专利名称：一种特异、高效治疗csfv感染的rna干扰方法及生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明提供—种特异、高效治疗CSFV感染的RNA干扰方法，同时还提供了利用该方法生产的生物制剂，涉及治疗猪瘟病毒感染的药物，属于生物制药技术领域。
背景技术：
本发明涉及的猪瘟病毒以下简写CSFV。
目前，为了防止猪瘟病毒感染的一般采用被动免疫(注射高免血清)和主动免疫方法，但是仍然不能完全防治猪瘟流行。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)首次报道于1998年，是近两年才逐渐发展起来的一种全新的技术，RNAi从一发现开始就受到病毒学研究者的高度重视，被认为是抗病毒感染的最有效方法之一并被用于病毒学研究领域。应用RNAi技术抑制病毒增殖的关键是获得高效、特异的干扰小RNA(siRNA)序列。经检索应用RNA干扰法生产治疗猪瘟病毒感染的药物未见报道。
发明内容
本发明提供了一种特异、高效治疗CSFV感染的RNA干扰方法，通过设计针对猪瘟病毒不同基因的特异siRNA序列，利用T7 RNA聚合酶体外转录系统和质粒表达系统，得到了高效、特异抑制猪瘟病毒的干扰RNA分子，适用于工业化生产。
本发明还提供了利用该方生产的生物制剂，对CSFV的抑制效率高达到92.9-99.0％，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病和死亡。
本发明的技术解决方案包括以下步骤1.选择干扰RNA分子作用的序列利用RNA干扰技术设计合成RNA干扰分子后，这些RNA干扰分子能特异、高效抑制猪瘟病毒增殖从而对猪瘟病毒感染有明显治疗作用。
在猪瘟病毒基因组序列中的保守区域，根据具有AA-N19特征的21nt序列，进行同源性和二级结构分析，选择猪瘟病毒基因组上的以下11个干扰RNA分子作用序列表1干扰RNA分子作用序列及其位置
*位置相对与参考毒株shimen，GenBank登录号AF092448。
2.根据干扰RNA分子作用序列制成猪瘟治疗生物制剂可以通过以下两种方法制得1)体外合成siRNA分子生物制剂根据干扰RNA分子作用序列分别合成编码siRNA分子的正义链和反义链模板DNA和T7 RNA聚合酶结合序列，并确定对照序列为N1序列的反向序列。
序列如下T7 RNA聚合酶结合序列GGATCCTAATACGACTCACTATA5B1正义链模板序列AAGACGTCCCTCTTCTCATTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC5B1反义链模板序列AAGAATGAGAAGAGGGACGTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN1正义链模板序列AACCTGTCACCCTACCTATCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN1反义链模板序列AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2正义链模板序列AACTAATCCACTTCAGGGTTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2反义链模板序列AAGAACCCTGAAGTGGATTAGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS6正义链模板序列AATTCTTCTCTTTACTTCCACTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS6反义链模板序列AAGTGGAAGTAAAGAGAAGAATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS7正义链模板序列AAAGATTCTGGTGGTTTATTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC
S7反义链模板序列AAGAATAAACCACCAGAATCTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS8正义链模板序列AATTCAAATAACAAAGCCACCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS8反义链模板序列AAGGTGGCTTTGTTATTTGAATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS10正义链模板序列AAACTAAGTCCATTAGTCATCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS10反义链模板序列AAGATGACTAATGGACTTAGTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS11正义链模板序列AATGACTACTGGTATATGCCTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS11反义链模板序列AAGAGGCATATACCAGTAGTCATