm，最优选为60μm。
从生产率方面来看，吸附剂能够粘附高的生物分子量/单元体积的吸附剂是很重要。因此，我们已经发现，优选应用具有聚合物相的吸附剂(即可渗透的聚合物网状结构，配体位于其中，并且是真实吸附所发生的地方)，该聚合物相构成为至少50％的吸附剂颗粒的体积，优选至少70％，更优选为80％，最优选为至少50％的吸附剂颗粒的体积。
配体一种或者多种蛋白质的分离方法可以通过粘附合适配体在吸附剂上来提供，并且通过粘附合适配体在吸附剂上使该方法更容易。在本发明的实施方式中，吸附剂包括职能化的基体聚合物，它负载多个含有共价键连接的官能团的配体。在本发明优选的实施方式中，该配体包括芳香环或者杂芳香环的系统和一种或者多种酸基团。
在本文中，术语“职能化基体聚合物”涉及配体的停泊位置，它促进所想要的蛋白质吸附特征。依赖于吸附剂颗粒的结构，基体聚合物可以形成限定吸附剂颗粒的物理形状的支柱或者骨架，或者它可以是占据用作吸附剂颗粒支柱或者骨架的另外材料的孔洞的聚合物。在优选的实施方式中，职能化基体聚合物是合成或者天然的有机聚合物如多聚糖(如聚丙烯酸聚合物、琼脂糖或者纤维素)，或者他可以是无机聚合物如硅石。在特殊情况下，基体聚合物自身可以构成为蛋白质吸附位置，在这种情况中，不必固定进一步的配体在聚合物上。
在本发明的实施方式中，吸附剂包括负载多个共价键连官能团的职能化基体聚合物，所述基团具有以下通式M-SP1-X-A1K式中，M代表吸附剂聚合物；SP1代表可选择性地用-A-SP2-ACID、-A或者-ACID来取代的选择性间隔基；X代表-O-、-S-、-NH--或者NA1K-；A1K可以缺省的、-A-SP2-ACID、-A、-ACID或者C1-4烷基，其中C1-4烷基可以选择性地用-A-SP2-ACID、-A、-ACID来取代；A代表可选择性取代的芳香或者杂芳香环部分；SP2代表可选择的间隔基；以及ACID代表一种或者多种酸基团；其中至少一个SP1或者A1K是用-A-SP2-ACID或者-A来取代，至少一个SP1或者A1K包括-ACID，其中出现至少一个SP1或者A1K。如果A1K缺省，X也将缺省。
在本发明的实施方式中，吸附剂可以结合配体，它在pH值为10或者更低下带有一个正电荷，如pH值为9或者更低、如pH值为8或者更低、如pH值为7或者更低、如pH值为6或者更低、如pH值为5或者更低、如pH值为4或者更低。
进一步地发现，为了获得吸附剂的高结合容量和高化学稳定性，官能团在尺寸和复合度上不应该太大。因此，已经发现，更大的分子重量和环数目(在许多物质的官能团中所出现的)仅仅增加吸附剂的成本而没有带来更高的结合容量(在每升吸附剂可以结合的蛋白质数量)。而且，如果使用大分子的官能团，在吸附剂上可以获得的共价键连接的官能团的浓度可以更低(可能是由于位阻)。
因此，在本发明的实施方式中，对于每个附着在基体聚合物上的官能团，共价键连接的官能团包含最大为三个单环或者双环的芳香族或者杂芳香族的环系统；更优选最大为两个单环或者双环的芳香族或者杂芳香族的环系统；对于每个附着在基体聚合物上的官能团，甚至更优选最大为一个单环或者双环的芳香族或者杂芳香族的环系统。同样地，在本发明的实施方式中，共价键连接的官能团包含最大为三个酸基团，优选最大为两个酸基团，最优选最大为一个酸基团附着在出现在共价键连接的官能团上的、每个芳香或者杂芳香的环系统上。
在本发明优选实施方式中，一个或者多个酸基团选自由以下组成的组羧酸、磺酸、磷酸、硼酸以及其组合。
在本发明实施方式中，配体可以从以下物质衍生二乙基氨基乙基团、聚亚烷基亚胺、烷基胺、烷基二胺或者聚丙烯胺。优选的是，具有3-14个原子的链烷和1-5个胺官能团的烷基胺或者烷基二胺是合适的。形成链部分的原子可以涉及C(碳)、N(氮)、O(氧)和/或S(硫)。
在本发明的实施方式中，吸附剂可以包括具有芳香基团和胺基团如芳香胺或者芳香二胺的配体。优选的芳香二胺有1，4-二甲苯-二胺或者1，4-二甲苯-二胺的异构体。
在本发明实施方式中，吸附剂可以结合具有酸基团、芳香环或者杂芳香环部分、杂芳香环基团或者其任何组合所取代的二元环的配体，如具有酸基团和芳香环或者杂芳香环部分的配体；具有酸基团和杂芳香环基团、或者芳香环、或者杂芳香环部分所取代的二元环的配体；以及杂芳香环部分所取代的二元环的配体。
在本发明实施方式中，配体可以包括杂芳香环部分所取代的二元环，它可以从选自以下组的化合物衍生，该组包括苯并咪唑、苯并噻唑和苯并唑。
在本发明的实施方式中，配体可以是选自以下组的芳香或者杂芳香酸，该组包括羧酸、磺酸、磷酸、硼酸。优选的是，配体可以是选自由以下组成的组2-巯基苯甲酸、2-巯基烟酸、2-氨基苯酸、3-氨基苯酸、4-氨基苯酸、4-羟苯基-巯基-乙酸、4-羟苯基-巯基-丙酸、4-羟苯基-巯基-丁酸、2，3-二羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸、2，5-二羟基苯甲酸、2，6-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸、3，5-二羟基苯甲酸、巯基苯并咪唑磺酸(mercaptobenzimidazolesulfonic acid)、邻氨基苯磺酸、间氨基苯磺酸、对氨基苯磺酸、4-甲基苯基胺-2-磺酸、4-甲氧基苯基胺-2-磺酸、苯胺-2，5-二磺酸、N-甲基间氨基苯磺酸、7-氨基-1-萘酚-3-磺酸、1-萘酚-4-磺酸、2-萘酚-6-磺酸以及2-羟基-3-萘酸、巯基苯并咪唑磺酸(mercaptobenzimidazole-sulphonic acid)。
在本发明的实施方式中，配体可以是N-苯甲酰胺酸或者包含硫醇或者巯基的N-苯甲酰胺酸。
在本发明实施方式中，配体可以通过硫醇-醚连接、胺连接或者羟基-醚连接与吸附剂结合。
在聚合物的吸附剂骨架中共价键连官能团(配体)的最佳浓度(还经常称为官能团或者配体浓度)将依赖于官能团的详细结构和制备吸附剂所使用的吸附剂材料的种类。
为了确保最佳的吸附强度和吸附剂的生产率，已经发现，在吸附剂中的配体浓度是很重要。因此，在合适的实施方式中，吸附剂负载用于吸附生物分子物质配体，该配体的浓度为至少20mM(毫摩尔)如至少30mM或至少40mM，优选为至少50mM，最优选为至少60mM。
然而，通常优选的是，吸附剂具有共价键连接的官能团在其沉降(填充)床中的浓度为5-500mM/l(毫摩尔/升)的范围，更优选为10-250mM/l的范围，更优选为10-125mM/l的范围，更优选为15-100mM/l的范围，更优选为20-80mM/l的范围，更优选为25-75mM/l的范围，更优选为30-60mM/l的范围。
在本发明的实施方式中，共价键连接的官能团可以通过已知的本身可应用于该目的的任何共价键与吸附剂连接，或者通过配体和吸附剂之间的直接化学反应，或者通过用已知的本身可能使聚合物基体骨架与官能团连接的合适试剂而进行的吸附剂或者配体的前述活化。这种合适的活化剂的例子有表氯醇；表溴醇；聚烯丙基缩水甘油醚；双-环氧化合物如丁二醇二缩水甘油醚；卤代脂肪族化合物如二氯丙醇、羰基二咪唑；醛如戊二醛；苯醌；高碘酸盐如高碘酸钠；碳二亚胺；磺酰氯如甲苯磺酰基氯、三氟代乙烷磺酰氯；N-羟基琥珀酰亚胺；2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸；唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物以及酰肼。在这些化合物中，优选的是使间隔基团SP1不同于单键的活化剂如表氯醇；表溴醇；聚烯丙基缩水甘油醚；双-环氧化合物；卤代脂肪族化合物；醛；苯醌；溴化氰；氯-三嗪；唑酮；马来酰亚胺；吡啶基二硫化物；酰肼。
特别令人关注的活化剂有环氧化合物如表氯醇、聚烯丙基缩水甘油醚和丁二醇二缩水甘油醚以及聚甘油醚(polyglycidylether)如丙三醇聚甘油醚。在某些情况中，在该情况州中官能团的共价键连接的稳定性显示出用氢氧化钠如0.1M-0.2M(摩尔/l)来处理很稳定，活化剂可以是基于三嗪衍生的试剂如氯-三嗪如氰尿酰氯。
上述提到的可能性使限定内衬于聚合物吸附剂骨架(也称为基体聚合物)中的、可选择的间隔基SP1的出现与其相关。在本文中，间隔基SP1可以认为是活化剂的一部分，它在基体聚合物与官能团之间形成连接。因此，间隔基SP1与活化剂和所涉及的耦合反应相符。在有些情况如当使用碳二胺中，活化剂形成活化形式的基体聚合物或者官能团试剂。在耦合反应之后，在官能团和基体聚合物之间没有剩下活化剂部分，因此，SP1是简单的单键。
在其它的情况中，间隔基SP1可以是影响连接特征的官能团的主要部分(即官能团)，并且，如果间隔基包括功能性的活化位置或者能够通过氢键、静电结合或者排斥、电荷转移等相互作用的组分如硫醇、胺、酸基团、砜基、硝基、羟基、腈基或者其它基团，这将会特别重要。
在其它情况中，间隔基SP1可以包括芳香或者杂芳香环，它对于吸附剂的结合特征起到重要的作用。这例如以下情况，苯醌和氯-三嗪用作吸附剂或者官能团的活化剂。
在进一步的情况中，间隔基可以是从选自以下的活化剂衍生的单基团或者双基团表氯醇、聚烯丙基缩水甘油醚、烯丙基溴、双-环氧化合物如丁二醇二缩水甘油醚、卤代脂肪族化合物如1，3-二氯丙基-2-醇、醛如戊二醛、苯醌、溴化氰、氯-三嗪如氰尿酰氯、2-氟-1-甲基吡啶甲苯-4-磺酸、马来酰亚胺、唑酮、酰肼。
在本发明的实施方式中，间隔基SP1可以是短链脂肪族双基团如具有以下化学式-CH2-CH(OH)-CH2-(从表氯醇衍生的)、-(CH2)3-O-CH2-CH(OH)-CH2-(从聚烯丙基缩水甘油醚衍生的)或者-CH2-CH(OH)-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH(OH)-CH2-(从丁二醇二缩水甘油醚衍生的)，或者为单基团。在本发明实施方式中，吸附剂典型地包括选自以下组的含有芳香或者杂芳香基团的配体，该组包括i)含有以下类的作为官能团的配体苯甲酸如2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、2-巯基苯甲酸、4-氨基-2-氯苯甲酸、2-氨基-5-氯苯甲酸、2-氨基-4-氯苯甲酸、4-氨基水杨酸、5-氨基水杨酸、3，4-二氨基苯甲酸、3，5-二氨基苯甲酸、5-氨基异酞酸、4-氨基异酞酸；司玛酸(cinnmaic acid)如羟基-司玛酸(cinnmaic acid)；烟酸如2-巯基烟酸；萘酸如2-羟基-1-萘酸、喹啉如2-巯基喹啉；四唑乙酸如5-羟基-1-四唑乙酸；噻重氮如2-羟基-5-甲基-1，3，4-噻重氮；苯并咪唑如2-氨基苯并咪唑、2-巯基苯并咪唑和2-巯基-5-硝基苯并咪唑；苯并噻唑如2-氨基苯并噻唑、2-氨基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基苯并噻唑、2-巯基-6-乙氧基苯并噻唑；苯并唑如2-巯基苯并唑；苯硫酚如苯硫酚和2-氨基苯硫酚；2-(4-氨基苯硫基)乙酸；芳香或者芳香杂环磺酸和磷酸如1-氨基-2-萘酚-4-磺酸；苯酚如2-氨基-4-硝基-苯酚。应该指出的是，以下情况M是琼脂糖情况下，SP1是从乙烯基砜，以及L是4-氨基苯甲酸，根据本发明(参考专利WO 92/16292)，这种情况可以明确地拒接固相基体。最优选的是氨基苯甲酸如2-氨基苯甲酸、2-巯基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、4-氨基苯甲酸、4-氨基-2-氯苯甲酸、2-氨基-5-氯苯甲酸、2-氨基-4-氯苯甲酸、4-氨基水杨酸、5-氨基水杨酸、3，4-二氨基苯甲酸、3，5-二氨基苯甲酸、5-氨基异酞酸、4-氨基异酞酸。通常地，使用乙烯基砜的耦合反应可能不合适，因为乙烯基砜耦合反应是不稳定的(当与碱性物接触时)，并且碱性物是目前最合适的和常使用的澄清剂(cleaning agent)，二乙烯基砜耦合的吸附剂并不认为与工业化相关。ii)含有2-羟基-司玛酸(cinnmaic acid)、3-羟基-司玛酸(cinnmaic acid)、4-羟基-司玛酸(cinnmaic acid)的配体；iii)含有以下的、作为取代基的羧酸和氨基的配体，如2-氨基烟酸、2-巯基烟酸、6-氨基烟酸和2-氨基-4-羟基嘧啶-羧酸；iv)含有从与杂芳香环系统熔合的苯环中衍生的基团的配体，如选自以下的配体苯并咪唑如2-巯基苯并咪唑、2-巯基-5-硝基-苯并咪唑；苯并噻唑如2-氨基-6-硝基苯并噻唑、2-巯基苯并噻唑、2-巯基-6-乙氧基苯并噻唑；苯并唑如2-巯基苯并唑；以及v)选自苯硫酚如苯硫酚和2-氨基苯硫酚组的配体。
在配体选自上述的i)组-v)组的实施方式内，吸附剂典型地具有动力学结合容量为至少10g/L(生物分子物质/升)，更优选为至少为20g/L，更优选为至少为30g/L(当根据在相关领域所使用的方法条件来测试时)。吸附剂的结合容量可以以它结合牛血清白蛋白(BSA)的容量来确定。结合容量典型地为结合BSA至少10g/L(根据测试方法A)。
方法A方法A是一种用来确定所选择的吸附剂的牛血清蛋白结合容量的方法，包括以下过程牛血清白蛋白溶液pH值4.0(BSA pH4.0)纯化的牛血清白蛋白(A 7906，Sigma，USA)溶解在20毫升的pH值为4.0的柠檬酸钠中，得到最终浓度为2mg/ml的溶液。吸附剂用50体积的20毫升的pH值为4.0的柠檬酸钠清洗，并在吸滤器上抽干。
1.0ml的抽干的吸附剂样品放入50ml的试管中，接着加入30ml的pH值为4.0的BSA。
试管然后用塞子封闭，悬浮液在辊轴混合器上以及在室温条件(20-25℃)下孵育2小时。然后，试管在2000rpm(转每分钟)条件下离心5分钟，其目的是使吸附剂沉降完全。然后，上清液通过吸液到分开的试管中从吸附剂中分离出来，应避免任何吸附剂颗粒的遗留物，并且用很小的非吸附的0.2μm过滤器(Millipore，USA)来过滤。紧接着，通过在分光光度计上测量在280nm处的光学密度(OD)，确定在上清液中的没有结合的BSA量。
然后，结合到吸附剂上的BSA量可以根据以下式子来计算mg结合的BSA/ml＝(1-测试的上清液的OD/BSA开始溶液的OD)×60mg BSA/ml吸附剂过程参数如上所述，包括一种或者多种所关心的蛋白质的蛋白质溶液可以调整为具有预设的pH值和预设的离子强度或者导电率。
在本文中，术语“预设的”涉及调整pH值、离子强度或者电导率分别至特定的和预定的值(目的是选择吸附剂结合一种或者多种所关心的蛋白质的能力，借此，增加吸附剂分离蛋白质的效率)。
在本发明的实施方式，预设的pH值是在pH3.0-10.0的范围，优选在pH4-9的范围，更优选在pH4-8的范围，甚至更优选在pH4-8的范围，甚至优选在pH4-7的范围，甚至优选在pH4-6的范围，甚至优选在pH4.5-5.5的范围或者在4-10的范围，优选在pH5-9的范围，甚至优选在pH6-9的范围，甚至优选在pH6-8的范围。
在本发明的实施方式中，预设的离子强度是在0.0001-12.0的范围，优选在0.0001-5的范围，更优选在0.0001-1的范围，更优选在0.0001-0.1的范围，更优选在0.0001-0.05的范围，更优选在0.0001-0.075的范围，更优选在0.01-0.005的范围或者在0.1-12.0的范围，优选在在0.5-12的范围，更优选在在1-12的范围，更优选在在1.5-12的范围，更优选在在2-12的范围，更优选在在4-12的范围。
在本发明的另一实施方式中，预设的电导率是在0.01-1000mS/cm的范围，优选在0.01-200mS/cm的范围，更优选在0.5-100mS/cm的范围，更优选在0.1-50mS/cm的范围，更优选在0.5-20mS/cm的范围，更优选在1.0-10mS/cm的范围，更优选在1.0-5mS/cm的范围或者在10-1000mS/cm的范围，优选在100-1000mS/cm的范围，更优选在200-1000mS/cm的范围，更优选在300-1000mS/cm的范围，更优选在400-1000mS/cm的范围，更优选在500-1000mS/cm的范围，更优选在600-1000mS/cm的范围，更优选在2.0-15mS/cm的范围，更优选在2.0-12mS/cm的范围，更优选在2.0-10mS/cm的范围。
本发明的蛋白质溶液的离子强度和电导率是相关的实体，这是因为两个实体都是在溶液中的离子浓度的函数。然而，在它们之间没有直接理论的一致性。
当评价含离子的溶液时，对于本技术领域人员很容易计算(如无机盐的)获得一个确定的离子强度所必须的量。相反地，当本技术领域人员面对在不知道添加盐的量情况下确定离子强度的问题时，很难作出准确的评估，这是因为离子强度是一个从离子浓度和离子电荷所计算出来的理论实体。在这种情况下，对于本技术领域人员来说，测试电导率则更容易。正是这些原因，术语“离子强度”和“电导率”用在本文中表征相同的状况。当谈到这两个量的优选范围时(尽管如此)，并不打算表面在所示的离子强度下限或者上限与电导率的下限或者上限之间存在任何的一致性。
对于从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质，一种或者多种蛋白质可以用一种或者多种缓冲溶液来洗提。可根据情况，在经过洗提缓冲溶液洗提之前，吸附剂可以用清洗缓冲溶液来清洗。在本发明实施方式中，在从吸附剂中洗提一种或者多种蛋白质之前，吸附剂是用清洗缓冲溶液来清洗掉非结合的材料。
病毒消除由于增加防止病毒疾病从血液捐献者传播到血液产品的接受者所必须的安全措施，必须引入一种或者多种病毒消除步骤。
在本发明的实施方式中，蛋白质溶液可以进行至少一种病毒消除处理。优选的是，在蛋白质溶液与吸附剂接触以前，可以进行至少一种病毒消除处理。
病毒消除处理涉及添加一种清洗剂和/或一种有机溶剂如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
在本发明实施方式中，可以进行几个病毒消除步骤，优选的是，在蛋白质溶液与吸附剂接触以前，可以进行一种病毒消除处理。
