专利名称：一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法
技术领域：
本发明涉及利用毕赤酵母细胞表达体系分泌表达并纯化人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)晚期蛋白L1，纯化后的L1蛋白可以自组装成病毒样颗粒(VLP)；利用酵母偏爱密码子对L1基因进行修饰，以利于L1蛋白在酵母细胞中的分泌表达。
背景技术：
人乳头瘤病毒(HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。根据感染部位可分为皮肤型和粘膜型两组，粘膜型HPV又根据引起病变的性质分为两类引起粘膜上皮良性增生病变的低危型和与人类多种器官恶性肿瘤(如宫颈癌、阴茎癌、喉及头颈癌、支气管癌、食管癌、口腔癌等)密切相关的高危型。根据核酸序列同源性，HPV可分为100多型，不同型别的HPV引起不同的疾病。HPV 1、2、3、4、7、10、26-29在正常或免疫缺损个体中引起良性疣。HPV 5、8、9、12、14、15、17、19-25、36、46-50在免疫缺损个体中引起扁平状损伤。HPV 6、11、34、39、41-44、51-55引起生殖道或呼吸道粘膜发生非恶性湿疣。HPV 16、18和58与宫颈癌的发生高度相关，其中HPV16是最主要的致癌因素。HPV6和11是90％以上生殖器疣和喉乳头瘤的致病因子。
完整的人乳头瘤病毒(Papillomavirus，PV)颗粒直径约55nm，由病毒基因组DNA与衣壳两部分组成，无包膜，衣壳呈二十面体，由72个壳粒组成，病毒颗粒在CsCl中的浮力密度为1.34g/cm3。病毒基因组是双链环状DNA，约8kb。基因组含至少8个开放阅读框(ORF)，ORF间可部分或全部重叠，基因组根据功能分为三个功能区早期区，编码6个非结构蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)，编码的蛋白与病毒的复制、转录和转化作用有关晚期区，含L1、L2两个ORF，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2两个结构蛋白，参与病毒粒子的组装；长控制区(LCR)，又称非编码区或上游调控区，不编码任何蛋白，但含有复制起点、启动子、增强子、沉默子等多种调控元件，影响病毒的复制和转录。
疫苗防治HPV相关疾病是近几年来的研究热点。由于目前无法通过组织培养获得大量的HPV病毒，并且考虑到HPVE6、E7基因的潜在致癌性，因此，不能通过减毒活疫苗或灭活疫苗等传统疫苗制备方式获得HPV疫苗。伴随分子生物学和基因工程技术的发展，目前HPV疫苗研究主要集中在HPV病毒样颗粒疫苗、重组病毒疫苗、亚单位疫苗等。
HPV病毒样颗粒疫苗主要是以HPV衣壳为首选目的蛋白。HPV衣壳是由L1和L2蛋白共同构成，二者比例约5∶1。单独的L1蛋白可以自发组装成直径与HPV成熟病毒大小相近(约55nm)的病毒样颗粒，VLP和天然PV的形态相似，都是二十面体结构，只是VLP内部无病毒核酸。在动物实验中，只有L1蛋白装配成的VLP诱发的抗体具有中和病毒、预防感染的能力，而变性的L1蛋白免疫后不能预防感染。VLP保留了天然病毒粒子的抗原表位，是最有希望的HPV预防性候选疫苗，VLP结构的保留对预防病毒感染至关重要。因此，在HPV疫苗研制及HPV临床诊断中，获得保留有天然病毒构象及尽可能多的表位的重组病毒样颗粒是关键，而且需要高效率的表达及制备方法。
在原核细胞中表达时因缺乏必要的蛋白质翻译后修饰、加工、转运等机制不能在细胞内表达过程中自动折叠形成衣壳立体结构(即VLP)。有报道表明在大肠杆菌中表达L1尽管不能自动装配成VLP，但经过复杂的体外变性复性过程，仍可以形成VLP，但得率非常低，仅有0.02-0.04％。所以，尽管在基因工程产物制备上原核表达系统有成本低、工艺简单、产量高的优点，但实现重组HPV L1装配成VLP这一目的，不适合选择原核表达系统。
最早关于HPV衣壳蛋白装配成病毒样颗粒(VLP)的研究是用痘苗病毒表达系统表达HPV16的L1和L2蛋白(Zhou J et al.，Virology1991 Nov；185(1)251.257)。Rose等用杆状病毒表达系统单独表达HPVLl蛋白时自动装配成VLP(Rose RC et al.，J Virol 1993，67(4)1936.1944)，W09420 137(Rose RC et al.)专利公开了杆状病毒表达系统制备L1蛋白及VLP。Hofmann在酿酒酵母中表达了HPV-6a L1和L1+L2并观察到了自组装成的VLP(Hofmann KJ，et al.，Virology.1995，209(2)506-518.)，W0953 1 532(Hofmann KJ，et al.)公开了由酵母表达系统制备重组VLP(L1，L1+L2)的方法。US5,888,516(kathrin U.Jansen，et al.)也在酿酒酵母中表达了HPV-16L1和L1+L2并观察到了自组装成的VLP，然而，这些酵母表达主要是在胞内进行，纯化工艺相对繁琐，并且所形成的病毒样颗粒均一性较差，US6,245,568B1专利中对病毒样颗粒的分解和再组装进行了研究，病毒样颗粒经过再组装后样品的均一性有较好的提高。