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS12正义链模板序列AAATGAGTGTAGTGTGGTAACTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS12反义链模板序列AAGTTACCACACTACACTCATTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS2正义链模板序列AAAGATTATTGTAATTCCAGCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS2反义链模板序列AAGCTGGAATTACAATAATCTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS3正义链模板序列AAATTCTTAACTGCCTTCATCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS3反义链模板序列AAGATGAAGGCAGTTAAGAATTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC对照的正义链模板序列AACCTATCCATCCCACTGTCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC对照的反义链模板序列AAGGACAGTGGGATGGATAGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC将上述合成的DNA序列用无DNA酶、无RNA酶的水分别稀释为100pmol/L，用PCR方法将它们分别合成为双链DNA序列在洁净的无DNA酶、无RNA酶的PCR管中加入稀释的T7 RNA聚合酶结合序列DNA 5.0μL，分别加入上述siRNA的正义链和反义链DNA 5.0μL，10×DNA聚合酶缓冲液5.0μL，10mmol/L dNTP 1.0μL，水33.8μL，置于PCR仪95℃变性2min，加入pfu DNA聚合酶0.2μL(1U)，再于95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸10s，5个循环后，72℃后延伸7min。反应结束后，加入经DEPC处理并高压灭菌的3mol/L醋酸钠(pH 5.2)5.0μL，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温干燥10min，加入无DNA酶、无RNA酶的水50μL充分溶解沉淀，聚丙稀酰胺凝胶电泳检查模板DNA制备结果。
转录方法按T7 RiboMAXTMExpress RNAi System说明书进行体外转录在洁净的无DNA酶、无RNA酶的PCR管中依次加入上述制备的模板DNA 4.0μL，RiboMAXTMExpress T7 2×缓冲液10.0μL，无核酸酶的水4.0μL，Enzyme Mix，T7 Express 2.0μL，然后置于37℃反应1h；加入无RNA酶的DNA酶1.0μL(1U)，37℃ 30min；混合相应的siRNA正义和反义链转录物，70℃保温10min，缓慢降温至室温；加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH 5.2)，加入等体积的异丙醇，混匀后冰浴5min，13000r/min离心10min，小心吸去上清液，500μL 70％乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温干燥10-15min，加入100μL水充分溶解沉淀，电泳检查，测定含量后分装为浓度0.3μg/μL，-80℃保存，得到体外转录生成的siRNA分子水溶液即为猪瘟治疗生物制剂，分别依据序列名称命名为siN1、siN2、siS6、siS7、siS8、siS10、siS11、siS12、siS2、siS3、si5B1、si对照。
2)质粒表达shRNA干扰分子的生物制剂根据pSilencer3.1H1 Hygro(Ambion)shRNA载体设计要求，设计用于表达shRNA干扰的DNA序列，设计策略见图2。为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率，设计为用DNA聚合酶合成的PCR策略，将表达目的shRNA序列的DNA序列拆分为两段部分互补配对的序列，然后用VNTI3.0辅助分析，使拆分的两段序列之间的互补配对碱基为21-23bp，而各拆分序列自身配对碱基少于10bp，以提高PCR合成双链模板DNA的效率。
表2合成各个shRNA模板DNA序列
具体步骤如下将合成的单链DNA稀释为100μmol/L，用PCR方法将它们分别合成为双链DNA取稀释的DNA 5.0μL，加入10×DNA聚合酶缓冲液5.0μL，10mmol/L dNTP1.0μL，水33.8μL，置于PCR仪95℃变性2min，加入pfu DNA聚合酶0.2μL(1U)，再于95℃30s，56℃30s，72℃10s，5个循环后，72℃后延伸7min。反应结束后，加入3mol/L醋酸钠(pH 5.2)5.0μL，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用1000μL 70％乙醇洗涤沉淀，弃去上清液，沉淀于室温干燥10min，加入50μL水充分溶解沉淀，-80℃保存备用。