在本发明实施方式中，可以进行几个病毒消除步骤，优选的是，在蛋白质溶液与吸附剂接触以前，进行一种病毒消除处理，并且，在吸附步骤期间，添加到蛋白质溶液中的任何物质如清洗剂和/或有机溶剂保持未与吸附剂结合，在洗提待分离的蛋白质溶液之前，从吸附柱中清洗掉这些物质。
在本发明的实施方式中，用于消除在生物流体中的病毒的方法可以通过用有机溶剂和/或者去污剂处理(特别是用磷酸三正丁酯(TNBP)和非离子性去污剂如吐温80或者曲通(Triton)×-10来处理)来进行。该方法可以获得良好的不稳定蛋白质如凝血因子VIII、凝血因子IX回收率，而且获得高水平的杀病毒效果如杀死率≥106到≥108ID的包膜病毒，然而非包膜病毒消除很少。美国专利US 4,481,189公开了通过用非阴离子去污剂、醇、醚或者其混和物处理来进行病毒消除。美国专利US 4,481,189此处引入作为参考。
在本发明中，常见使用和可使用于在输液中所使用的生物流体的其它病毒消除方法也可以是在60℃或者更高温度下进行热处理，或者是单独用UVC或与B-丙酸内脂(B-PL)一起来进行的处理。
进一步的实施方式在本发明实施方式中，该方法进一步涉及使吸附剂经过洗提缓冲液(第一缓冲液)以洗提至少一种所述一种或者多种蛋白质的步骤。
使用吸附剂并结合本发明的官能团(配体)从蛋白质溶液如从血浆或者血清或者其它血源中分离至少一种或者多种蛋白质，这一过程包括以下步骤(i)提供包含一种或者多种血浆或者血清蛋白的、具有预设的pH值和预设的离子强度的蛋白质溶液；(ii)使所述溶液与吸附剂接触，选择性地用一种或者多种平衡缓冲溶液清洗，从而，一种或者多种血浆或者血清蛋白质可以被可逆地结合到吸附剂上或者保持未被结合；(iii)用清洗缓冲溶液来清洗吸附剂，获得一种包含非结合材料的蛋白质馏分；(iv)用至少一种洗提缓冲溶液清洗吸附剂，获得至少一种含有可被吸附剂可逆结合的蛋白质的洗出液；(v)使在清洗缓冲溶液中所获得的蛋白质或者在洗提缓冲溶液中所获得蛋白质进行进一步的、包括至少一种病毒消除步骤的下游处理。而且，与吸附剂耦合的配体可以包括一种负载有多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团(带负电荷并且pH值为4.0以上)的官能团的职能化基体聚合物。
为了移除未结合的材料(包括未结合的蛋白质)，吸附剂可以经过清洗缓冲溶液。在本发明的实施方式中，从蛋白质溶液中待分离的一种或者多种蛋白质溶液可以用清洗缓冲液来清洗掉吸附剂。该清洗可以在使吸附剂经过洗提缓冲液之前进行操作(如上所述)。在本发明的实施方式中，α-1-蛋白酶抑制剂作为非结合蛋白质可以用清洗缓冲溶液被清洗掉。本领域技术人员很容易改变工业条件、吸附剂和配体，以改变的方式，一种或者多种血清或者血浆蛋白(非α-1-蛋白酶抑制剂)可以用清洗缓冲溶液来清洗掉，而α-1-蛋白酶抑制剂可以被结合。
在实施方式中，清洗和/或者洗提可以用具有比蛋白质溶液的预设pH值和预设离子强度更高的pH值和/或更高的离子强度的清洗缓冲溶液和/或洗提缓冲溶液来进行操作。
在另一实施方式中，清洗缓冲溶液和/或洗提缓冲溶液可以包括一种或者多种在相同的分子内具有疏水性和带负电荷的基团的化合物，如带负电荷的去污剂如辛基硫酸盐、溴酚兰、辛烷磺酸盐、月桂基肌氨酸钠、己烷磺酸盐、十二烷基硫酸钠、辛酸钠。
为了从吸附剂中获得一种或者多种另外的蛋白质，本发明的方法进一步包括用一种或者多种另外的洗提缓冲溶液来洗提剩下的蛋白质。
在本文中，术语“另外的洗提缓冲溶液”涉及后来用于洗提一种或者多种蛋白质的洗提缓冲溶液，其中，所述蛋白质为在用第一洗提缓冲溶液洗提之后仍然保持与吸附剂结合的蛋白质。
在本文中，术语“剩下的蛋白质”涉及一种或者多种蛋白质，它在经过第一洗提缓冲溶液之后仍保持与吸附剂结合，并且，该蛋白质可以随后通过加入一种另外的洗提缓冲溶液来洗提出来。
在本发明的实施方式中，在每个洗提步骤之间，吸附剂可以用另外的清洗缓冲溶液来清洗。
在本文中，术语“蛋白质馏分”涉及从待分离的一种或者多种蛋白质所位于的吸附剂中获得的收集物。该蛋白质馏分可以经过进一步的下游处理，进一步地分离所出现的一种或者多种蛋白质。进一步的下游处理可以涉及操作如过滤、离心、沉降、微量过滤、沉淀和色谱法。在本发明实施方式中，色谱法涉及离子交换色谱、凝胶过滤、亲合色谱法、疏水作用色谱法、反相色谱法，其中，在随后的下游处理过程中，蛋白质可以结合到第二吸附剂上。
在本发明的实施方式中，进一步的下游处理可以包括蛋白质馏分中的蛋白质如α-1-蛋白酶抑制剂被吸附到带正电的离子交换剂上。
在本发明的实施方式中，进一步的下游处理可以包括蛋白质馏分中的蛋白质如α-1-蛋白酶抑制剂被吸附到烷基二胺如二氨基己烷、二氨基庚烷、二氨基辛烷以及其异构体或者衍生物。
在本发明的实施方式中，α-1-蛋白酶抑制剂在第一吸附步骤中未被结合，进一步的下游处理包括α-1-蛋白酶抑制剂被吸附到烷基二胺如二氨基己烷、二氨基庚烷、二氨基辛烷、二氨基壬烷、二氨基癸烷以及其异构体或者衍生物。
在本发明的实施方式中，进一步的下游处理包括蛋白质馏分中的蛋白质如α-1-蛋白酶抑制剂被吸附到一种具有感胶离子盐(lyotropic salt)的吸附剂，如但不限制于硫酸铵、硫酸钾、硫酸钠、磷酸铵、磷酸钾和柠檬酸钠。在优选的实施方式中，在含有α-1-蛋白酶抑制剂的溶液中感胶离子盐的浓度为至少0.1M(摩尔每升)，至少0.25M如至少0.5M，至少0.75M，至少1.25M，至少1.5M，至少1.75M或者至少2M。
在本发明的实施方式中，进一步的下游处理包括蛋白质馏分中的蛋白质如α-1-蛋白酶抑制剂被吸附到一种具有感胶离子盐(lyotropic salt)或者没有感胶离子盐的吸附剂，其中，该吸附剂包括疏水配体如含有长的、可选择取代的烷基链(如丁基、己基、癸基、十二烷基的衍生基团)和/或芳香和杂芳香环结构(如苯基、萘基、苯并咪唑的衍生基团)的不带电荷的配体。还有优选的配体如在美国专利US 6,610,630中所公开的那些，其中，它公开了用巯基-杂环配体作为色谱法吸附剂，因此，该专利此处引入作为参考。进一步优选配体是含有正电荷的、pH值为和低于4的混合模式配体，如含有长的、可选择性取代的烷基链(如丁基、己基、癸基、十二烷基的衍生基团)和/或芳香和杂芳香环结构(如苯基、萘基、苯并咪唑的衍生基团)的正电荷配体。这种配体的非限制性例子有丁基胺、己胺基-、癸胺基-和苯基丁胺基-。
在本发明的实施方式中，提供一种用于根据本发明大规模地分离一种或者多种蛋白质的方法，该方法包括以下步骤a)提供包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值以及可选择性的预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种蛋白质。
在本发明的进一步实施方式中，提供一种用于根据本发明大规模地分离一种或者多种蛋白质的方法，该方法包括以下步骤a)提供包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值以及可选择性的预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种含有至少一种高密度非多孔芯的、并被多孔材料所包围的、和/或所述颗粒的密度至少为1.5g/ml平均体积颗粒直径最多为150μm的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种蛋白质。
在本发明的实施方式中，通过串联两种或者两种以上吸附剂的方式如3种吸附剂、如4种吸附剂、如5种吸附剂、如6种吸附剂、如7种吸附剂、如8种吸附剂、如9种吸附剂、如10种吸附剂，从蛋白质溶液中分离两种或者两种以上的蛋白质。
在3种吸附剂串联中，发生以下过程a)第一吸附剂能够捕获一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白；b)第二吸附剂能够捕获一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白，它不同于第一吸附剂所能够捕获的一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白；c)第三吸附剂能够捕获一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白，它不同于第一吸附剂或者第二吸附剂所能够捕获的一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白；在本发明的实施方式中，一种或者多种凝血因子或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白被结合在第一吸附剂上。在本发明的实施方式中，至少两种凝血因子或者抗凝血因子结合到吸附剂上如至少3种凝血因子或者抗凝血因子、如至少4种凝血因子或者抗凝血因子、至少5种凝血因子或者抗凝血因子、至少6种凝血因子或者抗凝血因子、至少7种凝血因子或者抗凝血因子、至少8种凝血因子或者抗凝血因子。
在本发明的另一实施方式中，至少一种选自以下的蛋白质白蛋白、IgG、转铁蛋白、纤维蛋白原被结合到第二吸附剂上。在本发明的实施方式中，至少两种蛋白质结合到该附剂上，如至少3种、如至少4种。
在本发明的实施方式中，至少一种α-1-蛋白酶抑制剂或者α-1-酸-糖蛋白结合到第三吸附剂上。在本发明的实施方式中，至少两种蛋白质结合到该吸附剂上。
在本发明的进一步实施方式中，选自由以下组成的组的蛋白质IgG、白蛋白、纤维蛋白原、α-1-蛋白酶抑制剂、α-1-酸-糖蛋白以及一种或者多种凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白在至少两种单独的蛋白质馏分中分离出来，如至少3中单独蛋白质馏分、如至少4中单独蛋白质馏分、如至少5中单独蛋白质馏分、如至少6中单独蛋白质馏分。而且，优选的是，在蛋白质馏分中各个蛋白质的交叉污染程度为至多20％如至多15％、如至多10％、如至多5％、如至多3％、如至多1％、如至多0.5％、如至多0.1％、如至多0.01％。优选地，各个蛋白质馏分在单个吸附循环中获得。
根据本发明，待分离的一种或者多种蛋白质可以通过以下方式来分离(i)待分离的一种或者多种蛋白质可以经过吸附剂来清洗，而没有特定地结合到在清洗缓冲溶液中所收集的吸附剂上。
(ii)待分离的一种或者多种蛋白质可以特定地结合到吸附剂上，随后，用一种或者多种的洗提缓冲溶液来洗提，并且在一种或者多种的洗提缓冲溶液中收集。
(iii)待分离的一种或者多种蛋白质可以经过吸附剂来清洗；另外一种或者多种待分离的蛋白质可以特定地结合到吸附剂上，并且在洗提缓冲溶液中收集；所关心的一种或者多种蛋白质可以随后用一种或者多种的洗提缓冲溶液来洗提，并且在一种或者多种的洗提缓冲溶液中收集。
在本发明的实施方式中，纤维蛋白原可以被结合到吸附剂上，同时一种或者多种凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白可以从吸附剂中作为非结合材料来获得。优选地，至少50％的纤维蛋白原可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。
在本发明的另一实施方式中，白蛋白和IgG可以被结合到吸附剂上，同时α-1-蛋白酶抑制剂可以从吸附剂中作为非结合材料来获得。随后，白蛋白和IgG可以从吸附剂中通过逐步地洗提来获得。优选地，至少50％的白蛋白可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。优选地，至少50％的IgG可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。
在本文中，术语“逐步洗提”涉及加入到吸附剂中的洗提缓冲溶液在(但不限制于)离子强度或者电导率、pH值、极性、温度、竞争物质(competingsubstances)等方面的性能的逐步地但是不连续的变化。
在本发明的另一实施方式中，纤维蛋白原和IgG可以被结合到吸附剂上，同时白蛋白可以从吸附剂中作为非结合材料来获得。随后，纤维蛋白原和IgG可以从吸附剂中通过逐步地洗提来获得。优选地，至少50％的IgG可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。优选地，至少50％的纤维蛋白原可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。
在本发明的另一实施方式中，纤维蛋白原、白蛋白和IgG可以被结合到吸附剂上，同时α-1-蛋白酶抑制剂可以从吸附剂中作为非结合材料来获得。随后，纤维蛋白原、白蛋白和IgG可以从吸附剂中通过逐步地洗提来获得。优选地，至少50％的IgG可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。优选地，至少50％的纤维蛋白原可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。优选地，至少50％的白蛋白可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。
在本发明的另一实施方式中，至少1种如至少2种、如至少3种纤维蛋白原、白蛋白和IgG可以被结合到吸附剂上，同时α-1-酸-糖蛋白可以从吸附剂中作为非结合材料来获得。随后，纤维蛋白原、白蛋白和/或IgG可以从吸附剂中通过逐步地洗提来获得。优选地，至少50％的IgG可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。优选地，至少50％的纤维蛋白原可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。优选地，至少50％的白蛋白可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。
在本发明的另一实施方式中，至少1种如至少2种、如至少3种纤维蛋白原、白蛋白和IgG可以被结合到吸附剂上，同时α-1-酸-糖蛋白和/或α-1-蛋白酶抑制剂可以从吸附剂中作为非结合材料来获得。随后，纤维蛋白原、白蛋白和/或IgG可以从吸附剂中通过逐步地洗提来获得。优选地，至少50％的IgG可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。优选地，至少50％的纤维蛋白原可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。优选地，至少50％的白蛋白可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。
在本发明的实施方式中，至少50％的α-1-蛋白酶抑制剂、白蛋白、IgG、纤维蛋白原或者一种或者多种凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白可以从吸附剂中获得，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。
在本发明的实施方式中，白蛋白可以被结合到吸附剂上，同时α-1-蛋白酶抑制剂可以从吸附剂中作为非结合材料来获得。优选地，至少50％的白蛋白可以结合到吸附剂上，如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少98％。
在本发明实施方式中，α-1-蛋白酶抑制剂可以用包括以下步骤的方法从蛋白质溶液如血浆或者血清中分离(i)使含有IgG、白蛋白和α-1-蛋白酶抑制剂的血浆蛋白质水溶液与阴离子交换吸附剂在以下条件接触，即白蛋白和α-1-蛋白酶抑制剂结合到吸附剂上而IgG保持未被结合，所述蛋白质溶液是选自由以下组成的组预处理的cryo-poor血浆、预处理的cryo-poor血清、预处理的上清液I或者预处理的上清液II+III、预处理的上清液I+II+III；(ii)选择性地回收未被结合的IgG，获得一种富IgG的蛋白质馏分；(iii)从阴离子交换媒介中洗提白蛋白，获得一种富白蛋白的蛋白质馏分；以及(iv)从阴离子交换媒介中洗提以获得一种富α-1-蛋白酶抑制剂的蛋白质馏分。
在本发明的进一步实施方式中，非结合的蛋白质馏分可以包括经过吸附剂以高产量清洗的蛋白质如α-1-蛋白酶抑制剂、α-1-酸-糖蛋白、白蛋白、IgG或者纤维蛋白原。优选产量高于70％，更优选产量高于80％，优选产量高于90％的α-1-蛋白酶抑制剂。
本发明的进一步目标是提供一种方法，其中，所述的在非结合的蛋白质馏分中经过吸附剂以高产量清洗的蛋白质如α-1-蛋白酶抑制剂、α-1-酸-糖蛋白、白蛋白、IgG或者纤维蛋白原可以最后通过进一步的下游处理(如通过应用第二色谱吸附步骤)从非结合的蛋白质馏分中分离。
本发明的实施方式提供一种方法，其中，多种蛋白馏分通过每个吸附循环来提供，如至少2种蛋白质馏分、如至少3蛋白质馏分、如至少4蛋白质馏分、如至少5蛋白质馏分、如至少6蛋白质馏分。优选地，每个这些蛋白质馏分包含高产量的单个蛋白质，而没有在相同蛋白质馏分内的至少2种蛋白质之间出现蛋白质馏分的交叉污染，如至少3种蛋白质、如至少4种蛋白质、如至少5种蛋白质、如至少6种蛋白质。在本发明的实施方式中，在蛋白质馏分中的交叉污染量为小于20％如小于15％、如小于10％、如小于5％、如小于3％、如小于1％、如小于0.5％、如小于0.1％、如小于0.01％。
在本文中，术语“交叉污染”涉及所关心的出现在蛋白质馏分中的蛋白质的量或者含量。在某些情况中，重要的是，在一个洗提循环中同时洗提两种或者两种以上的蛋白质，在这种情况下，有意地洗提一起的蛋白质并不认为被污染。在本发明的实施方式中，在蛋白质馏分中，单个蛋白质的交叉污染程度为至多20％如至多为15％、如至多为10％、如至多为5％、如至多为3％、如至多为1％、如至多为0.5％、如至多为0.1％、如至多为0.01％。
在如下的非限制性图、所列举的条项和实施例中，进一步地说明本发明。