发明内容
本发明提供了一种高效制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，所述方法包括如下步骤(a)分别将编码所述人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；(b)利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒。
本发明一个实施方式中，其中编码人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因包括从感染人乳头瘤病毒的病理组织中提取的L1基因。
本发明一个实施方式中，其中编码人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因还包括根据酵母偏爱密码子进行基因修饰的L1基因。
本发明一个实施方式中，其中所述人乳头瘤病毒为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18或HPV58型别。
本发明一个实施方式中，其中(a)所用的宿主酵母菌为毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168或SMD1168H菌株。
本发明一个实施方式中，其中(a)步骤所用表达载体为pPICZαB，也可用其他分泌表达载体如pPIC9K。
本发明一个实施方式中，其中(b)步骤纯化L1蛋白时至少应用一步层析过程。
本发明一个实施方式中，其中一步层析包括DEAE阴离子交换柱层析。
本发明利用毕赤酵母细胞表达体系高效率表达HPV16L1蛋白，经过柱层析纯化，获得重组病毒样颗粒，纯度大于95％；应用聚合酶链反应(PCR)合成法，根据毕赤酵母密码子的偏爱性，合成病毒衣壳蛋白L1基因，并克隆到毕赤酵母表达载体中，构建重组毕赤酵母菌株，诱导表达L1蛋白，并可形成病毒样颗粒，L1蛋白表达量较未修饰的有明显提高。所得病毒样颗粒在电镜下观察为55～60nm，与天然HPV病毒粒子相似。本发明提供的方法适用于制备HPV 6、11、16、18、58等其它型别HPV的重组病毒样颗粒。本发明方法中使用的酵母表达载体和毕赤酵母是本领域熟知的常规载体和细胞，例如表达载体pPICzαB、酵母GS115菌株等。
本发明的方法具有如下优点1)分泌表达L1，所得L1蛋白可自组装成VLPs。2)表达产物自组装形成的病毒样颗粒具有与天然相似的结构，能自组装成病毒样颗粒，所形成的病毒样颗粒均一性较好。3)酵母细胞可实现大规模发酵，L1蛋白分泌到发酵上清中，纯化工艺相对简单、成本低，适合于规模生产。
图1pPICZaB-L1用XhoI与XbaI和pPICZaB-mL1用XhoI与NotI双酶切泳道11Kb Marker
泳道2pPICZaB-16L1 XhoI与XbaI酶切泳道3pPICZaB-6L1 XhoI与XbaI酶切泳道4pPICZaB-58L1 XhoI与XbaI酶切泳道5pPICZaB-m16L1 XhoI与NotI酶切泳道6pPICZaB-m58L1 XhoI与XbaI酶切泳道7pPICZaB-m6L1 XhoI与XbaI酶切图2、为三种重组酵母细胞分泌上清中L1蛋白的表达，其中泳道1HPV6L1重组酵母细胞发酵上清；泳道2HPV16L1重组酵母细胞发酵上清；泳道3HPV58L1重组酵母细胞发酵上清；泳道4标准蛋白分子量图3、为纯化的L1蛋白的SDS-PAGE鉴定结果。其中泳道1标准蛋白分子量标记；泳道2纯化的HPV6L1蛋白；泳道3纯化的HPV16L1蛋白；泳道4纯化的HPV58L1蛋白；图4、为纯化的HPV6L1蛋白的Western印迹鉴定结果。其中泳道1标准蛋白分子量标记；泳道2纯化的HPV6L1蛋白。
图5、为纯化的HPV16L1蛋白的Western印迹鉴定结果。其中泳道1标准蛋白分子量标记；泳道2纯化的HPV16L1蛋白。
图6、为纯化的HPV58L1蛋白的Western印迹鉴定结果。其中泳道1标准蛋白分子量标记；泳道2纯化的58L1蛋白。
图7、为HPV6L1蛋白自组装病毒样颗粒的电镜结果。
图8、为HPV16L1蛋白自组装病毒样颗粒的电镜结果。
图9、为HPV58L1蛋白自组装病毒样颗粒的电镜结果。
具体实施例方式