用BamHI和HindIII双酶切表达shRNA的DNA插入片段，酶切消化结束后于70℃保温15min灭活内切酶，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后分别将它们克隆到pSilencer3.1H1 Hygro载体的BamHI和HindIII位点，转化大肠杆菌，对转化菌落用31H1FP(GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG)和31H1RP(GCGGATAACAATTTCACACAGG)为引物进行PCR快速鉴定，对PCR阳性克隆小量提取质粒，得到质粒的水溶液为猪瘟治疗生物制剂，分别依据序列名称将这些质粒命名为shN1、shN2、shS6、shS7、shS8、shS10、shS11、shS12、shS2、shS3、sh5B1、sh对照。
通过以下检测方法证明本发明制剂具有抑制猪瘟病毒增殖的作用例1体外合成的siRNA抑制猪瘟病毒增殖①计数PK-15细胞，用含10％小牛血清、0.3％谷氨酰胺、无抗生素的MEM营养液以1.0×104/孔传代于24孔细胞培养板，37℃5％CO2培养24h，使贴壁细胞生长满度约为30％-50％，吸去营养液，用无血清无抗生素的MEM营养液洗涤单层细胞3次，加入450μL无血清无抗生素的MEM备用。
②用X-tremeGene siRNA Transfection Reagent(Roche)将合成的siRNA分子转染PK-15细胞，具体方法为分别于无核酸酶的离心管中加入无血清无抗生素的MEM营养液47.5μL、X-tremeGene siRNA Transfection Reagent 2.0μL，轻轻混匀，室温静置3-5min，取另一无核酸酶的离心管，加入无血清无抗生素的MEM营养液48.0μL，siRNA分子2.0μL，轻轻混合均匀，室温静置3-5min，混合上述两个离心管中溶液，室温静置15-20min，使脂质体和siRNA形成转染复合物，然后分别加入PK-15细胞单层中，轻轻混匀，37℃孵育4-6h，用无血清无抗生素的MEM洗涤转染细胞，换用含2％小牛血清的MEM营养液于37℃，5％CO2培养箱培养20h，用5.0×102TCID50的猪瘟病毒Shimen株感染转染了siRNA的细胞，感染后培养72h，用间接免疫荧光试验、Real-time PCR和病毒的半数细胞感染量(TCID50)测定等方法检测猪瘟病毒在转染细胞中的增殖，测定siRNA对猪瘟病毒感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。
表1间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况结果
转染siRNA的PK-15细胞感染猪瘟病毒后，间接免疫荧光检测结果表明，未转染的PK-15细胞和转染si对照的PK-15细胞，感染猪瘟病毒72h后，几乎所有的细胞均能被荧光抗体染色，细胞发出绿色荧光，转染猪瘟病毒特异的siRNA的细胞感染猪瘟病毒后，只有极少的细胞能被荧光抗体染色，出现荧光的细胞不到全部细胞的1％。
表2Real-time PCR方法检测病毒基因组增殖情况
结果显示转染对照siRNA分子的细胞感染病毒后72h，细胞总RNA中的猪瘟病毒基因组RNA拷贝数为5.95×105copies/5ng总RNA，而siN1、siN2、si5B1、siS2、siS3、siS6、siS7、siS8、siS10、siS11、siS12转染细胞的猪瘟病毒基因组RNA拷贝数分别为4.89×104、1.35×105和1.40×105、1.82×105、2.13×105、1.53×105、2.86×105、1.94×105、1.60×105、2.03×105、1.89×105、1.40×105copies/5ng总RNA，分别为转染si对照细胞的1/12.1、1/4.4、1/4.2、1/3.3、1/2.8、1/3.9、1/2.1、1/3.1、1/3.7、1/2.9、1/3.2，表明导入细胞的猪瘟病毒特异的siRNA分子抑制了病毒在感染细胞中的增殖。回收Real-time PCR产物，进行序列测定，结果表明Real-time PCR扩增片段为猪瘟病毒Shimen株NS5B基因片段，说明检测结果具有高度的特异性。
表3测定细胞中病毒的半数细胞感染量(TCID50)增减情况
结果显示转染对照si对照的细胞感染猪瘟病毒后，病毒能有效地在细胞中增殖，显示出较高的感染滴度，感染后60h的TCID50测定结果为1×104.25，与未转染细胞感染猪瘟病毒后60h的相当，表明转染试剂及转染过程对细胞支持猪瘟病毒的增殖能力有效较小，而转染猪瘟病毒siRNA分子的细胞感染猪瘟病毒后，TCID50较低，病毒感染后60h，siN1、siN2、si5B1、siS2、siS3、siS6、siS7、siS8、siS10、siS11、siS12转染细胞的TCID50与si对照的感染滴度相比，其TCID50分别为1/46.8、1/31.6、1/56.2、1/13.8、1/11.2、1/21.9、1/9.8、1/13.2、1/19.1、1/12.9、1/18.2倍，表明siN1、siN2和si5B1 siN1、siN2、si5B1、siS2、siS3、siS6、siS7、siS8、siS10、siS11、siS12有效地抑制了猪瘟病毒的增殖。
例2.