图1.是通过逐渐添加乙醇逐步分馏人血浆蛋白质，获得一系列的包含各种人血浆蛋白质的上清液和沉淀物的整个分馏过程。
图2.是含有紧密填充的吸附剂颗粒的填充床吸附柱和含有吸附剂颗粒的膨胀床吸附柱之间的不同，其中，它们都是用向上的液体流来流化，膨胀床吸附柱仍然有塞流、最小程度的反向混合。
图3.是从DEAE离子交换剂(在实施7中所使用的)中洗提出来的SDS-PAGE洗提液，并且显示出从DEAE离子交换剂中洗提出来的α-1-蛋白酶抑制剂具有高程度的纯度(用SDS-PAGE来测试，测试的纯度＞80％)。
图4.是弹性蛋白酶的结合活性，其中，泳道1包含蛋白质溶液而没有弹性蛋白酶孵育，泳道2包含蛋白质溶液+弹性蛋白酶孵育。实验显示出在蛋白质溶液(实施例5中的非结合馏分)中充分地所有α-1-蛋白酶抑制剂都是活性的，并且结合到弹性蛋白酶上。
图5.是实施例8中的结果，显示出很高程度的α-1-蛋白酶抑制剂洗提液(从用苄胺作为配体的实施例5中得到的)的纯度(用SDS-PAGE来测试，测试的纯度＞95％)。
列举条项1.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，其中，蛋白质溶液是从选自以下组的来源获得，该组包括血液如血清和/或者血浆以及其它血源，该方法包括以下步骤f)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；g)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；h)将所述蛋白质溶液应用于含有吸附剂的吸附柱，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径；i)根据情况清洗吸附柱；
j)从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质。
2.根据1项所述的方法，其中，蛋白质溶液进行至少一种病毒消除处理。
3.根据2项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
4.根据1-3项中的任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
5.根据1-4项中的任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
6.根据1-5项中的任一项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
7.根据1-6项中的任一项所述的方法，其中，一种或者蛋白是一种或者多种人血液蛋白质如一种或者多种人血浆蛋白质或者一种或者多种人血清蛋白质。
8.根据1-7项中的任一项所述的方法，其中，所述一种或者多种人血液蛋白质是选自由以下组成的组白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、α-1-蛋白酶抑制剂、前凝血蛋白(blood pro-coagulation protein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、载脂蛋白、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、纤连蛋白、β-2-糖蛋白I、纤维蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶激活剂、纤溶酶抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、内-α-胰岛素抑制剂(inter-alpha-trypsin inhibitor)、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血结素、补体C3、转铁蛋白、尿激酶、α-1-酸-糖蛋白以及凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质。
9.根据1-8项中的任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述一种或者多种人血液蛋白质作为非结合蛋白质被清洗出来。
10.根据9项所述的方法，其中，一种非结合的蛋白质是α-1-蛋白酶抑制剂。
11.根据1-10项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液已经被补充了醇。
12.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质如一种或多种血清蛋白或者一种或多种的血浆蛋白的方法，所述方法包括以下步骤f)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；g)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；h)将所述蛋白质溶液应用于含有吸附剂的吸附柱，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径；i)根据情况清洗吸附柱；j)从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质。
13.根据12项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
14.根据13项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
15.根据12-14项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液进行至少一种病毒消除处理。
16.根据15项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
17.根据15-16项中的任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
18.根据12-17项中的任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
19.根据12-18项中的任一项所述的方法，其中，一种或者多种蛋白是一种或者多种人血液蛋白质如一种或者多种人血浆蛋白质或者一种或者多种人血清蛋白质。
20.根据12-19项中的任一项所述的方法，其中，所述一种或者多种人血液蛋白质是选自由以下组成的组白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、α-1-蛋白酶抑制剂、前凝血蛋白(blood pro-coagulation protein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、载脂蛋白、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、纤连蛋白、β-2-糖蛋白I、纤维蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶激活剂、纤溶酶抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、内-α-胰岛素抑制剂(inter-alpha-trypsin inhibitor)、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血结素、补体C3、转铁蛋白、尿激酶、α-1-酸-糖蛋白以及凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质。
21.根据12-20项中的任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述一种或者多种人血液蛋白质作为非结合蛋白质被清洗出来。
22.根据21项所述的方法，其中，一种非结合的蛋白质是α-1-蛋白酶抑制剂。
23.根据12-22项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液已经被补充了醇。
24.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤f)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；g)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；
h)将所述蛋白质溶液应用于含有吸附剂的吸附柱，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径；i)根据情况清洗吸附剂；j)从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质。
其中蛋白质溶液已经被补充了醇。
25.根据24项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
26.根据25项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
27.根据24-26项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液进行至少一种病毒消除处理。
28.根据27项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
29.根据29项中的任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
30.根据24-29项中的任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
31.根据24-30项中的任一项所述的方法，其中，一种或者多种蛋白是一种或者多种人血液蛋白质如一种或者多种人血浆蛋白质或者一种或者多种人血清蛋白质。
32.根据24-31项中的任一项所述的方法，其中，所述一种或者多种人血液蛋白质是选自由以下组成的组白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、α-1-蛋白酶抑制剂、前凝血蛋白(blood pro-coagulation protein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、载脂蛋白、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、纤连蛋白、β-2-糖蛋白I、纤维蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶激活剂、纤溶酶抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、内-α-胰岛素抑制剂(inter-alpha-trypsin inhibitor)、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血结素、补体C3、转铁蛋白、尿激酶、α-1-酸-糖蛋白以及凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质。
33.根据24-32项中的任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述一种或者多种人血液蛋白质作为非结合蛋白质被清洗出来。
34.根据33项所述的方法，其中，一种非结合的蛋白质是α-1-蛋白酶抑制剂。
35.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤f)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；g)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；h)将所述蛋白质溶液应用于吸附剂，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；i)根据情况清洗吸附剂；j)从吸附剂中获得一种或者多种蛋白质。
36.根据35项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
37.根据36项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
38.根据35-37项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液进行至少一种病毒消除处理。
39.根据38项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
40.根据38-39项中的任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
41.根据35-40项中的任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
42.根据35-41项中的任一项所述的方法，其中，一种或者多种蛋白是一种或者多种人血液蛋白质如一种或者多种人血浆蛋白质或者一种或者多种人血清蛋白质。
43.根据35-42项中的任一项所述的方法，其中，所述一种或者多种人血液蛋白质是选自由以下组成的组白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、α-1-蛋白酶抑制剂、前凝血蛋白(blood pro-coagulation protein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、载脂蛋白、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、纤连蛋白、β-2-糖蛋白I、纤维蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶激活剂、纤溶酶抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、内-α-胰岛素抑制剂(inter-alpha-trypsin inhibitor)、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血结素、补体C3、转铁蛋白、尿激酶、α-1-酸-糖蛋白以及凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质。
44.根据35-43项中的任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述一种或者多种人血液蛋白质作为非结合蛋白质被清洗出来。
45.根据44项所述的方法，其中，一种非结合的蛋白质是α-1-蛋白酶抑制剂。
46.根据35-45项中任一项所述的方法，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒。
47.根据35-45项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
48.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和预设的离子强度或电导率；b)在使蛋白质溶液与吸附剂接触之前，对蛋白质溶液进行至少一次消除病毒的处理；c)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；d)根据情况清洗吸附剂；e)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种蛋白质。
49.根据48项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
50.根据48-49项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
51.根据50项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
52.根据48-51项中的任一项所述的方法，其中，一种或者多种蛋白是一种或者多种人血液蛋白质如一种或者多种人血浆蛋白质或者一种或者多种人血清蛋白质。
53.根据48-52项中的任一项所述的方法，其中，所述一种或者多种人血液蛋白质是选自由以下组成的组白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、α-1-蛋白酶抑制剂、前凝血蛋白(blood pro-coagulation protein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、载脂蛋白、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、纤连蛋白、β-2-糖蛋白I、纤维蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶激活剂、纤溶酶抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、内-α-胰岛素抑制剂(inter-alpha-trypsin inhibitor)、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血结素、补体C3、转铁蛋白、尿激酶、α-1-酸-糖蛋白以及凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质。
54.根据48-53项中的任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述一种或者多种人血液蛋白质作为非结合蛋白质被清洗出来。
55.根据54项所述的方法，其中，一种非结合的蛋白质是α-1-蛋白酶抑制剂。
56.根据48-55项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液已经被补充了醇。
57.根据48-56项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒。
58.根据48-57项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
59.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和预设的离子强度或电导率；b)在使蛋白质溶液与吸附剂接触之前，对蛋白质溶液进行至少一次消除病毒的处理；c)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；d)根据情况清洗吸附剂；以及e)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种蛋白质。
60.根据59项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
61.根据59-60项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
62.根据61项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
63.根据59-62项中的任一项所述的方法，其中，一种或者多种蛋白是一种或者多种人血液蛋白质如一种或者多种人血浆蛋白质或者一种或者多种人血清蛋白质。
64.根据59-63项中的任一项所述的方法，其中，所述一种或者多种人血液蛋白质是选自由以下组成的组白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、α-1-蛋白酶抑制剂、前凝血蛋白(blood pro-coagulation protein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、载脂蛋白、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、纤连蛋白、β-2-糖蛋白I、纤维蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶激活剂、纤溶酶抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、内-α-胰岛素抑制剂(inter-alpha-trypsin inhibitor)、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血结素、补体C3、转铁蛋白、尿激酶、α-1-酸-糖蛋白以及凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质。
65.根据59-64项中的任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述一种或者多种人血液蛋白质作为非结合蛋白质被清洗出来。
66.根据65项所述的方法，其中，一种非结合的蛋白质是α-1-蛋白酶抑制剂。
67.根据48-55项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液已经被补充了醇。
68.根据59-67项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
69.根据59-68项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
70.一种用于大规模地分离α-1-蛋白酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤a)提供一种包含α-1-蛋白酶抑制剂的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述α-1-蛋白酶抑制剂。
71.根据70项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
72.根据71项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
73.根据70-72项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
74.根据70-73项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
75.根据74项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
76.根据70-75项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
77.根据70-76项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒。
78.根据70-77项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
79.一种用于大规模地分离或者离析α-1-蛋白酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤a)提供一种包含α-1-蛋白酶抑制剂的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述α-1-蛋白酶抑制剂。
80.根据79项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
81.根据79-80项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
82.根据81项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
83.根据81或者82项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
84.根据80-83项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
85.根据79-84项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
86.根据85项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
87.根据79-86项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
88.根据70-86项中任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述α-1-蛋白酶抑制剂作为非结合蛋白质被清洗出来。
89.一种用于大规模地分离或者离析人白蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述人白蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述人白蛋白。
90.根据89项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
91.根据90项中任一项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
92.根据90或91项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
93.根据89-92项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
94.根据93项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
95.根据89-94项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
96.根据89-95项中的任一项所述的方法，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒。
97.根据89-95项中的任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
98.根据89-97项中任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述人白蛋白作为非结合蛋白质被清洗出来。
99.一种用于大规模地分离或者离析纤维蛋白原的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述纤维蛋白原的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述纤维蛋白原。
100.根据99项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
101.根据100项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
102.根据100或101项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
103.根据99-102项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
104.根据103项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
105.根据99-104项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
106.根据99-105项中的任一项所述的方法，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒。
107.根据99-106项中的任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
108.一种用于大规模地分离或者离析纤维蛋白原的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述纤维蛋白原的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；
b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述纤维蛋白原。
109.根据108项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
110.根据108-109项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
111.根据110项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
112.根据110或111项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
113.根据108-112项中的任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
114.根据108-113项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
115.根据108-114项中任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述人白蛋白作为非结合蛋白质被清洗出来。
116.一种用于大规模地分离或者离析转铁蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述转铁蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述转铁蛋白。
117.根据116项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
118.根据117项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
119.根据117或118项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
120.根据116-119项中的任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
121.根据120项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
122.根据116-121项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
123.根据116-122项中任一项所述的方法，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒。
124.根据116-123项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
125.一种用于大规模地分离或者离析转铁蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述转铁蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述转铁蛋白。
126.根据125项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
127.根据125-126项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
128.根据127项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
129.根据127或128项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
130.根据125-129项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
131.根据125-130项中的任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
132.根据131项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
133.根据125-132项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
134.根据125-133项中任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述人白蛋白作为非结合蛋白质被清洗出来。
135.一种用于大规模地分离或者离析α-1-酸-糖蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述α-1-酸-糖蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述α-1-酸-糖蛋白。
136.根据135项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
137.根据136项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
138.根据136或137项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
139.根据135-138项中的任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
140.根据139项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
141.根据135-140项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
142.根据135-141项中任一项所述的方法，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
143.根据135-142项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
144.一种用于大规模地分离或者离析α-1-酸-糖蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述α-1-酸-糖蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述α-1-酸-糖蛋白。
145.根据144项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
146.根据144-145项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
147.根据146项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
148.根据146或147项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
149.根据144-148项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
150.根据144-149项中的任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
151.根据150项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
152.根据144-151项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
153.根据144-152项中任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述α-1-酸-糖蛋白作为非结合蛋白质被清洗出来。
154.一种用于大规模地分离或者离析一种或者多种凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供一种包含所述一种或者多种凝血因子的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种凝血因子。
155.根据154项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
156.根据155项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
157.根据155-156项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
158.根据154-157项中的任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
159.根据158项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
160.根据154-159项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
161.根据154-160项中任一项所述的方法，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒。
162.根据154-161项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
163.一种用于大规模地分离或者离析一种或者多种凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供一种包含所述一种或者多种凝血因子的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述一种或者多种凝血因子。
164.根据163项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
165.根据163-164项中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
166.根据165项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
167.根据165或166项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
168.根据144-148项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
169.根据164-168项中的任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
170.根据169项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
171.根据164-170项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
172.根据154-171项中任一项所述的方法，其中，用一种或者多种清洗缓冲溶液，所述一种或者多种凝血因子作为非结合蛋白质被清洗出来。
173.一种用于同时大规模地分离至少3种如4种、如5种、如6种选自以下的蛋白质α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包括至少三种所述α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触；以及c)从所述吸附剂中获得至少3种如4种、如5种、如6种选自由以下组成的组的蛋白质α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原，它们相互之间分离在单个的蛋白质馏分。
174.根据173项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液进行至少一次病毒消除处理。
175.根据174项所述的方法，其中，所述至少一种病毒消除处理是在蛋白质溶液与吸附剂接触之前来进行。
176.根据174-175项中任一项所述的方法，其中，所述病毒消除处理涉及加入去污剂和/或有机溶剂如如吐温、曲通(Triton)、磷酸三正丁酯到蛋白质溶液中。
177.根据173-176项中的任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由以下组成的组的来源血液、血清、血浆以及其它血源而获得。
178.根据177项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
179.根据173-178项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是已经用醇补充。
180.根据173-179项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和/或一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物。
181.根据173-180项中任一项所述的方法，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒。
182.根据173-181项中任一项所述的方法，其中，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，最多为150μm的平均体积颗粒直径。
183.根据前述的任一项所述的方法，其中，高密度吸附剂是用一种或者多种平衡缓冲溶液来平衡。
184.根据前述的任一项所述的方法，其中，在吸附剂与蛋白质溶液接触之后，吸附剂用清洗缓冲溶液来清洗出非结合的材料。
185.根据前述的任一项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤使吸附剂经过洗提缓冲溶液，洗提出一种或者多种蛋白质溶液。
186.根据185项所述的方法，其中，所述方法进一步包括以下步骤重复以下步骤使吸附剂经过洗提缓冲溶液以洗提出一种或者多种蛋白质溶液。
187.根据前述的任一项所述的方法，其中，所获得的蛋白质经过进一步地下游处理，以进一步地分离。
188.根据前述的任一项所述的方法，其中，预设的pH值是在pH3.0-10.0的范围。
189.根据前述的任一项所述的方法，其中，在整个工艺过程期间的pH值维持在pH3.0-10.0的范围。
190.根据前述的任一项所述的方法，其中，预设的离子强度是在0.0001-12.0的范围。
191.根据前述的任一项所述的方法，其中，预设的电导率是在0.01-1000mS/cm的范围。
192.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂的密度是在1.5-20g/ml的范围。
193.根据前述的任一项所述的方法，其中，85％体积的单个吸附剂颗粒的直径在5-200μm的范围。
194.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂的平均体积颗粒直径为150μm或者更小。
195.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂的密度是在1.5-10.0的范围，85％体积的单个吸附剂颗粒的直径在10-150μm的范围，平均体积颗粒直径是在15-100μm的范围。
196.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂的颗粒可达到的蛋白质结合体积为至少20％。
197.根据前述的任一项所述的方法，其中，经过吸附柱的线液体流速为至少2cm/min。
198.根据前述的任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液的温度是在-5℃-50℃的范围。
199.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂在10％突破点具有对所述至少一种特定蛋白质的动力学结合容量为至少5g/l的沉降吸附剂。
200.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的官能团的职能化基体聚合物，所述基团具有以下通式M-SP1-X-A1K式中，M代表吸附剂聚合物；SP1代表可选择性地用-A-SP2-ACID、-A或者-ACID来取代的选择性间隔基；X代表-O-、-S-、-NH-或者NA1K-；A1K可以缺省的、-A-SP2-ACID、-A、-ACID或者C1-4烷基，其中C1-4烷基可以选择性地用-A-SP2-ACID、-A、-ACID来取代；A代表可选择性取代的芳香或者杂芳香环部分；SP2代表可选择的间隔基；以及ACID代表一种或者多种酸基团；其中至少一个SP1或者A1K是用-A-SP2-ACID或者-A来取代，至少一个SP1或者A1K包括-ACID，其中出现至少一个SP1或者A1K。如果A1K缺省，X也将缺省。
201.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂与包含一种芳香或者杂芳香酸的配体连接。
202.根据201项所述的方法，其中，配体为选自由以下组成的组的一种芳香或者杂芳香酸羧酸、磺酸、磷酸和硼酸。
203.根据200-202项所述的方法，其中，配体是通过硫醇-醚连接、胺连接或者羟基-醚连接与吸附剂结合。
204.根据200-203项所述的方法，其中，配体为选自由以下组成的组2-巯基苯甲酸、6-巯基烟酸、2-氨基苯酸、3-氨基苯酸、4-氨基苯酸、4-羟苯基-巯基-乙酸、4-羟苯基-巯基-丙酸、4-羟苯基-巯基-丁酸、2，3-二羟基苯甲酸、2，4-二羟基苯甲酸、2，5-二羟基苯甲酸、2，6-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸、3，5-二羟基苯甲酸、巯基苯并咪唑磺酸(mercaptobenzimidazole sulfonic acid)。
205.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂与包含一种杂芳香基团取代的双环的配体连接。
206.根据205项所述的方法，其中，配体是从选自由以下组成的组的化合物中衍生苯并咪唑、苯并噻唑和苯并唑。
207.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂是与在pH值为10时带有一个正电荷的配体连接。
208.根据前述的任一项所述的方法，其中，配体是从以下物质中衍生二乙基氨基乙基、聚亚烷基亚胺、烷基胺、烷基二胺或者聚丙烯胺。
209.根据208项所述的方法，其中，烷基胺或者烷基二胺具有链长为3-14个原子以及胺官能团为1-5个。
210.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂包含芳香胺或者芳香二胺的配体。
211.根据210项所述的方法，其中，芳香二胺是1，4-二甲苯-二胺或者1，4-二甲苯-二胺。
212.根据前述的任一项所述的方法，其中，至少2种如3种、如4种、如5种、如6种选自由以下组成的组的蛋白质白蛋白、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白E(IgE)、α-1-蛋白酶抑制剂、前凝血蛋白(blood pro-coagulation protein)、抗凝血蛋白、溶栓剂、抗血管生成蛋白、α-2-抗纤溶酶、C-1酯酶抑制剂、载脂蛋白、高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、纤连蛋白、β-2-酸-糖蛋白I、血纤蛋白原、纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶激活物、纤溶酶抑制剂、血浆蛋白酶抑制剂、抗凝血酶III、链激酶、内-α-胰岛素抑制剂(inter-alpha-trypsininhibitor)、α-2-巨球蛋白、淀粉样蛋白、铁蛋白、前白蛋白、GC-球蛋白、血结素、补体C3、转铁蛋白、尿激酶、α-1-酸-糖蛋白以及凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白是同时从至少2种如3种、如4种、如5种、如6种单个蛋白质馏分相互之间分离开。
213.根据前述的任一项所述的方法，其中，至少2种如3种、如4种、如5种、如6种选自由以下组成的组的蛋白质α-1-蛋白酶抑制剂、免疫球蛋白G(IgG)、人白蛋白、转铁蛋白、凝血酶、凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、凝血因子IX、C蛋白质、S蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤连蛋白是同时从至少2种如3种、如4种、如5种、如6种单个蛋白质馏分相互之间分离开。
214.根据前述的任一项所述的方法，其中，纤连蛋白是与吸附剂结合，同时一种或者多种凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质作为非结合材料从吸附剂中获得。
215.根据214项所述的方法，其中，至少40％的纤连蛋白结合到吸附剂上。
216.根据前述的任一项所述的方法，其中，白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)结合到吸附剂上，同时α-1-蛋白酶抑制剂作为非结合材料从吸附剂中获得。
217.根据前述的任一项所述的方法，其中，白蛋白和免疫球蛋白G(IgG)是通过逐步洗提从吸附剂中获得。
218.根据216或者217项中任一项所述的方法，其中，至少50％的白蛋白结合到吸附剂上，和/或至少50％的免疫球蛋白G(IgG)结合到吸附剂上。
219.根据前述的任一项所述的方法，其中，纤维蛋白原和IgG结合到吸附剂上，同时白蛋白作为非结合材料从吸附剂中获得。
220.根据219项所述的方法，其中，纤维蛋白原和IgG可以通过逐步洗提从吸附剂中获得。
221.根据219或者220项中任一项所述的方法，其中，至少50％的IgG结合到吸附剂上，和/或至少50％的纤连蛋白结合到吸附剂上。
222.根据前述的任一项所述的方法，其中，纤维蛋白原、白蛋白和IgG结合到吸附剂上，同时α-1-蛋白酶抑制剂作为非结合材料从吸附剂中获得。
223.根据222项所述的方法，其中，纤维蛋白原、白蛋白和IgG是通过逐步洗提从吸附剂中获得。
224.根据222或者223项中任一项所述的方法，其中，至少50％的IgG结合到吸附剂上，和/或至少50％的纤连蛋白结合到吸附剂上，和/或至少50％的白蛋白结合到吸附剂上。
225.根据前述的任一项所述的方法，其中，至少1种如至少2种、如3种纤连蛋白、白蛋白和IgG结合到吸附剂上，同时α-1-酸-糖蛋白作为非结合材料从吸附剂中获得。
226.根据225项所述的方法，其中，纤连蛋白、白蛋白和/或IgG是通过逐步洗提从吸附剂中获得。
227.根据225或者226项中任一项所述的方法，其中，至少50％的IgG结合到吸附剂上，和/或至少50％的纤连蛋白结合到吸附剂上，和/或至少50％的白蛋白结合到吸附剂上。
228.根据前述的任一项所述的方法，其中，至少1种如至少2种、如3种纤连蛋白、白蛋白和IgG结合到吸附剂上，同时α-1-酸-糖蛋白和/或α-1-蛋白酶抑制剂作为非结合材料从吸附剂中获得。
229.根据230项所述的方法，其中，纤连蛋白、白蛋白和/或IgG是通过逐步洗提从吸附剂中获得。
230.根据228或者229项中任一项所述的方法，其中，至少50％的IgG结合到吸附剂上，和/或至少50％的纤连蛋白结合到吸附剂上，和/或至少50％的白蛋白结合到吸附剂上。
231.根据前述的任一项所述的方法，其中，至少50％的α-1-蛋白酶抑制剂、白蛋白、IgG、纤连蛋白、或者一种或者多种凝血或抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质是从吸附剂中获得。
232.根据前述的任一项所述的方法，其中，所关心蛋白质的产量为至少60％。
233.根据前述的任一项所述的方法，其中，非所关心蛋白质的蛋白质产量为至多20％。
234.根据前述的任一项所述的方法，其中，选自以下组的蛋白质IgG、白蛋白、纤连蛋白、α-1-蛋白酶抑制剂、α-1-酸-糖蛋白和一种或者多种凝血或抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白质在至少2个蛋白质馏分如3个蛋白质馏分、如4个蛋白质馏分、如5个蛋白质馏分、如6个蛋白质馏分中分离。
235.根据234项所述的方法，其中，在蛋白质馏分中各个蛋白质的交叉污染为至多20％。
236.根据前述的任一项所述的方法，其中，吸附剂是一种吸附剂颗粒。
237.根据236项所述的方法，其中，吸附剂颗粒保存在膨胀床吸附柱、悬浮床吸附柱、连续搅拌槽接触器、管状流化床吸附柱、搅拌槽或者填充床吸附柱中。
238.根据237项所述的方法，其中，吸附剂颗粒保存在膨胀床吸附柱中，吸附剂颗粒的膨胀程度(由H/H0确定)是在1.0-20的范围。
239.根据前述的任一项所述的方法，其中，在用醇补充之后，蛋白质溶液可以包含上清液和沉淀馏分。
240.根据239项所述的方法，其中，上清液和沉淀馏分是通过过滤、微量过滤、离心、移注和/或者沉降来分离。
241.根据240项所述的方法，其中，一种或者多种蛋白质可以在上清液中得到。
242.根据240项所述的方法，其中，一种或者多种蛋白质可以在沉淀馏分中得到。
243.根据239-242项中任一项所述的方法，其中，上清液或者沉淀馏分的醇浓度以体积为至少0.1％。
244.根据239-242项中任一项所述的方法，其中，所述醇选自由以下组成的组甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、亚甲基二醇、乙二醇、丙二醇、二甘醇、亚甲基-乙二醇以及二亚甲基二醇。
245.根据239-244项中任一项所述的方法，其中，沉淀馏分是一种可再溶解的通过加入醇到血液、血浆、血清或者其它血源中所获得的沉淀物。
246.根据245项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
247.根据239-246项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是通过重组由加入醇到人血浆或血清中所获得的一种或者多种上清液和/或一种或者多种可再溶解的沉淀物来获得。
248.根据前述项中的任一项所述的方法，其中，所述蛋白质溶液是用Cohn分馏方法或者其变化的方法来获得。
249.根据245-254项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是选自由以下组成的组上清液I、上清液II、上清液III、再溶解馏分IV-1、再溶解馏分I、再溶解馏分II、再溶解馏分III以及其任何组合。
250.根据239-248项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是选自由以下组成的组上清液II+III、上清液I+II+III、再溶解馏分II+III以及再溶解馏分I+II+III。
251.根据前述项中的任一项所述的方法，其中，通过串联2种或者2种以上吸附剂的方式，2种或者多种蛋白质从蛋白质溶液中分离。
252.根据251项所述的方法，其中d)第一吸附剂能够捕获一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白；e)第二吸附剂能够捕获一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白，它不同于第一吸附剂所能够捕获的一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白；f)第三吸附剂能够捕获一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白，它不同于第一吸附剂或者第二吸附剂所能够捕获的一种或者多种血液蛋白、血清蛋白或者血浆蛋白；253.根据251或者252项中任一项所述的方法，其中，蛋白质溶液是血液、血清、血浆或者cryo-poor血浆。
254.根据253项所述的方法，其中，血液、血清、血浆或者其它血源是从人或者动物如牛、鱼、骆驼、猪、绵羊、山羊、兔、小鼠、大鼠、马、鸡、斑马或者鸵鸟来获得。
255.根据251-254项中的任一项所述的方法，其中，一种或者多种凝血或抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制剂、C蛋白质和/或S蛋白结合在第一吸附剂上。
256.根据255项所述的方法，其中，至少2种凝血因子粘附到第一吸附剂上。
257.根据251-256项中的任一项所述的方法，其中，至少一种蛋白质是选自由以下组成的组白蛋白、IgG、转铁蛋白、纤连蛋白结合到第二吸附剂上。
258.根据257项所述的方法，其中，至少2种蛋白质结合到第二吸附剂上。
259.根据25 1-258项中的任一项所述的方法，其中，至少一种α-1-蛋白酶抑制剂或者α-1-酸-糖蛋白结合到第三吸附剂上。
260.根据259项所述的方法，其中，2种蛋白质结合到吸附剂上。
实施例实施例1用膨胀床吸附从Cohn馏分(上层清液I、II、III)中离析人白蛋白和α-1-蛋白酶抑制剂。
吸附剂FaseLineUFC NNSDW，产品号CS48，UpFront Chromatography A/S。吸附剂是以琼脂糖为基础并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为2.9g/ml，颗粒直径在40-120μm的范围，其体积平均颗粒直径(D(4，3)为70μm(用Mastersizer 2000E粒度分析仪(Malvern Instruments，Worcestershire，英国)测试)。吸附剂包括作为配体的2-巯基烟酸，配体的浓度为40毫摩尔每毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液的预处理蛋白质溶液包括Cohen馏分、上层清液I、II、III，电导率为5.74mS，pH值为7.2，含有大约10％的乙醇。
用去离子水以1体积的上清液I、II、III对2体积的水的比例来稀释蛋白质溶液，用1M的盐酸调节pH值为5.0。电导率在稀释之后为3.8mS。工艺参数本实验是在FaseLine20膨胀床吸附柱(φ＝2cm，产品号7020-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作的。
吸附柱填充50cm的吸附剂(157ml)，并且在室温(20-25℃)下，用160ml的1M的NaOH溶液(第一平衡缓冲溶液)、400ml的40mM的pH值为4.5的柠檬酸钠缓冲溶液(第二平衡缓冲溶液)以及400ml的40mM的pH值为5.0的柠檬酸钠缓冲溶液(第三平衡缓冲溶液)来平衡。
两个实验是以450cm/hr的线流速操作(i)实验A)236ml的稀释蛋白质溶液装载在吸附柱中(ii)实验B)353ml的稀释三倍的蛋白质溶液转载在吸附柱中-馏分1将非结合的材料用10mM的pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液清洗出吸附柱。在清洗馏分中收集α-1-蛋白酶抑制剂。随后，在两步中充分地洗提出结合的蛋白质。
-馏分2，第一洗提步骤用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠(sodiumcaprylate)洗提出人白蛋白。
-馏分3，第二洗提步骤用0.3M的pH值为7.4的柠檬酸钠洗提出其它的蛋白质包括IgG和转铁蛋白。
实验结果以下表所示的是装载在每个吸附柱中的蛋白质溶液和缓冲溶液的体积