表达的shRNA抑制猪瘟病毒增殖用含有10％小牛血清、不含抗生素的MEM营养液传代PK-15细胞于24孔细胞培养板，每孔5.0×104细胞/500μL个，37℃，5％CO2培养箱中培养20-24h，使细胞贴壁生长满度达到90-95％，用LipofectamineTM2000(Invitrogen)进行转染，(每孔细胞)方法为①取0.8μg质粒DNA加入50μL无血清无抗生素的MEM中，混匀。
②取2.0μL LipofectamineTM2000加入50μL无血清无抗生素的MEM中，轻轻混匀，于室温静置5min。
③将稀释的质粒DNA加入稀释的LipofectamineTM2000中，轻轻混匀后于室温静置20min，以形成DNA-LipofectamineTM2000复合体。
④将形成的DNA-LipofectamineTM2000加入到上述准备的中，轻轻混匀，置于37℃5％CO2培养箱中转染4-6h，换用含有2％小牛血清和抗生素的MEM，37℃5％CO2培养箱中培养备用。
⑤抗生素抗性筛选将转染了shRNA表达质粒的细胞，按优化确定的传代细胞满度，用含10％血清的MEM传代于6孔细胞培养板中(同时传代相同满度的未转染的PK-15细胞作为加压的正常对照细胞)，培养24h后，换用含有杀细胞浓度的相应抗生素(G-418或hygromicin B)、含有2％血清的MEM，37℃培养，杀死未转入质粒的细胞。其间每隔3d换用含抗生素的新鲜营养液，直至对照细胞完全死亡，转染质粒的细胞长出细胞集落。换用含有50％杀细胞浓度的相应抗生素继续培养转染细胞，细胞集落长满培养孔后，扩大培养筛选所得细胞备用。
⑥表达的shRNA抑制猪瘟病毒的效果检测筛选得到的有抗生素抗性的转染细胞，用无抗生素(G-418或hygromicin B)的MEM传代于96孔细胞培养板，培养20-24h后，用1×102TCID50的猪瘟病毒Shimen株感染，病毒感染后培养72h，用间接免疫荧光、Real-time PCR、病毒的半数细胞感染量(TCID50)测定等方法检测猪瘟病毒在转染细胞中的增殖，测定siRNA对猪瘟病毒感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。
表4间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况
间接免疫荧光试验检测细胞被感染情况结果表明，设计的shRNA分子抑制了病毒感染细胞。
表5Real-time PCR方法检测基因组RNA拷贝数测定结果
注抑制率＝(对照分子数—shRNA样品分子数)/对照分子数×100％，计算各个shRNA抑制病毒基因组复制的效率，表中抑制倍数为对照/shRNA的值-1。Real-time PCR方法检测基因组RNA拷贝数测定结果表明猪瘟病毒在转染细胞中的基因组复制受到了高效的抑制。
表6稳定转染细胞感染猪瘟病毒后不同时间TCID50测定结果
检测结果表明转染sh对照的细胞，在猪瘟病毒感染后，其感染滴度增加迅速，在感染后48-60h达到高峰，体现了猪瘟病毒在PK-15细胞中增殖时其感染滴度的变化特点，而与对照细胞相比，转染猪瘟病毒特异的shRNA表达质粒的细胞，猪瘟病毒的感染滴度增加速度慢，且比对照细胞的感染滴度低得多，在对照细胞的感染滴度达到高峰(48-60h)时，转染猪瘟病毒特异的shRNA表达质粒的细胞的感染滴度仍然保持在较低的水平，且呈现出较为平滑的增长趋势，表明质粒表达的猪瘟病毒特异的shRNA使猪瘟病毒的成熟的感染性的病毒粒子的组装过程受到了抑制，且抑制作用能持续较长的时间，转染猪瘟病毒特异的shRNA表达质粒的细胞感染病毒后即使在感染滴度最高的时间(72-96h)，其感染滴度仍比对照低一个数量级。
检测结果表明，在感染后60h，按sh对照/shRNA-1计算抑制倍数，则shN1、shS6、shS10、shS11、shS2、shS3、sh5B1、shS12、shN2、shS7、shS8抑制猪瘟病毒TCID50的倍数分别为56.3、8.2、25.9、10.1、17.9、5.6、17.9、5.6、11.0、6.0、9.0倍，即使在shRNA转染细胞TCID50较高的96h，仍然对病毒具有4-10倍的抑制效率。
例3动物实验水平①购进50只日本大耳白家兔，进行编号，饲养观察7d，测定家兔正常基础体温每天测定两次，将编号的家兔用SPSS软件进行随机分组，每组8只，分组及注射见表3。