馏分1、馏分2和馏分3中的α-1-蛋白酶抑制剂和人白蛋白的定量。
进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，其目的是定量以α-1-蛋白酶抑制剂和人白蛋白的百分比表示的、从吸附柱中馏出的馏分中的相对产量，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用0.6μl/cm2的兔抗-人-α-1-蛋白酶抑制剂(Dako Cytomation，丹麦，产品号A0012)和0.3μl/cm2的兔-抗-人-白蛋白(Dako Cytomation，丹麦，货号A001)来进行操作。
标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液装载在吸附柱中来制作完成。三个馏分的每一个都相对于标准曲线来读出。
实验结果如下表所示的是以装载在吸附柱中的原材料的百分比表示的相对产量人α-1-蛋白酶抑制剂的确定

人白蛋白的确定

实验中的每个馏分用SDS-PAGE来测试，以评估蛋白质的含量和类型。SDS-PAGE对于SDS-PAGE，使用Invitrogen SDS-page的4-20％Tris-甘氨酸凝胶(产品号EC6025)。
样品制备25μl的样品与25μl的样品缓冲溶液tris-甘氨酸Initrogen(产品号LC2676)混合，并且在水浴中煮沸5分钟。加入电泳缓冲液0.024Mtris(sigma T1378)、0.19M甘氨酸(Merck 5001901000)、0.1％pH值为8.6的SDS(十二烷基硫酸钠，JT Baker 2811)。
在每个分析狭槽中，使用20μl的样品，并且调整电源至40mA的电流。当样品缓冲液中的蓝线(blue line)达到离凝胶底部1厘米处时，关掉电源，并且在震动的台面上，将凝胶在Invitrogen胶体蓝色染色试剂盒(InvitrogenColloidal Blue Staining Kit，产品号LC6025)中染色过夜。第二天，将凝胶转移到水中，并且在水中脱色2小时。
实验结果通过十二烷基钠-凝胶电泳(SDS-PAGE)，没有检测到人α-1-蛋白酶抑制剂(α-1-PI)或者人白蛋白分子的击穿或者失活。发现洗提的人白蛋白的纯度高于95％，如用SDS-PAGE所确定的。
在馏分1中，回收α-1-蛋白酶抑制剂在馏分2中，回收结合的人白蛋白在馏分3中，回收结合的免疫球蛋白G和转铁蛋白实施例2通过膨胀床吸附，在不同的pH条件下，从Cohn馏分(上层清液I、II、III)中离析人白蛋白和α-1-蛋白酶抑制剂。
吸附剂FaseLineUFC NNSDW，产品号CS48，UpFront Chromatography A/S(参见实施例1)。
蛋白质溶液的预处理蛋白质溶液包括Cohen馏分、上层清液I、II、III，电导率为5.74mS，pH值为7.2，含有大约10％的乙醇。
用去离子水或者20mM的pH值为5的乙酸钠以1体积的Cohn上清液I、II、III对5体积的水或者20mM的pH值为5的乙酸钠的比例来稀释蛋白质溶液，用1M的盐酸来调节pH值为5.0。
工艺参数本实验是在FaseLine20膨胀床吸附柱(φ＝2cm，产品号7020-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
三个实验是以450cm/hr的线流速操作。吸附柱填充50cm的吸附剂(157ml)，并且在室温(20-25℃)下，用160ml的1M的NaOH溶液(第一平衡缓冲溶液)和400ml的40mM的pH值为4.5的柠檬酸钠缓冲溶液(第二平衡缓冲溶液)来平衡，接着用第三缓冲液(第三平衡缓冲溶液)来平衡，第三缓冲液包括实验A400ml的40mM的pH值为5.0的柠檬酸钠实验B400ml的40mM的pH值为5.3的柠檬酸钠实验C400ml的40mM的pH值为5.5的柠檬酸钠240ml的稀释蛋白质溶液被1M的HCl来调整为实验ApH值为5.0，电导率＝2.16mS实验BpH值为5.3，电导率＝2.27Ms实验CpH值为5.5，电导率＝2.29mS调整pH值之后，蛋白质溶液装载到吸附柱中。
馏分1非结合的材料用10mM的pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液清洗出来。在从吸附柱的清洗馏分中收集α-1-蛋白酶抑制剂。
在两步中洗提出结合的蛋白质。
-馏分2，第一洗提步骤用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠洗提出人白蛋白。
-馏分3，第二洗提步骤用0.3M的pH值为7.4的柠檬酸钠洗提出其它的蛋白质包括IgG和转铁蛋白。
实验结果以下表所示的是装载在每个吸附柱中的蛋白质溶液和缓冲溶液的体积

定量在馏分1、馏分2和馏分3中的α-1-蛋白酶抑制剂和人白蛋白的量。
进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，其目的是定量以α-1-蛋白酶抑制剂和人白蛋白的百分比表示的、在从吸附柱中馏出的馏分中的相对产量(参见实验结果如下表所示的是以装载在吸附柱中的原材料的百分比表示的相对产量
人α-1-蛋白酶抑制剂的确定

人白蛋白的确定

实验中的每个馏分用SDS-PAGE来测试，以估计蛋白质的含量和类型。SDS-PAGE(参见实施例1)实验结果通过十二烷基钠-凝胶电泳(SDS-PAGE)，没有检测到人α-1-蛋白酶抑制剂(α-1-PI)或者人白蛋白分子的击穿或者失活。如用SDS-PAGE所确定的，发现洗提的人白蛋白的纯度高于95％。
实施例3从实施例1中所获得的未结合的馏分中分离α-1-蛋白酶抑制剂。
吸附剂FaseLineDEAE离子交换剂，产品号CS62，UpFront ChromatographyA/S。吸附剂是以琼脂糖为基础并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为2.9g/ml，颗粒直径在40-120μm的范围，其体积平均颗粒直径为70μm。吸附剂包括作为配体的二乙氨基乙基(DEAE)基团，配体的浓度为150毫摩尔每毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液来源于白蛋白和α-1-蛋白酶抑制剂离析中的蛋白质馏分1(非结合材料)，如在实施例的实验A中所述的。用1M的NaOH来调节蛋白质馏分的pH值为8.2。此后电导率为6.16mS。
工艺参数本实验是在Poly-Prep吸附柱(产品号731-1550，BioRad)上操作。
吸附柱填充1ml离子交换剂，并且在室温(20-25℃)下，用5ml的pH值为8.2的1M的磷酸钾来平衡。在孵育之后，用10ml的pH值为8.2的10mM的磷酸钾来清洗离子交换剂。
调整30ml的蛋白质馏分的pH值为8.2，并且将其装载在吸附柱中，冲洗馏分收集到5ml的馏分。在装载蛋白质馏分之后，吸附柱用10ml的pH值为8.2的10mM的磷酸钾来清洗。
用10mM的磷酸钾+1M的NaCl，洗提结合的α-1-蛋白酶抑制剂至pH值为8.2。
实验结果以下表所示的是装载在吸附柱中的原料和缓冲溶液的体积

定量α-1-蛋白酶抑制剂的量。
进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，其目的是定量以α-1-蛋白酶抑制剂和人白蛋白的百分比表示的、在从吸附柱中馏出的馏分中的相对产量，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
RDI是用0.6μl/cm2的兔抗-人-α-1-蛋白酶抑制剂(Dako Cytomation，丹麦，产品号A0012)来进行操作。
标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液装载在吸附柱中来制作完成。每个馏分都相对于标准曲线来读出。
实验结果如下表所示的是以装载在吸附柱中的原材料的百分比表示的相对产量
人α-1-蛋白酶抑制剂的确定

因此，在未结合的蛋白质馏分中，没有发现α-1-蛋白酶抑制剂，而在洗提液中，发现80％的装载在吸附柱中的α-1-蛋白酶抑制剂。
实施例4α-1-蛋白酶抑制剂的膨胀床吸附。
重复实施例3，但是，本次使用澄清床的高度为5cm、线流速为5cm/min以及用相同的离子交换吸附剂的膨胀床吸附柱。
再一次，在未结合的馏分中，没有发现α-1-蛋白酶抑制剂，而在洗提液中，发现80％的装载在吸附柱中的α-1-蛋白酶抑制剂。
实施例5通过使用流速为450cm/hr的膨胀床吸附，从人血浆中分离出人血浆蛋白质。
吸附剂FaseLineUFC NNSDW，产品号CS48，UpFront Chromatography A/S。吸附剂是以琼脂糖为基础并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为2.9g/ml，颗粒直径在40-120μm的范围，其体积平均颗粒直径为70μm。吸附剂包括作为配体的2-巯基烟酸，配体的浓度为40毫摩尔每毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液预处理用去离子水以1体积的人血浆对2体积的水的比例来稀释蛋白质溶液，用1M的盐酸来调节pH值为5.0。电导率在稀释之后为5.25Ms/cm2。
工艺参数本实验是在FaseLine20膨胀床吸附柱(φ＝2cm，产品号7020-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
吸附柱装载吸附剂至澄清床的高度(H0)为5cm(相应于157ml的吸附剂)，并且在室温(20-25℃)下，用以下缓冲溶液以连续顺序来清洗和平衡1)160ml的1M的NaOH溶液，2)400ml的40mM的pH值为4.5的柠檬酸缓冲溶液以及3)400ml的40mM的pH值为5.0的柠檬酸缓冲溶液。
该实验在所有步骤中都以450cm/hr的线流速操作，吸附柱上的出口连接到UV监测器和记录器上。
样品120ml的蛋白质溶液(相应于40ml的未稀释的血浆)装载在吸附柱中。馏分收集在装载蛋白质溶液之后，用10mM的pH值为5.0的柠檬酸钠，非结合和弱结合的材料从吸附柱中清洗出来。
根据UV监视吸附柱流出物，收集馏分1(未结合馏分)作为一种馏分。
随后，结合的蛋白质在连续的三步骤中洗提。
-馏分2-第一洗提步骤是用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠来进行-馏分3-第二洗提步骤是用0.3M的pH值为7.4的辛酸钠来进行-馏分4-第三洗提步骤是用20mM的pH值为7.4的辛酸钠+0.1M的NaCl来进行在第一和第二洗提步骤之间，吸附柱用一吸附柱体积的pH值为5.0的1M的柠檬酸钠来简要地清洗。
实验结果以下表所示的是每个馏分的体积

定量在从吸附柱中的馏分1、2、3和4中的人血浆蛋白的量。
进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，其目的是表明在从吸附柱中馏出的每个馏分中的组分，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用如下的抗体(所有抗体来自于Dako Cytomation，丹麦)来进行操作

标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(100％作为参考)装载在吸附柱中来制作完成。四个馏分每个都相对于标准曲线来确定。
实验结果如下表所示的是在从吸附柱中馏出的4个馏分中每个人蛋白质的相对产量

“—”＝相对产量低于5％实施例6用流速为450cm/hr的膨胀床吸附，从乙醇处理的人血浆中分离出人血浆蛋白质。
吸附剂FaseLineUFC NNSDW，产品号CS48，UpFront Chromatography A/S。吸附剂是以琼脂糖为基础并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为2.9g/ml，颗粒直径在40-120μm的范围，其体积平均颗粒直径为70μm。吸附剂包括作为配体的2-巯基烟酸，配体的浓度为40毫摩尔每毫升沉降吸附剂。蛋白质溶液的预处理在-3℃温度下，用99％的乙醇调整人血浆至含有8％体积的乙醇，并在-3℃温度下孵育1.5小时。在孵育之后，血浆离心10分钟。用去离子水以1份血浆对2份水的比例来稀释上清液，用1M的盐酸来调节pH值为5.0。电导率在稀释之后为4.16mS/cm2。
工艺参数、样品体积和馏分所有工艺参数和条件与在实施例5中所使用的工艺参数和条件相同。
实验结果以下表所示的是每个馏分的体积

定量在从吸附柱中的馏分1、2、3和4中的人血浆蛋白的量。
用SRI的分析如在实施例5所示来操作。
实验结果如下表所示的是在从吸附柱中馏出的4个馏分中每个人蛋白质相对于应用在吸附柱中的蛋白质总量的产量

“—”＝相对产量低于5％实施例7从实施例5中的非结合馏分中分离人α-1-蛋白酶抑制剂(API)。
吸附剂FaseLineDEAE离子交换剂，产品号CS62，UpFront ChromatographyA/S。离子交换剂是以琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为2.9g/ml，颗粒直径在40-120μm的范围，其体积平均颗粒尺寸(直径)为70μm。吸附剂包括DEAE(二乙氨基乙基)基团，配体的浓度为150毫摩尔每毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液本实验的原料是从使用膨胀床吸附分离人血浆蛋白中所获得的蛋白质馏分1(非结合材料)，如在实施例5中所述。用1M的NaOH小心调节pH值至8.2，电导率在稀释之后为5.25Ms/cm2。
工艺参数本实验是在本实验是在Poly-Prep吸附柱(产品号731-1550，BioRad，美国)上操作。
所有步骤都以1ml/minute的流速来操作。
吸附柱填充1ml离子交换剂，并且在20-25℃下，用5ml的1M的K2HPO4(用1M的NaOH调节其pH值为8.2)来平衡。在孵育之后，用10ml的pH值为8.2的10mM的磷酸钾来清洗离子交换剂。
50ml的pH值调整为8.2的原料装载到吸附柱中，冲洗馏分(非结合材料)的实验收集到10ml的馏分。在装载原料之后，吸附柱用10ml的10MmK2HPO4(用1M的NaOH调节其pH值为8.2)来清洗。
在装载合清洗之后，结合的α-1-蛋白酶抑制剂(α-1-PI)释放出来，并用pH值为8.2的10mM的磷酸钾+1M的NaCl，洗提结合的α-1-蛋白酶抑制剂。
实验结果以下表所示的是装载在吸附柱中的原料和缓冲溶液的体积

定量人α-1-蛋白酶抑制剂的量。
进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，其目的是定量α-1-蛋白酶抑制剂在从吸附柱中馏出的馏分中的相对浓度，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用0.6μl/cm2的兔抗人API(Dako Cytomation，丹麦，产品号A0012)来进行操作。
标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液装载在吸附柱中来制作完成。在每个馏分中的α-1-PI的浓度都相对于标准曲线来确定，在该馏分中的相对产量可以从馏分的体积相对于在所应用的蛋白质馏分中的α-1-PI的体积和浓度来计算。
实验结果如下表所示的是以装载在吸附柱中的α-1-PI百分比表示的相对产量人α-1-PI(α-1-蛋白酶抑制剂)的确定

洗提液的纯度，以及证明弹性蛋白酶的结合活性。
SDS-PAGE对于SDS-PAGE，使用Invitrogen SDS-page的4-20％Tris-甘氨酸凝胶(产品号EC6025)。
证明在蛋白质馏分中的α-1-PI(馏分1，实施例5)的弹性蛋白酶结合活性通过在用弹性蛋白酶(Sigama code no E0127)孵育之前和之后用SDS-PAGE来分析蛋白质馏分用0.2M的NaOH调节蛋白质馏分至pH值为7，加入6.5μl的2.5mg/ml的弹性蛋白酶到500μl的蛋白质馏分中，并在30℃下孵育30分钟。
样品制备25μl的样品与25μl的样品缓冲液tris-甘氨酸Initrogen(产品号LC2676)混合，并且在水浴中煮沸5分钟。加入电泳缓冲液0.024M的tris(sigma T1378)、0.19M的甘氨酸(Merck 5001901000)、0.1％的pH值为8.6的SDS(十二烷基硫酸钠，JTBaker 2811)。
在每个分析狭槽中，使用20μl的样品，并且调整电源至40mA的电流。当样品缓冲液中的蓝线(blue line)达到离凝胶底部1厘米处时，关掉电源，并且在震动的台面上，凝胶在Invitrogen胶体蓝色染色试剂盒(InvitrogenColloidal Blue Staining Kit，产品号LC6025)中染色过夜。第二天，凝胶转移到水中，并且在水中脱色2小时。
实验结果实验结果显示出从DEAE离子交换剂中的α-1-PI洗提液具有高的纯度，如用SDS-PAGE(评价＞80％)来评价，参见图3。
而且，结果还显示出在蛋白质馏分中(从实施例5中的非结合馏分)的所有α-1-蛋白酶抑制剂为活性的，并且能够结合弹性蛋白酶，参见图4。
实施例8从实施例5中的非结合的馏分中，分馏人API和人血清类粘蛋白(α-1-酸-糖蛋白)。
吸附剂颗粒尺寸(直径)在80-150μm的范围。以6％的琼脂糖珠为基的吸附剂在与以下配体耦合以前用表氯醇来交联和激活实验编号配体1 2-羟基-吡啶(45μl/ml吸附剂)2 4-苯甲基-羟苯酚(40μl/ml吸附剂)3 2-氨基-吡啶(40μl/ml吸附剂)4 1，8-二氨基-辛烷(50μl/ml吸附剂)5 苄胺(35μl/ml吸附剂)6 2，5-二巯基-1，3，4-噻重氮(65μl/ml吸附剂)7 N-辛胺(70μl/ml吸附剂)蛋白质溶液从用膨胀床吸附分离人血浆蛋白质中的、实施例5中的蛋白质馏分1(非结合材料)，蛋白质馏分中加入硫酸铵，至最后的浓度为2M的硫酸铵，接着用1M的NaOH仔细调节至pH值为8.2。
工艺参数本实验是以填充床吸附在本实验是在Poly-Prep吸附柱(产品号731-1550，BioRad，美国)上操作。在所有步骤中的流速为1ml/min。
每个吸附柱填充1ml的吸附剂，随后用5ml的去离子水和4ml的2M的pH值为8.2的硫酸铵在吸附柱中清洗吸附剂。
15ml的蛋白质馏分装载在每个吸附柱中，冲洗馏分(非结合材料)的运行产物收集在两个馏分中。在装载蛋白质馏分之后，吸附柱随后用1)5ml的pH值为8.2的2M的硫酸铵、2)5ml的1M的pH值为8.2的硫酸铵来清洗。在清洗之后，吸附剂用10ml的pH值为8.2的10mM的磷酸钾缓冲液+0.1M的NaCl(除了实施例5，其中的缓冲溶液pH值为5.0)。清洗和洗提馏分收集作为用于分析的单个馏分。
实验结果以下表所示的是装载在吸附柱中的蛋白质馏分的体积以及在实施例1-7中所收集的馏分的体积