表3实验家兔分组
实验家兔分组后，按上表的所示的注射剂量，分别注射转录获得的siRNA和shRNA表达质粒，其中质粒在攻毒前24h注射，注射部位为颈部皮下，siRNA与攻毒同时注射，为静脉注射。
②HCLV攻毒及体温测定注射shRNA表达质粒和siRNA的家兔，通过静脉注射50×ID50的猪瘟兔化弱毒株，注射后24h内每12h测量2次体温，24h后每间隔6h测定家兔体温，直到家兔体温恢复到正常体温值。
表7各组家兔的平均体温(℃)
如表所示，在体外转录的siRNA实验组si对照、siN1和siN2三个组中，注射转录的si对照组的家兔首次升温超过基础体温的0.5℃的时间是在30h，之后动物持续出现高热，且能持续6个温次(36h)至攻毒后60h，而实验组出现发热时间的明显比对照组延迟，siN1组的时间在攻毒后48h，比对照组的发热时间延迟了12h，且发热温次只有3个；siN2注射组的发热出现时间在攻毒后54h，比对照组延迟了18h，同样，其发热时间只持续了18h(3个温次)，两个组的发热期的平均体温均低于对照组。在注射shRNA表达质粒的三个实验组中，注射sh对照表达质粒的家兔发热的时间出现在36h，持续时间为36h，而实验组shN1的发热时间在54h，比对照组延迟了18h，持续时间为18h所，shN2注射组出现发热的时间在48h，与其他三个实验组不同的是，shN2组的发热持续时间稍长，为24h(4个温次)。
从表中的实验结果看出，注射猪瘟病毒特异干扰RNA的实验组均表现出发热时间延迟，发热平均温度比对照组略低，且发热持续时间比对照组大大缩短的特点，表明猪瘟病毒特异的干扰RNA延迟了猪瘟兔化弱毒株在家兔体内的增殖，推迟了使家兔出现高热反应所需的病毒量。从图3中的家兔体温变化趋势图中可以看出，实验组的体温上升速度明显比对照组慢，出现持续高热的时间比对照组的短，且温度较对照组低。
③抑制病毒增殖测定恢复到正常体温的家兔，在6h内捕杀，无菌采集家兔脾脏和肠系膜淋巴结，用Real-time PCR、病毒的半数细胞感染量(TCID50)测定等方法检测猪瘟病毒在家兔体内中的增殖，测定siRNA分子对猪瘟病毒感染增殖过程中病毒基因表达的抑制作用。
在用50×ID50的猪瘟病毒兔化弱毒株攻毒后测定家兔的体温，提取家兔脾脏总RNA，用Real-time PCR检测病毒基因组增殖情况，结果显示见表8。
表8实验家兔基因组RNA测定结果
对照组si对照和sh对照的基因组数量在较高的水平上波动，而实验组中的基因组数量则较低，证明病毒增殖受到抑制。
取采集的各组实验家兔的脾脏，等量混合研磨后测定它们的感染滴度，见表9。
表9兔脾脏内病毒感染滴度检测结果
结果表明，si对照，siN1，siN2，sh对照，N1，N2注射组所对应的HCLV的ID50分别为1×103.83，1×103.08，1×103.33，1×103.92，1×103.33，1×103.17，对照组si对照的ID50分别是siN1和siN2的5.62倍和2.15倍，sh对照的ID50分别是N1和N2的3.87倍和5.58倍。测定结果表明注射转录的siRNA和shRNA表达质粒均有效地抑制了猪瘟兔化弱毒株在家兔体内的增殖。
本发明的积极效果在于应用RNA干扰法生产治疗猪瘟病毒感染的生物制剂，得到了高效、特异抑制猪瘟病毒的干扰RNA分子，适用于工业化生产。本发明还提供了利用该方生产的生物制剂，对CSFV的抑制效率高达到92.9-99.0％，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病率和死亡。
图1为本发明体外转录合成siRNA分子示意图。
图2为本发明shRNA分子的示意图。
图3家兔攻毒后的体温曲线。
具体实施例方式
实施例1 siRNA设计分析GenBank中已发表的猪瘟病毒基因组序列，选择基因组中保守的区域，根据RNAi技术的要求，寻找具有AA-N19特征的21nt序列，进行BlastN和二级结构分析，根据BlastN分析结果，用VNTI3.0软件分析它们的(G+C)％、Tm值、内部发夹环结构等理化参数，选择(G+C)％较低的序列，设计了针对猪瘟病毒各个基因的11个siRNA分子干扰序列。
所设计的序列及其在猪瘟病毒基因组中的位置如表10所示表10siRNA分子干扰序列及其位置