定量从实施例1-7中的人α-1-PI和人血清类粘蛋白(α-1-酸-糖蛋白)。
进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，其目的是定量在所获得的馏分中打特定蛋白质的百分比相对浓度，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用如下的抗体来操作-兔抗人α-1-PI，Dako Cytomation，丹麦，产品号A0012(0.6μl/cm2)-兔抗人血清类粘蛋白，Dako Cytomation，丹麦，产品号A0011(0.8μl/cm2)标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(未稀释＝100％参考)装载在吸附柱中来制作完成。在所收集的馏分中的特定蛋白质的相对浓度都相对于标准曲线来确定。在每个馏分中的特定蛋白质的相对产量可以从馏分的体积相对于所应用在吸附柱中的蛋白质总量来计算。
确定洗提的α-1-PI(α-1-蛋白酶抑制剂)的纯度。
SDS-PAGE对于SDS-PAGE，使用Invitrogen SDS-page的4-20％Tris-甘氨酸凝胶(产品号EC6025)。
样品制备25μl的样品与25μl的样品缓冲液tris-甘氨酸Initrogen(产品号LC2676)混合，并且在水浴中煮沸5分钟。加入电泳缓冲液0.024M的tris(sigma T1378)、0.19M的甘氨酸(Merck 5001901000)、0.1％的pH值为8.6的SDS(十二烷基硫酸钠，JT Baker 2811)。
在每个分析狭槽中，使用20μl的样品，并且调整电源至40mA的电流。当样品缓冲液中的蓝线(blue line)达到离凝胶底部1厘米处时，关掉电源。并且在震动的台面上，凝胶在Invitrogen胶体蓝色染色试剂盒(InvitrogenColloidal Blue Staining Kit，产品号LC6025)中染色过夜。第二天，凝胶转移到水中，并且在水中脱色2小时。
实验结果以下表所示的是以吸附柱中所应用的总量百分比表示的、在每个馏分中蛋白质的相对产量。
确定人α-1-PI和人血清类粘蛋白(α-1-酸-糖蛋白)相对于所应用的蛋白质总量的产量。

“—”＝相对产量低于5％进一步的下游处理工艺通过超滤，接着两个病毒失活步骤1)溶剂去污剂处理以及2)病毒过滤(纳米过滤)，浓缩从实施例5(苄胺作为配体)中的洗提物，以提供适合于治疗应用的产品。
实施例9分离人API和人血清类粘蛋白(α-1-酸-糖蛋白)。
吸附剂颗粒尺寸(直径)在80-150μm的范围。吸附剂是以6％的琼脂糖珠为基，该琼脂糖珠在与以下配体耦合以前用表氯醇来交联和激活实验编号 配体1 2-羟基-吡啶(45μl/ml吸附剂)2 4-苯甲基-羟苯酚(40μl/ml吸附剂)3 2，5-二巯基-1，3，4-噻重氮(65μl/ml吸附剂)蛋白质溶液从用膨胀床吸附分离人血浆蛋白质中的、实施例5中的蛋白质馏分1(非结合材料)，蛋白质馏分中加入硫酸铵，至最后的浓度为2M的硫酸铵，接着用1M的NaOH仔细调节至pH值为8.2。
工艺参数本实验是以填充床吸附在本实验是在Poly-Prep吸附柱(产品号731-1550，BioRad，美国)上操作。在所有步骤中的流速为1ml/min。
每个吸附柱填充1ml的吸附剂，随后用1)5ml的离子交换水和2)4ml的2M的pH值为8.2的硫酸铵在吸附柱中清洗吸附剂。
75ml的蛋白质馏分装载在每个吸附柱中，冲洗馏分(非结合材料)收集在每个15ml的5个馏分中。
实验1和实验2在装载蛋白质馏分之后，吸附柱用5ml的pH值为8.2的2M的硫酸铵清洗，并且用10ml的10mM的pH值为8.2的磷酸钾和0.1M的NaCl来洗提。
实验3在装载蛋白质馏分之后，随后用1)5ml的2M的pH值为8.2的硫酸铵2)5ml的1M的pH值为8.2的硫酸铵清洗吸附柱。在清洗之后，用10ml的10mM的pH值为8.2的磷酸钾和0.1M的NaCl来洗提吸附剂。
实验结果以下表所示的是在实验1-3中装载在吸附柱中的蛋白质馏分和缓冲溶液的体积

定量从实验1-7中的人α-1-PI和人血清类粘蛋白(α-1-酸-糖蛋白)。
进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，其目的是定量在所获得的馏分中打特定蛋白质的百分比相对浓度，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用如下的单一性抗体来操作-兔抗人α-1-PI，Dako Cytomation，丹麦，产品号A0012(0.6μl/cm2)-兔抗人血清类粘蛋白，Dako Cytomation，丹麦，产品号A0011(0.8μl/cm2)标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(未稀释＝100％参考)装载在吸附柱中来制作完成。在所收集的馏分中的特定蛋白质的相对浓度都相对于标准曲线来确定。在每个馏分中的特定蛋白质的相对产量可以从馏分的体积相对于所应用在吸附柱中的蛋白质总量来计算。
实验结果如下表所示的是以在吸附柱中所应用的总量百分比表示的在每个馏分中α-1-PI和血清类粘蛋白(α-1-酸-糖蛋白)的相对产量



“N.P.”＝未进行实施例10用膨胀床吸附，从原生人血浆中分离凝血和抗凝血因子。
吸附剂吸附剂是以琼脂糖为基础并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为2.9g/ml，颗粒直径在40-120μm的范围，其体积平均颗粒直径为70μm。吸附剂是用表氯醇来激活和交联，并且与配体对-苯二甲胺(配体的最终浓度为25Mm/ml的沉降吸附剂)耦合。
蛋白质溶液的预处理原生人血浆(标准的柠檬酸血浆)是用1M的乙酸来调节。电导率为11.5Ms/cm2。
工艺参数本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
吸附柱装载吸附剂至达到澄清床的高度(H0)为25cm(相应于大约20ml的固定吸附剂)，并用20mM的pH值为6.7的柠檬酸钠缓冲溶液，在20-25℃下来清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以300cm/hr的线流速来操作。从吸附柱中的流出物连接到UV监视器和记录器。
100ml的蛋白质溶液(相应于5倍澄清床的体积)装载到吸附柱中。
在装载蛋白质溶液之后，非结合材料用5mM的pH值6.7的柠檬酸钠清洗出吸附柱(标记为清洗液1)。在清洗液1之后，弱结合的蛋白质用5mM的柠檬酸钠+0.2M的pH值6.7的氯化钠来清洗出吸附柱(标记为清洗液2)。随后，强结合的蛋白质用5mM的柠檬酸钠+0.8M的pH值6.7的氯化钠来洗提出吸附柱。
从头到尾的清洗液1馏分从吸附柱中收集作为一个馏分，而清洗液2和洗提物收集在单独的馏分中。
原生的血浆、组合的从头到尾的清洗馏分和洗提物然后用DiaMed CD-X分析器(Cresser，瑞士)测试其某些范围的特定凝血和抗凝血因子的活性。冯维勒布兰德因子(vWF)生物活性是通过瑞斯托菌素辅助因子分析(vWFRco)来评估。冯维勒布兰德因子抗原(vWFAg)是使用浊度分析来定量。S蛋白质、C蛋白质和C1抑制蛋白是用机能分析来进行测试。
其它的蛋白质如白蛋白、IgG、α-1-抗胰蛋白酶、纤维蛋白原、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白是用单向放射免疫扩散(SRI)来确定。
设置任何应用到吸附柱上的、在蛋白质溶液中的特定蛋白质的活性或者量为100％，则可以确定在每个馏分中的相对产量。总的回收率定义为在整个、清洗和洗提馏分中所发现的总产量。
洗提液通过在Superdex G200(Smersham Bioscience)上的尺寸排阻色谱法进一步地分析。分析中的馏分用来分析凝血因子VIII的活性。
实验结果所选择的蛋白质相对于原料的回收总量和产量

在Superdex G200上的尺寸排阻色谱法分析显示出，在洗提物中的凝血因子VIII是与冯维勒布兰德因子复合(凝血因子VIII的活性出现在零体积的尺寸排除吸附柱附近，而在相应于非复合的凝血因子VIII的位置没有发现活性)。
以增加的流速500cm/hr重复该实验，以给出基本上相同的结果。
实施例11用膨胀床吸附，从血浆中分离凝血因子VIII与冯维勒布兰德因子复合物。吸附剂结合容量作为吸附剂颗粒的函数。
吸附剂在本实验中使用的四个吸附剂都是以琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为2.9g/ml，而体积平均颗粒直径在40-200μm之间变化。吸附剂用表氯醇来激活和交联，并且与配体对-苯二甲胺(配体的最终浓度为25mM/ml的沉降吸附剂)耦合。四个不同的吸附剂配制品经测试其具有以下体积平均颗粒直径-体积平均颗粒直径40μm-体积平均颗粒直径70μm-体积平均颗粒直径150μm-体积平均颗粒直径200μm蛋白质溶液的预处理原生人血浆(标准的柠檬酸血浆)用1M的乙酸调节pH值至6.7。此后其电导率为11.5mS/cm2。
工艺参数本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
吸附柱装载吸附剂至达到澄清床的高度(H0)为25cm(相应于大约20ml的固定吸附剂)，并用20mM的pH值为6.7的柠檬酸钠缓冲溶液，在20-25℃下来清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以350cm/hr的线流速来操作。从吸附柱中的流出物连接到UV监视器和记录器。200ml的蛋白质溶液(相应于10倍澄清床的体积)装载到吸附柱中。
在装载蛋白质溶液之后，非结合材料用5mM的pH值为6.7的柠檬酸钠清洗出吸附柱(标记为清洗液1)。在清洗液1之后，弱结合的蛋白质用5mM的柠檬酸钠+0.2M的pH值6.7的氯化钠来清洗出吸附柱(标记为清洗液2)。随后，强结合的蛋白质用5mM的柠檬酸钠+0.8M的pH值6.7的氯化钠来洗提。
整个和清洗液1馏分是从吸附柱中收集作为一个馏分，而清洗液2和洗提物收集在单独的馏分中。
原生的血浆、组合的整个的清洗馏分和洗提物然后用DiaMed CD-X分析器(Cresser，瑞士)测试凝血因子VIII的活性。
设置应用到吸附柱上的、在蛋白质溶液中的凝血因子VIII的活性为100％，则可以确定在每个馏分中的相对产量。总的回收率定义为在整个、清洗和洗提馏分中所发现的总产量。
实验结果相对于原料的凝血因子VIII的回收总量和产量

吸附剂的结合凝血因子VIII的容量随着体积平均颗粒直径的减小而显著的增加。该实验说明了具有低于150μm的体积平均颗粒直径的吸附剂的优异性能。
实施例12用吸附剂以及包含酸基团的不同芳香或者杂芳香配体，从人血浆中分离人血浆蛋白。
吸附剂吸附剂都是以琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为2.9g/ml，颗粒直径是在40-200μm之间，体积平均颗粒直径为70μm。吸附剂用表氯醇来激活和交联，并且与以下不同的配体结合2-巯基烟酸、2-巯基苯甲酸、3，4-二氨基-苯甲酸、2，4-二羟基-苯甲酸、3，5-二羟基-苯甲酸、2-(4-氨基苯硫代)乙酸、2-巯基苯并咪唑磺酸、N-苯甲酰基-半胱氨酸。
在所有单个吸附剂上的配体浓度是通过酸基滴定确定为25-40微摩尔/毫升沉降吸附剂。
以下的实验是为每个吸附剂来操作蛋白质溶液的预处理蛋白质溶液(人血浆)用去离子水以1体积的血浆对2体积的水来稀释，并且用1M的盐酸调节pH值至5.0。此后其电导率为5.25mS/cm2。
工艺参数本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
吸附柱装载吸附剂至达到澄清床的高度(H0)为50cm(相应于大约40ml的固定吸附剂)，并用连续地加入以下的缓冲溶液1)1M的NaOH、2)40mM的pH值为4.5的柠檬酸缓冲溶液、3)40Mm的pH值为4.5的柠檬酸缓冲溶液在20-25℃下清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以600cm/hr的线流速来操作，从吸附柱中的流出物连接到UV监视器和记录器。
样品30ml的样品(相应于10ml的未稀释血浆)装载到吸附柱中。
馏分的收集在装载蛋白质溶液之后，非结合的和弱结合的材料用10mM的pH值为5.0的柠檬酸钠清洗出吸附柱。根据吸附柱的流出物的UV监视，整个的和洗提馏分、RT(未结合的馏分)收集为一个馏分。
随后，结合的蛋白质在依次的三步中洗提出来-洗提物1-第一洗提步骤是用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠来进行-洗提物2-第二洗提步骤是用0.3M的pH值为7.4的辛酸钠来进行-洗提物3-第三洗提步骤是用pH值为7.4的20mM的柠檬酸钠+0.1M的NaCl来进行在第一和第二洗提步骤之间，吸附柱用1吸附柱体积的pH值为7.4的1M的柠檬酸钠来清洗。
定量在整个的/清洗馏分和洗提物1、2和3中的人血浆蛋白为了展示在从吸附柱中馏出的每个馏分中的组分，进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用如下的抗体来进行操作，所有抗体来自于Dako Cytomation，丹麦

标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(100％作为参考)装载在吸附柱中来制作完成。四个馏分每个都相对于标准曲线来确定，在每个馏分中特定蛋白质的相对产量可以确定。如果特定蛋白质在特定馏分中的产量相对于加入到吸附柱中的蛋白质的量高于5％，则蛋白质定义为分布进入所述馏分中。
实验结果所选择蛋白质的分布与配体结构间的函数关系

RT＝整个的和第一清洗物；E1＝第一洗提物；E2＝第二洗提物；E3＝第三洗提物阈值至少5％的应用在吸附柱上的特定蛋白质必须出现在馏分中。
该表说明对于配体2-巯基烟酸，仅存在α-1-蛋白酶抑制剂和α-1-酸-糖蛋白，它们在组合的整个和清洗馏分中的量超过总量的5％，而白蛋白仅存在于第一洗提物E1，即没有大量的白蛋白存在于任何其它的馏分，IgG和转铁蛋白仅仅存在于第二洗提物，血纤蛋白原仅存在于第三洗提物。因此，一般可以得知在实验中所获得的单个蛋白质馏分之间存在很少的交叉污染。该实验进一步地说明根据本发明，广泛范围的、包含酸基团的芳香族或在芳香族配体可以用来分馏人血浆或者血清蛋白。
实施例13用含有二氨基壬烷配体的吸附剂，从实施例5中的非结合馏分(在低离子强度)中分离人α-1-蛋白酶抑制剂。
吸附剂吸附剂都是以4％的琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒珠的密度为大约3.8g/ml，颗粒尺寸是在40-100μm之间，体积平均颗粒直径为60μm。吸附剂用表氯醇来激活和交联，并且与二氨基壬烷结合。配体的浓度为25微摩尔/毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液本实验的原料为从使用膨胀床吸附来分离人血浆蛋白(如在实施例5中所描述的)所获得的蛋白质馏分1(非结合材料)。在蛋白质馏分中的pH值用1M的氢氧化钠仔细地调节至pH值为8.2，电导率通过加入去离子水来调节为3.0mS/cm2。
工艺参数本实验是作为膨胀床吸附来进行操作。
本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
吸附柱装载吸附剂至达到澄清床的高度(H0)为20cm(相应于大约16ml的固定吸附剂)，并用连续地加入以下的缓冲溶液1)1M的NaOH、2)0.2M的HCl、3)50％的乙醇水溶液、4)10mM的pH值为8.2的Tris/HCl0Mm在20-25℃下清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以900cm/hr的线流速来操作，从吸附柱中的流出物连接到UV监视器和记录器。
样品pH值调节为8.2的和电导率为3.0mS/cm的700ml的蛋白质馏分装载到吸附柱和整个馏分(非结合材料)中。在装载蛋白质馏分之后，吸附柱用10mM的pH值为8.2的Tris/HCl来清洗。整个的和清洗馏分收集作为一个组合的馏分(用UV监视器来跟踪清洗出的非结合材料)。在装载和清洗之后，释放出非结合的α-1-PI，并用15mM的pH值为6.0的柠檬酸钠钾来洗提，收集作为洗提物1。当在UV监视器的监视下洗提出所有的α-1-PI时，第二洗提缓冲溶液15mM的pH值为5.2的柠檬酸钠+500mM的氯化钠应用来洗提，释放出α-1-酸-糖蛋白作为洗提物2。根据在UV记录仪上的峰，收集洗提物2。定量来自吸附柱的人α-1-PI进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，目的是为了定量α-1-PI和α-1-酸-糖蛋白(血清类粘蛋白)在来自吸附柱的馏分中的相对浓度，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用0.6μl/cm2的兔抗-人-α-1-蛋白酶抑制剂(Dako Cytomation，丹麦，产品号A0012)和0.8μl/cm2的兔-抗-人血清类粘蛋白(Dako Cytomation，丹麦，货号A00110)来进行操作。
标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(100％作为参考)装载在吸附柱中来制作完成。在每个馏分中，α-1-PI和α-1-酸-糖蛋白的浓度都相对于标准曲线来确定，在该馏分中的相对产量可以由馏分的体积相对于在所应用的蛋白质馏分中的α-1-PI的体积和浓度来计算。
洗提物的纯度和展示弹性蛋白酶的结合活性SDS-PAGE对于SDS-PAGE，使用Invitrogen SDS-page的4-20％Tris-甘氨酸凝胶(产品号EC6025)。
弹性蛋白酶结合证明在蛋白质馏分中的α-1-PI(馏分1，实施例5)的弹性蛋白酶粘合活性通过在用弹性蛋白酶(Sigama code no E0127)孵育之前和之后用SDS-PAGE来分析原料用0.2M的NaOH调节蛋白质馏分至pH值为7，加入6.5μl的2.5mg/ml的弹性蛋白酶到500μl的蛋白质馏分中，在30℃下孵育30分钟。样品制备25μl的样品与25μl的样品缓冲液tris-甘氨酸Initrogen(产品号LC2676)混合，在水浴中煮沸5分钟。加入电泳缓冲液0.024M的tris(sigmaT1378)、0.19M的甘氨酸(Merck 5001901000)、0.1％的pH值为8.6的SDS(十二烷基硫酸钠，JTBaker 2811)。使用20μl的样品于每个分析狭槽中，调整电源至40mA的电流。当样品缓冲液中的蓝线(blue line)达到离凝胶底部1厘米处时，关掉电源，并且在震动的台面上，凝胶在Invitrogen胶体蓝色染色试剂盒(Invitrogen Colloidal Blue Staining Kit，产品号LC6025)中染色过夜。第二天，凝胶转移到水中，并且在水中脱色2小时。
实验结果以下表所示的是α-1-PI和α-1-酸-糖蛋白在装载于吸附柱中的各个蛋白质总量的百分比相对产量

结果显示出吸附过程很高效率地分离α-1-PI(α-1-蛋白酶抑制剂)和α-1-酸-糖蛋白。
在洗提物1中，α-1-PI的SDS-PAGE分析显示出80％的纯度，并且发现弹性结合活性大约为100％。发现α-1-酸-糖蛋白大约为45％的纯度，如由SDS-PAGE所确定的。
这些结果进一步地说明在低离子强度结合条件下使用包含氨基-烷基配体的吸附剂有效地分离α-1-PI和α-1-酸-糖蛋白。
实施例14用含有2-巯基烟酸的吸附剂，在不同的pH值条件下从人血浆中分离人血浆蛋白。
吸附剂吸附剂都是以琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒珠的密度为大约3.6g/ml，颗粒直径在40-100μm的范围，体积平均颗粒直径为50μm。吸附剂用2-巯基烟酸来激活和交联，并且与2-巯基烟酸结合，获得的配体浓度为32微摩尔/毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液蛋白质溶液、人血浆用去离子水以1体积的血浆对2体积的水的比例稀释。进行一系列的实验，其中，调节原料的pH值至某一范围的不同值(用1M的盐酸滴定)。进行如下的实验A.蛋白质溶液的pH值＝3.0B.蛋白质溶液的pH值＝4.0C.蛋白质溶液的pH值＝4.5D.蛋白质溶液的pH值＝5.0E.蛋白质溶液的pH值＝5.5F.蛋白质溶液的pH值＝6.0G.蛋白质溶液的pH值＝6.5工艺参数本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
对于每个实验，吸附柱装载吸附剂至澄清床的高度(H0)50cm(相应于大约×40ml的固定吸附剂)，并且，在20-25℃下，对于特定实验连续地加入以下的缓冲溶液1)1M的NaOH、2)40mM的柠檬酸缓冲液、3)40mM的具有与蛋白质溶液相同pH值的柠檬酸缓冲液来清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以400cm/hr的线流速来操作，从吸附柱的流出物连接到UV监视器和记录器上。
样品30ml的蛋白质溶液(相应于10ml的未稀释的血浆)装载到吸附柱中。
馏分的收集在装载蛋白质溶液之后，用10mM的具有与特定实验样品相同pH值的柠檬酸钠，非粘合的和弱粘合的材料清洗出吸附柱。根据吸附柱馏出物的UV监视，整个和清洗馏分、RT(未粘合馏分)收集作为一种馏分。
随后，粘合的蛋白质在连续的三步骤中洗提。
-洗提物1-第一洗提步骤是用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠来进行-洗提物2-第二洗提步骤是用0.3M的pH值为7.4的辛酸钠来进行-洗提物3-第三洗提步骤是用20mM的pH值为7.4的柠檬酸钠+0.1M的NaCl来进行在第一和第二洗提步骤之间，吸附柱用1吸附柱体积的pH值为7.4的1M的柠檬酸钠来清洗。
定量在整个和清洗馏分以及洗提1、2和3中的人血浆蛋白进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，目的是为了展示在由吸附柱馏出的每个馏分中的组分，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用如下的抗体(所有抗体来自于Dako Cytomation，丹麦)来进行操作

标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(100％作为参考)装载在吸附柱中来制作完成。四个馏分中的每个都相对于标准曲线来确定，可以确定在每个蛋白质馏分中的特定蛋白质的相对产量。如果在特定蛋白质馏分中的特定蛋白质相对于加入到吸附柱中的蛋白质的产量高于5％，蛋白质定义为分布在所述的馏分中。
实验结果所选择蛋白质的分布与样品和清洗液pH值间的函数关系

RT＝整个和第一清洗物；E1＝洗提物1；E2＝洗提物2；E3＝洗提物3；ND＝未确定。阈值至少5％的应用在吸附柱上的特定蛋白质必须存在馏分中。
该表说明对于配体2-巯基烟酸，蛋白质溶液和清洗缓冲溶液的pH值在5.0-5.5的范围，这导致最有效地分离所分析的蛋白质。每当pH值低于4.5或者高于5.5时，更多蛋白质出现在非粘合的馏分、RT中。当低于5.0时，发现α-1-蛋白酶抑制剂(α-1-抗胰蛋白酶)失活(聚合)，这可以由以下得到证实在和低于pH值4.5时，发现在RT和E2中出现α-1-蛋白酶抑制剂。
实施例15使用含有2-巯基烟酸的吸附剂，在不同的缓冲溶液和不同的离子强度/电导率下从人血浆中分离人血浆蛋白。
吸附剂吸附剂都是以琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒珠的密度为大约3.6g/ml，颗粒直径在40-100μm的范围，体积平均颗粒直径为50μm。吸附剂用2-巯基烟酸来激活和交联，并且与2-巯基烟酸结合，获得的配体浓度为32微摩尔/毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液的预处理蛋白质溶液(人血浆)用去离子水以1体积的血浆对2体积的水的比例稀释。进行一系列的实验，其中，蛋白质溶液中加入某一范围的不同缓冲溶液物质，得到不同离子强度/电导率。所有的实验都是在pH值为5.0的样品上操作。
进行如下的实验A.10mM的柠檬酸钠，电导率＝6.0Ms/cmB.20mM的柠檬酸钠，电导率＝8.5Ms/cmC.20mM的乙酸钠，电导率＝6.2Ms/cmD.20mM的组氨酸，电导率＝6.6Ms/cmE.20mM的甘氨酸，电导率＝5.5Ms/cmF.20mM的辛胺，电导率＝8.0Ms/cm工艺参数本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
对于每个实验，吸附柱装载吸附剂至澄清床的高度(H0)50cm(相应于大约×40ml的固定吸附剂)，并且，在20-25℃下，连续地加入以下的缓冲溶液1)1M的NaOH、2)40mM的pH值为4.5的柠檬酸缓冲液、3)40mM的pH值为5.0的柠檬酸缓冲液来清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以400cm/hr的线流速来操作，从吸附柱的流出物连接到UV监视器和记录器上。
样品30ml的蛋白质溶液(相应于10ml的未稀释的血浆)装载到吸附柱中。
馏分的收集在装载蛋白质溶液之后，用具有与特定实验样所加入的缓冲溶液相同类型和相同浓度的缓冲溶液，从吸附柱中清洗出非粘合的和弱粘合的材料。所有清洗缓冲溶液的pH值为5.0。根据吸附柱馏出物的UV监视，整个和清洗馏分、RT(未粘合馏分)收集作为一种馏分。
随后，粘合的蛋白质在连续的三步骤中洗提。
-洗提物1-第一洗提步骤是用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠来进行-洗提物2-第二洗提步骤是用0.3M的pH值为7.4的柠檬酸钠来进行-洗提物3-第三洗提步骤是用20mM的pH值为7.4的柠檬酸钠+0.1M的NaCl来进行在第一和第二洗提步骤之间，吸附柱用1吸附柱体积的pH值为7.4的1M的柠檬酸钠来清洗。
定量在整个和清洗馏分以及洗提1、2和3中的人血浆蛋白进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，目的是为了展示在由吸附柱馏出的每个馏分中的组分，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用如下的抗体(所有抗体来自于Dako Cytomation，丹麦)来进行操作

标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(100％作为参考)装载在吸附柱中来制作完成。四个馏分中的每个都相对于标准曲线来确定，可以确定在每个蛋白质馏分中的特定蛋白质的相对产量。如果在特定蛋白质馏分中的特定蛋白质相对于加入到吸附柱中的蛋白质的产量高于5％，蛋白质定义为分布在所述的馏分中。
实验结果所选择蛋白质的分布与样品和清洗液的组分/电导率之间的函数关系

RT＝整个和第一清洗物；E1＝洗提物1；E2＝洗提物2；E3＝洗提物3；。
阈值至少5％的应用在吸附柱上的特定蛋白质必须存在馏分中。
实施例16使用含有2-巯基烟酸的吸附剂，从不同的未稀释人和动物血浆中分离人和动物血浆蛋白。
吸附剂吸附剂都是以琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒珠的密度为大约2.0g/ml，颗粒直径在50-150μm的范围，体积平均颗粒直径为120μm。吸附剂用表氯醇来激活和交联，并且与2-巯基烟酸结合，获得的配体浓度为36微摩尔/毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液的预处理蛋白质溶液(人血浆和某些范围的动物血浆)用1M的盐酸调节pH值为5.0。用不同的血浆进行如下的不同的实验A.未稀释的人血浆B.未稀释的马血浆C.未稀释的牛科动物血浆D.未稀释的兔血浆E.未稀释的山羊血浆F.未稀释的小鸡血浆G.未稀释的猪血浆H.未稀释的老鼠血浆工艺参数本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
对于每个实验，吸附柱装载吸附剂至澄清床的高度(H0)50cm(相应于大约×40ml的固定吸附剂)，并且，在20-25℃下，连续地加入以下的缓冲溶液1)1M的NaOH、2)40mM的pH值为4.5的柠檬酸缓冲液、3)40mM的pH值为5.0的柠檬酸缓冲液来清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以900cm/hr的线流速来操作，从吸附柱的流出物连接到UV监视器和记录器上。
样品20ml的蛋白质溶液(相应于0.5毫升血浆/毫升固定吸附剂)装载到吸附柱中。
馏分的收集在装载蛋白质溶液之后，用pH值为5.0的10mM的柠檬酸钠，非粘合的和弱粘合的材料被清洗出吸附柱。根据吸附柱馏出物的UV监视，整个和清洗馏分、RT(未粘合蛋白质馏分)收集作为一种馏分。
随后，粘合的蛋白质在连续的三步骤中洗提。
-洗提1-第一洗提步骤是用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠来进行-洗提2-第二洗提步骤是用20mM的pH值为7.4的柠檬酸钠+0.1M的NaCl来进行所有蛋白质馏分通过用Invitrogen SDS-page的4-20％Tris-甘氨酸凝胶(产品号EC6025)的非还原性SDS-PAGE来分析。通过视觉观察，定量和半定量地检测在SDS-PAGE上的考马斯染色带，记录所选择的蛋白质在各个吸附柱馏分中的分布。如果存在特定蛋白质馏分中的蛋白质带评估为代表高于10％的所加入到吸附柱中的蛋白质总量，蛋白质定义为分布到特定蛋白质馏分中(阈值)。
实验结果所选择蛋白质分布与样品来源的关系

RT＝整个和第一清洗物；E1＝洗提物1；E2＝洗提物2；E3＝洗提物3；。
阈值至少5％的应用在吸附柱上的特定蛋白质必须存在馏分中。
该结果说明当用2-巯基烟酸结合的吸附剂在特定的工艺条件下分馏时，不同未稀释的动物和人血浆表现相类似。吸附剂几乎结合和洗提所有的来源于所测试物种的IgG。吸附剂结合存在于所测试血浆样品中的大部分白蛋白，在所有的实验中，结合的白蛋白可以用pH值为6.0的5mg/ml的辛酸钠来有效地洗提出来。
实施例17使用含有2-巯基烟酸的不同尺寸的吸附剂，从人血浆中分离人血浆蛋白。
吸附剂所使用的吸附剂都是以琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒珠的密度为大约2.5g/ml，颗粒直径和体积平均颗粒直径变化如下吸附剂A颗粒直径范围60-140μm体积平均颗粒直径90μm吸附剂B颗粒直径范围60-150μm体积平均颗粒直径120μm吸附剂C颗粒直径范围80-240μm体积平均颗粒直径150μm吸附剂D颗粒直径范围80-300μm体积平均颗粒直径200μm吸附剂E颗粒直径范围100-400μm体积平均颗粒直径250μm吸附剂A-E通过在固定孔尺寸尼龙网上过筛一批具有宽尺寸分布的颗粒来生产，它首先用表氯醇交联和激活，并且与2-巯基烟酸结合，获得配体浓度为28微摩尔/毫升沉降颗粒。因此，所有的吸附剂A-E设计为仅仅颗粒尺寸不同。
对于所有的吸附剂A-E，进行如下的实验操作
蛋白质溶液的预处理蛋白质溶液(人血浆)是用去离子水以1体积血浆对2体积水的比例来稀释，用1M的盐酸，调节pH值至5.0。此后电导率为5.2Ms/cm2。
工艺参数本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
吸附柱装载吸附剂至澄清床的高度(H0)50cm(相应于大约×40ml的固定吸附剂)，并且，在20-25℃下，连续地加入以下的缓冲溶液1)1M的NaOH、2)40mM的pH值为4.5的柠檬酸缓冲液、3)40mM的pH值为5.0的柠檬酸缓冲液来清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以900cm/hr的线流速来操作，从吸附柱的流出物连接到UV监视器和记录器上。
样品30ml的溶液(相应于10毫升未稀释的血浆)装载到吸附柱中。
馏分的收集在装载蛋白质溶液之后，用pH值为5.0的10mM的柠檬酸钠，非粘合的和弱粘合的材料被清洗出吸附柱。根据吸附柱馏出物的UV监视，整个和清洗馏分、RT(未粘合蛋白质馏分)收集作为一种馏分。
随后，粘合的蛋白质在连续的三步骤中洗提。
-洗提物1-第一洗提步骤是用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠来进行-洗提物2-第二洗提步骤是用20mM的pH值为7.4的柠檬酸钠+0.1M的NaCl来进行定量在整个和清洗馏分以及洗提1和2中的人血浆蛋白。进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，目的是为了展示在由吸附柱馏出的每个馏分中的组分，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用如下的抗体(所有抗体来自于Dako Cytomation，丹麦)来进行操作

标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(100％作为参考)装载在吸附柱中来制作完成。三个蛋白质馏分中的每个都相对于标准曲线来确定，可以确定在每个蛋白质馏分中的特定蛋白质的相对产量。
实验结果所选择蛋白质的分布与吸附剂颗粒尺寸之间的关系