*位置相对与参考毒株shimen，GenBank登录号AF092448。
实施例2 体外合成siRNA按T7 RiboMAXTMExpress RNAi System(Promega)说明书设计合成实施例1中选定的11个片段的siRNA分子的DNA序列和T7 RNA聚合酶结合序列，参见附图1；分别合成转录各个siRNA分子的正义链和反义链的模板DNA，序列如下T7 RNA聚合酶结合序列GGATCCTAATACGACTCACTATA。
5B1正义链模板序列AAGACGTCCCTCTTCTCATTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC5B1反义链的模板序列AAGAATGAGAAGAGGGACGTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN1正义链模板序列AACCTGTCACCCTACCTATCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN1反义链的模板序列AAGGATAGGTAGGGTGACAGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2正义链模板序列AACTAATCCACTTCAGGGTTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCN2反义链的模板序列AAGAACCCTGAAGTGGATTAGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS6正义链模板序列AATTCTTCTCTTTACTTCCACTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS6反义链的模板序列AAGTGGAAGTAAAGAGAAGAATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS7正义链模板序列AAAGATTCTGGTGGTTTATTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS7反义链的模板序列AAGAATAAACCACCAGAATCTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS8正义链模板序列AATTCAAATAACAAAGCCACCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS8反义链的模板序列AAGGTGGCTTTGTTATTTGAATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS10正义链模板序列AAACTAAGTCCATTAGTCATCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS10反义链的模板序列AAGATGACTAATGGACTTAGTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS11正义链模板序列AATGACTACTGGTATATGCCTCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS11反义链的模板序列AAGAGGCATATACCAGTAGTCATATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS12正义链模板序列AAATGAGTGTAGTGTGGTAACTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS12反义链的模板序列AAGTTACCACACTACACTCATTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS2正义链模板序列AAAGATTATTGTAATTCCAGCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS2反义链的模板序列AAGCTGGAATTACAATAATCTTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS3正义链模板序列AAATTCTTAACTGCCTTCATCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCCS3反义链的模板序列AAGATGAAGGCAGTTAAGAATTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC对照的正义链模板序列AACCTATCCATCCCACTGTCCTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC对照的反义链的模板序列AAGGACAGTGGGATGGATAGGTATAGTGAGTCGTATTAGGATCC具体步骤为将上述合成的DNA用无DNA酶、无RNA酶的水分别稀释为100pmol/L，按下面步骤分别合成11个siRNA分子。
用PCR方法将它们分别合成为双链DNA，在洁净的无DNA酶、无RNA酶的PCR管中加入稀释的T7 RNA聚合酶结合序列DNA 5.0μL，分别加入上述11个用来转录成siRNA分子的的正义链和反义链DNA 5.0μL，10×pfu DNA polymerasebuffer 5.0μL，10mmol/L dNTP 1.0μL，水33.8μL，置于PCR仪95℃变性2min，加入pfu DNA polymerase 0.2μL(1U)，再于95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸10s，5个循环后，72℃后延伸7min。反应结束后，加入经DEPC处理并高压灭菌的3mol/L醋酸钠(pH 5.2)5.0μL，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用70％乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温干燥10min，加入无DNA酶、无RNA酶的水50μL充分溶解沉淀，聚丙稀酰胺凝胶电泳检查模板DNA制备结果。转录方法按T7RiboMAXTMExpress RNAi System说明书进行体在洁净的无DNA酶、无RNA酶的PCR管中依次加入上述制备的模板DNA 4.0μL，RiboMAXTMExpress T7 2×Buffer 10.0μL，Nuclease-Free Water 4.0μL，Enzyme Mix，T7Express 2.0μL，然后置于37℃反应1h；加入无RNA酶的DNA酶1.0μL(1U)，37℃ 30min；混合相应的siRNA正义和反义链转录物，70℃保温10min，缓慢降温至室温；加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH 5.2)，加入等体积的异丙醇，混匀后冰浴5min，13000r/min离心10min，小心吸去上清液，500μL 70％乙醇洗涤沉淀，沉淀于室温干燥10-15min，加入100μL水充分溶解沉淀，电泳检查，测定含量后分装为0.3μg/μL，-80℃保存备用。得到体外合成的siRNA猪瘟治疗生物制剂，其碱基序列见表11。
表11体外合成的siRNA猪瘟治疗生物制剂及对照siRNA分子
实施例3 质粒表达shRNA分子的设计方法根据pSilencer3.1H1Hygro(Ambion)shRNA载体设计要求，设计用于表达shRNA的DNA序列，设计策略见表12。为了提高序列正确退火成为双链DNA分子的效率，设计为用DNA聚合酶合成的PCR策略，将表达目的shRNA序列的DNA序列拆分为两段部分互补配对的序列，然后用VNTI3.0辅助分析，使拆分的两段序列之间的互补配对碱基为21-23bp，而各拆分序列自身配对碱基少于10bp，以提高PCR合成双链模板DNA的效率。
设计合成的各个shRNA模板DNA序列如表12表12生成shRNA分子的模板DNA序列