RT＝整个和第一清洗物；E1＝洗提物1；E2＝洗提物2该结果说明在高流速(900cm/小时)下，只有吸附剂颗粒的体积平均颗粒直径低于150μm时，才可以实现几乎结合出现在所应用的样品中的所有白蛋白和IgG。颗粒尺寸越大，在各自的洗提蛋白质馏分中的蛋白质产量越低。
实施例18在直径为30cm的吸附柱中，从人血浆中大规模地分离人血浆蛋白。
吸附剂吸附剂都是以琼脂糖为基并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒珠的密度为大约2.8g/ml，颗粒直径在40-120μm的范围，体积平均颗粒直径为72μm。吸附剂包括作为配体的2-巯基烟酸，配体的浓度为38微摩尔/毫升沉降吸附剂。
蛋白质溶液的预处理蛋白质溶液(人血浆)是用去离子水以1体积血浆对2体积水的比例来稀释，用1M的盐酸，调节pH值至5.0。此后电导率为5.3mS/cm2。
工艺参数本实验是在FaseLine10膨胀床吸附柱(φ＝1cm，产品号7010-0000，UpFront Chromatography A/S)上操作。
吸附柱装载吸附剂至澄清床的高度(H0)50cm(相当于35.3升吸附剂)，在20-25℃下，连续地加入以下的缓冲溶液1)36升的1M的NaOH、2)90升的40mM的pH值为4.5的柠檬酸缓冲液、3)90升的40mM的pH值为5.0的柠檬酸缓冲液来清洗和平衡。
在所有步骤中，本实验以450cm/hr的线流速(相当于体积馏分5.3L/min)来操作，从吸附柱的流出物连接到UV监视器和记录器上。
样品30升的蛋白质溶液(相当于13升的未稀释血浆)装载到吸附柱中。
馏分的收集在装载蛋白质溶液之后，非粘合的和弱粘合的材料用pH值为5.0的10mM的柠檬酸钠清洗出吸附柱。根据吸附柱馏出物的UV监视，馏分1(未结合馏分)收集作为一种蛋白质馏分。
随后，粘合的蛋白质在连续的三步骤中洗提。
-蛋白质馏分2-第一洗提步骤是用5mg/ml的pH值为6.0的辛酸钠来进行-蛋白质馏分3-第二洗提步骤是用0.3M的pH值为7.4的柠檬酸钠来进行-蛋白质馏分4-第三洗提步骤是用pH值为7.4的20mM的柠檬酸钠+0.1M的NaCl来进行在第一和第二洗提步骤之间，吸附柱用40升的1M的pH值为7.4的柠檬酸钠简单清洗。
实验结果以下表所示的是每个馏分的体积

定量在从吸附柱中的馏分1、2、3和4中的人血浆蛋白的量。
进行单向放射免疫扩散(SRI)操作，其目的是表明在从吸附柱中馏出的每个馏分中的组分，如在文献Scand.J.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983中所描述的。
SRI是用如下的抗体(所有抗体来自于Dako Cytomation，丹麦)来进行操作

标准曲线是用浓度为100％、80％、60％、40％和20％的蛋白质溶液(100％作为参考)装载在吸附柱中来制作完成。四个馏分每个都相对于所测试的每个蛋白质的标准曲线来确定，可以确定在蛋白质馏分中特定蛋白质的相对产量。
实验结果每个人蛋白相对于在EBA吸附柱所流出的4个馏分的每个馏分中所应用原料的产量

“—”＝相对产量低于5％本发明方法可以以大规模方式高效率工作，这使得该血浆蛋白质的分离非常类似于在直径为1cm的吸附柱中所进行的实验。
实施例19通过用450cm/hr的流速和如实施例5的条件的膨胀床吸附，从cryo-poor血浆中分离人血浆蛋白。
cryo-poor血浆也称为冷上清液，它通过缓慢解冻冷冻的人柠檬酸血浆来产生。使用从冷沉淀物中分离，而不是重复实施例5的完全人柠檬酸血浆。所有其它参数保持不变。
实验结果该实验所显示出的结果类似于用完全的人血浆所获得的结果(如在实施例5所描述的)，除了在蛋白质馏分4(洗提物3)中完全没有血纤蛋白原。
实施例20
从重溶解的冷沉淀物中分离血纤蛋白原。使用具有低体积平均直径的高密度吸附剂批量吸附。
吸附剂吸附剂是以琼脂糖为基础并引入碳化钨颗粒，聚结颗粒的密度为3.8g/ml，颗粒直径在20-60μm的范围，其体积平均颗粒直径为38μm。吸附剂包括作为配体的2-巯基烟酸，配体的浓度为31毫摩尔/毫升沉降吸附剂。蛋白质溶液的预处理通过缓慢解冻2000ml的冷冻人柠檬酸血浆并且从冷上清液中分离而产生的冷沉淀物可以通过与10mM的pH值为6.7的柠檬酸钠混合来重新溶解，获得大约120ml的混浊溶液。
批吸附之后吸附柱洗提再溶解的冷沉淀物转移到200ml的玻璃烧杯中，加入用10mM的pH值为6.7的柠檬酸钠所完全清洗的20ml吸附剂珠。吸附剂和蛋白质溶液在环境温度下用轻微地机械搅拌30分钟来混和。在吸附之后，允许吸附剂变澄清，倒出上清液。然后加入3倍的100ml等分试样的清洗缓冲液(20mM的pH值为6.7的柠檬酸钠)，在每次加入之间，进行混和、沉降和移注。每次加入物进行混和2分钟。在清洗之后，吸附剂悬浮在很小量的清洗缓冲溶液中，倒入直径为2cm的填充床吸附柱中，在其中，它很快澄清。通过以2ml/min的流速加入pH值为6.7的20mM的磷酸钾+0.8M的氯化钠，进行洗提粘合蛋白质的操作。吸附柱洗提用UV监视器来监控，洗提峰收集在一种馏分中。
用SDS-PAGE(非还原性Invitrogen SDS-page的4-20％Tris-甘氨酸凝胶，产品号EC6025)来分析清洗的蛋白质馏分的纯度。血纤蛋白原机能活性通过von Clauss方法(用牛凝血酶的凝固时间)来确定。
实验结果30分钟吸附期间之后，在停止混合吸附剂和在溶解的冷沉淀物时，吸附剂颗粒沉降在容器的底部小于30秒内。从澄清的吸附剂移注上清液是非常容易，因为吸附剂珠静置在玻璃烧杯的底部，而没有与液相混和的明显趋势。加入和用3倍的清洗缓冲溶液来清洗在几分钟内平等地操作，这是由于吸附剂的快速分离。吸附剂在小于1分钟内同样地填充在洗提吸附柱中(这些程序用这种小直径的、低密度吸附珠通常花费几个小时)。血纤蛋白原从吸附柱中清洗出来，作为高浓度的澄清血纤蛋白原溶液(洗提体积＝21ml)。
洗提的血纤蛋白原的SDS-PAGE分析显示出蛋白质的纯度超过85％，IgG是其主要的污染物。在洗提物中，没有检测到白蛋白。发现洗提的血纤蛋白原的生物活性是完全迟钝的。
本实验说明了用具有低的体积平均直径的高密度吸附剂从再溶解的冷沉淀物中分离血浆蛋白质的明显优点。
实施例21用三个连续的吸附柱和用消除病毒的人血浆作为蛋白质溶液，喷流分离凝血/抗凝血因子、白蛋白、IgG、血纤蛋白原、α-1-蛋白酶抑制剂和α-1-酸-糖蛋白。
吸附剂在实施例10(配体＝1，4-二氨基二甲苯)、实施例5(2-巯基烟酸)和实施13(1，9-二氨基-壬烷)中所使用的吸附剂用于本实验中。
病毒消除通过在25摄氏度下加入磷酸三正丁酯(0.3％的最终浓度)和吐温-80(1％的最终浓度)，接着在相同温度下孵育6小时，用溶剂-去污剂溶液处理人血浆蛋白质溶液(称为S/D处理)。
连续吸附S/D处理的血浆然后在三个连续吸附步骤中分馏吸附柱A如实施例10所描述的吸附柱B如实施例5所描述的吸附柱C如实施例13所描述的吸附柱A如在实施例10中所描述的方式操作。用1M的盐酸，调整组合的整个和清洗馏分的pH值为5.0，然后用水稀释，获得最终的稀释液相对于原料的体积为1+2(如实施例5所述的)，然后，120ml的稀释蛋白质溶液应用于吸附柱B(如实施例5中所述的)。从吸附柱B中流出的组合的整个和清洗馏分经收集、预处理和加工(如实施例13所描述的)。对于所有三个吸附柱，收集和分析所有的洗提蛋白质馏分(如在各个实施例中所描述的)。
实验结果所有吸附柱洗提物的分析都给出与其在各个实施例中所描述的基本上相同的结果。因此，当使用选择的吸附剂时，通过S/D处理的病毒消除步骤并没有干扰蛋白质的分馏。同时，在任何分离的蛋白质馏分中，没有检测到吐温-80或者磷酸三正丁酯，这令人惊奇地说明所选择的吸附剂没有粘合这些物质。因此，分离的蛋白质馏分有效地消耗病毒消除物质，同时真正的分离蛋白质，所以，不需要额外的步骤从分离蛋白质中消除这些物质。
该实验进一步地说明成功地连续分离人血浆蛋白质成如下的、具有很小交叉污染和很高产量的、6种不同的蛋白质馏分A.凝血和抗凝血因子、B.白蛋白、C.IgG和转铁蛋白、D.血纤蛋白原、E.α-1-蛋白酶抑制剂、F.α-1-酸-糖蛋白。
交换吸附步骤顺序的进一步实验表明附柱A必须为第一步，这是为了避免凝血因子在pH值5.0时(用于吸附柱B)失活吸附柱C必须在吸附柱B之后，这是为了避免过量的白蛋白粘合到吸附柱C，随之发生严重的α-1-蛋白酶抑制剂的污染。
参考文献Cohn等人，“分离成蛋白质馏分和脂蛋白组分(Separation into Fractionsof Protein and Lipoprotein Component)”J.Am.Chem.Soc.，68，459-475，1946E.J.Cohn等人，血清和血浆蛋白的制备和性能(Preparation and Propertiesof Serum and Plasma Proteins)，IV，用于分离成蛋白质馏分和生物组织和流体的脂蛋白组分的系统(A system for the Separation into Fractions of the Proteinand Lipoprotein Components of Biological Tissues and Fluids)，the Journal of theAmerican Chemical Society，vol.LXVIII(Jan.-Jul.1946)，pp459-475；Scand.J.Immunol.Vol.17，Suppl.10，41-56，1983Finette G.M.S.等人，Biotechnol.Prog.，1998，14，pp286-293Malvern Instruments Ltd(Worcestershire，UK)in their Operators guide(Man0320 Issue 1.0Mar.2004)to the Mastersizer 2000E美国专利US2,390,074
美国专利US2,469,193美国专利US6,617,133美国专利US6,036,861美国专利US4,481,189欧洲专利EP 0 722 771国际专利WO01/83329国际专利WO92/18237国际专利WO2000/25884国际专利WO02/05923国际专利WO99/65586国际专利WO00/57982国际专利WO99/51316国际专利WO92/00799国际专利WO92/1629权利要求
1.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，其中，蛋白质溶液是从选自由血液如血清和/或者血浆以及其它血源所组成的组的来源获得，所述方法包括以下步骤k)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；l)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；m)将所述蛋白质溶液应用于含有吸附剂的吸附柱，所述吸附剂包括具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，所述吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度以及最多为150μm的平均体积颗粒直径；n)根据情况清洗吸附柱；o)从吸附剂中获得所述的一种或者多种蛋白质。
2.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质如一种或多种血清蛋白或者一种或多种血浆蛋白的方法，所述方法包括以下步骤k)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；l)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；m)将所述蛋白质溶液应用于含有吸附剂的吸附柱，所述吸附剂包括具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，所述吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度以及至多为150μm的平均体积颗粒直径；n)根据情况清洗吸附柱；o)从吸附剂中获得所述的一种或者多种蛋白质。
3.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤k)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；l)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；m)将所述蛋白质溶液应用于吸附，所述吸附剂包括具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒，吸附剂包括至少为1.5g/ml的颗粒密度，至多为150μm的平均体积颗粒直径；n)根据情况清洗吸附剂；o)从吸附剂中获得所述的一种或者多种蛋白质；其中所述蛋白质溶液已经被补充了醇。
4.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤k)根据情况调整蛋白质溶液的pH值为预设的pH值；l)根据情况调整蛋白质溶液的离子强度或者电导率为预设的离子强度或者预设的电导率；m)将所述蛋白质溶液应用于吸附，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；n)根据情况清洗吸附剂；o)从吸附剂中获得所述的一种或者多种蛋白质；其中蛋白质溶液已经被补充了醇。
5.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和预设的离子强度或电导率；b)在使蛋白质溶液与吸附剂接触之前，对蛋白质溶液进行至少一次消除病毒的处理；c)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；d)根据情况清洗吸附剂；以及e)从所述吸附剂中获得所述的一种或者多种蛋白质。
6.一种用于大规模地从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和预设的离子强度或电导率；b)在使蛋白质溶液与吸附剂接触之前，对蛋白质溶液进行至少一次消除病毒的处理；c)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；d)根据情况清洗吸附剂；以及e)从所述吸附剂中获得所述的一种或者多种蛋白质。
7.一种用于大规模地分离或者离析α-1-蛋白酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤a)提供一种包含所述α-1-蛋白酶抑制剂的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述的α-1-蛋白酶抑制剂。
8.一种用于大规模地分离或者离析α-1-蛋白酶抑制剂的方法，所述方法包括以下步骤a)提供一种包含α-1-蛋白酶抑制剂的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述的α-1-蛋白酶抑制剂。
9.一种用于大规模地分离或者离析人白蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述人白蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述的人白蛋白。
10.一种用于大规模地分离或者离析纤维蛋白原的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述纤维蛋白原的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述的纤维蛋白原。
11.一种用于大规模地分离或者离析纤维蛋白原的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述纤维蛋白原的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述的纤维蛋白原。
12.一种用于大规模地分离或者离析转铁蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述转铁蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述的转铁蛋白。
13.一种用于大规模地分离或者离析转铁蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述转铁蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述的转铁蛋白。
14.一种用于大规模地分离或者离析α-1-酸-糖蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述α-1-酸-糖蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述的α-1-酸-糖蛋白。
15.一种用于大规模地分离或者离析α-1-酸-糖蛋白的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含所述α-1-酸-糖蛋白的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述的α-1-酸-糖蛋白。
16.一种用于大规模地分离或者离析一种或者多种凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、Cl抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包含所述一种或者多种凝血因子的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，吸附剂包括负载多个共价键连接的包括芳香环或者杂芳香环系统和一种或者多种酸基团的官能团的职能化基体聚合物；以及c)从所述吸附剂中获得所述的一种或者多种凝血或者抗凝血因子。
17.一种用于大规模地分离或者离析一种或者多种凝血或者抗凝血因子如凝血因子II、凝血因子V、凝血因子VII、凝血因子VIII、冯维勒布兰德因子、凝血因子VIII-冯维勒布兰德因子的复合物、凝血因子IX、凝血因子X、凝血因子XI、C1抑制蛋白、C蛋白质和/或S蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供一种包含所述一种或者多种凝血因子的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设的离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触，其中，所述吸附剂包括一种具有至少一种被多孔材料所包围的高密度非多孔芯的颗粒；以及c)从所述吸附剂中获得所述的一种或者多种凝血或者抗凝血因子。
18.一种用于同时大规模地分离α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原中的至少3种蛋白质，如4种蛋白质，如5种蛋白质，如6种蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤a)提供包括至少三种所述α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和可根据情况预设离子强度或电导率；b)使所述蛋白质溶液与吸附剂接触；以及c)从所述吸附剂中获得选自由以下所组成的组的蛋白质中的至少3种蛋白质如4种蛋白质，如5种蛋白质，如6种蛋白质α-1蛋白酶抑制剂、IgG、人白蛋白、转铁蛋白、α-1-酸-糖蛋白、纤维蛋白原，它们相互之间分离为单个的蛋白质馏分。
全文摘要
本发明提供一种用于从蛋白质溶液中分离一种或者多种蛋白质的方法，该方法包括以下步骤a)提供一种包含一种或者多种蛋白质的蛋白质溶液，所述蛋白质溶液具有预设的pH值和预设的离子强度或电导率；b)将蛋白质溶液应用于包含吸附剂的填充床或者膨胀床吸附柱；以及c)从吸附柱中获得一种或者多种蛋白质；其中蛋白质溶液已经被补充了醇。
文档编号C07K14/75GK1972961SQ200580018504
公开日2007年5月30日 申请日期2005年6月7日 优先权日2004年6月7日
发明者阿兰·奥托·弗格·利赫姆 申请人:厄普弗朗特色谱公司