具体步骤如下按下面步骤分别合成11个生成shRNA分子的质粒，将合成的DNA稀释为100μmol/L，用PCR方法将它们分别合成为双链DNA，方法为取稀释的DNA 5.0μL，加入10×pfu DNA polymerase buffer 5.0μL，10mmol/L dNTP 1.0μL，水33.8μL，置于PCR仪95℃变性2min，加入pfu DNA polymerase 0.2μL(1U)，再于95℃30s，56℃30s，72℃10s，5个循环后，72℃后延伸7min。反应结束后，加入3mol/L醋酸钠(pH 5.2)5.0μL，然后加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后于-20℃放置10min，12000r/min离心10min，弃去上清液，用1000μL 70％乙醇洗涤沉淀，弃去上清液，沉淀于室温干燥10min，加入50μL水充分溶解沉淀，-80℃保存备用。用BamHI和HindIII双酶切表达shRNA的DNA插入片段，酶切消化结束后于70℃保温15min灭活内切酶，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后分别将它们克隆到pSilencer3.1H1 Hygro载体的BamHI和HindIII位点，转化大肠杆菌，对转化菌落用31H1FP(GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG)和31H1RP(GCGGATAACAATTTCACACAGG)为引物进行PCR快速鉴定，对PCR阳性克隆小量提取质粒，通过测序确定重组质粒中的插入片段的正确性。
得到的质粒表达的shRNA分子能抑制猪瘟病毒增殖，表达shRNA分子的pSilencer3.1H1 Hygro载体在BamHI和HindIII酶切位点间插入序列见表13。
表13表达shRNA分子的pSilencer3.1H1Hygro载体在BamHI和HindIII酶切位点间插入序列
权利要求
1.以下猪瘟病毒基因组上序列，利用RNA干扰技术设计合成RAN干扰分子后，这些RNA干扰分子能特异、高效抑制猪瘟病毒增殖从而对猪瘟病毒感染有明显治疗作用，其特征在于AAGGATAGGTAGGGTGACAGG(721-741)；AAGAACCCTGAAGTGGATTAG(820-840)；AAGTGGAAGTAAAGAGAAGAA(892-912)；AAGAATAAACCACCAGAATCT(1082-1102)；AAGGTGGCTTTGTTATTTGAA(2255-2275)；AAGATGACTAATGGACTTAGT(3923-3943)；AAGAGGCATATACCAGTAGTCA(7253-7274)；AAGCTGGAATTACAATAATCT(7837-7857)；AAGATGAAGGCAGTTAAGAAT(8606-8626)；AAGAATGAGAAGAGGGACGTC(10700-10720)；AAGTTACCACACTACACTCAT(12205-12225)。
2.应用权利要求1所述的猪瘟病毒基因组上序列制成的生物制剂方法，包括以下步骤合成权利要求1所述序列的siRNA分子的正义链和反义链模板DNA和T7 RNA聚合酶结合序列，利用T7 RiboMAXTMExpress RNAiSystem(Promega)体外转录系统设计合成siRNA分子，得到体外转录生成的siRNA分子猪瘟治疗生物制剂。
3.应用权利要求1所述的猪瘟病毒基因组上序列制成的生物制剂方法，包括以下步骤按照pSilencer3.1H1 Hygro(Ambion)shRNA载体使用方法，合成针对根据权利要求1所述的猪瘟病毒基因组上序列的能生成shRNA分子的质粒，得到猪瘟治疗生物制剂。
全文摘要
本发明提供了一种特异、高效治疗CSFV感染的RNA干扰方法，通过设计针对猪瘟病毒不同基因的特异siRNA序列，利用T7 RNA聚合酶体外转录系统和质粒表达系统，得到了高效、特异抑制猪瘟病毒的干扰RNA分子，适用于工业化生产。本发明还提供了利用该方生产的生物制剂，对CSFV的抑制效率高达到92.9－99.0％，在敏感动物体内能明显阻止CSFV的感染，使动物免于发病率和死亡。
文档编号C07H21/02GK1884526SQ200610016960
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月21日 优先权日2006年6月21日
发明者涂长春, 徐兴然 申请人:中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所