宫颈癌病理标本由四川省肿瘤医院妇瘤科提供；大肠杆菌TOP10菌株由吉林大学疫苗研究中心保存；pPICZαB和PGEM-T-easy分别购于美国Invitrogen公司和promega公司；DNA聚合酶、各种限制性内切酶和T4DNA连接酶购自Takara公司；DEAE-SepharoseTMFast Flow阴离子层析介质购自Pharmacia公司。1kb DNA marker购于美国NEB公司。RNaseA核酸酶、proteinaseK、酵母基因组提取试剂盒，购于美国Promega公司。兔源性抗HPV6 L1多克隆抗体和兔源性抗HPV58L1抗体由本实验室制备，鼠源性抗HPV16 L1camvir-1抗体，购于BIODESIGN公司。PCR引物由上海生工生物技术公司合成。Mini protean3 cell型蛋白质电泳仪，TRANS-BLOTSDSEMI-DRY TRAN SFER CELL型蛋白转膜仪(BIO-RAD公司)，凝胶成像系统GelDoc2000(BIO-RAD公司)；实施例1 HPV6L1、HPV16L1 HPV58L1、编码序列的获得1、以宫颈癌病理组织基因组为模板，用如下引物，按常规PCR方法扩增HPV6、16、58L1序列。
HPV6上游引物5′CTCGAGAAAAGAATGTGGCGGCCTAGCG3HPV6下游引物5′TTACCTTTTAGTTTTGGC3′HPV16上游引物5’CTCgAgAAAAgAATgTCTCTTTggCTgCCT3’
HPV16下游引物5′TTACAgCTTACgTTTTTTgC3′。
HPV58上游引物5′CTCgAgAAAAgAATggTgCTgATTTTATgT3′HPV58下游引物5′TTATTTTTTAACCTTTTTg3′利用引物引入XhoI酶切位点和提高分泌的序列AAAAgA。
2、应用聚合酶链反应(PCR)合成法，根据毕赤酵母密码子的偏爱性，合成HPV6L1、HPV16L1和HPV58L1基因，并引入XhoI酶切位点和提高分泌的序列AAAAgA，合成的L1基因记为m6L1、m16L1、m58L1。
实施例2 重组毕赤酵母的获得1、重组酵母整合质粒(pPICZαB-6L1和pPICZαB-m6L1)的构建利用实施例1中获得的PCR产物分别与T-easy连接，并转化TOP10，经碱裂解法提取T-HPV6L1和T-HPVm6L1质粒，用XhoI与Not I双酶切质粒，利用琼脂糖电泳回收试剂盒回收HPV-6L1和m6L1基因片段，与同样酶切的pPICZαB载体(Invitrogen公司)连接并转化TOP10菌株，用含zeocin抗性的LB平板筛选，得到阳性克隆，小量提取质粒，经酶切电泳鉴定，获得的重组酵母细胞整合质粒命名为pPICZαB-6LI和pPICZαB-m6L1。酶切电泳鉴定结果见图1，酶切结果均与预期相符。测序结果进一步证实正确。
2、重组酵母整合质粒(pPICZαB-16L1和pPICZαB-m16L1)的构建利用实施例1中获得的PCR产物分别与T-easy连接，并转化TOP10，经碱裂解法提取T-HPV16L1和T-HPVm16L1质粒，分别用XhoI与XbaI和XhoI与Not I双酶切质粒，利用琼脂糖电泳回收试剂盒回收HPV-16L1和m16L1基因片段，与同样酶切的pPICZαB载体(Invitrogen公司)连接并转化TOP10菌株，用含zeocin抗性的LB平板筛选，得到阳性克隆，小量提取质粒，经酶切电泳鉴定，获得的重组酵母细胞整合质粒命名为pPICZαB-16L1和pPICZαB-m16L1。酶切电泳鉴定结果见图1，酶切结果均与预期相符。测序结果进一步证实正确。
3、重组酵母整合质粒(pPICZαB-58L1和pPICZαB-m58L1)的构建利用实施例1中获得的PCR产物分别与T-easy连接，并转化TOP10，经碱裂解法提取T-HPV58L1和T-HPVm58L1质粒，用XhoI与Not I双酶切质粒，利用琼脂糖电泳回收试剂盒回收HPV-58L1和m58L1基因片段，与同样酶切的pPICZαB载体(Invitrogen公司)连接并转化TOP10菌株，用含zeocin抗性的LB平板筛选，得到阳性克隆，小量提取质粒，经酶切电泳鉴定，获得的重组酵母细胞整合质粒命名为pPICZαB-58Ll和pPICZαB-m58L1。酶切电泳鉴定结果见图1，酶切结果均与预期相符。测序结果进一步证实正确。
4、获得表达HPV6L1蛋白的重组毕赤酵母菌株将获得的表达质粒pPICZαB-6L1和pPICZαB-m6L1用SacI酶切后，用琼脂糖电泳回收试剂盒回收线性化pPICZαB-6L1和pPICZαB-m6L1，定量后取0.2μg线性质粒在电转化仪上于1.5kv，25μF，200Ω条件下转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，并将转化后的酵母菌涂于含zeocin抗性的MDH平板筛选，于30℃培养，至有转化子长出(大约3～7天)。zeocin抗性梯度筛选高拷贝转化子，zeocin浓度分别为100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml，得到的高拷贝转化子。
5、获得表达HPV16L1蛋白的重组毕赤酵母菌株将获得的表达质粒pPICZαB-16L1和pPICZαB-m16L1用SacI酶切后，用琼脂糖电泳回收试剂盒回收线性化pPICZαB-16L1和pPICZαB-m16L1，定量后取0.2μg线性质粒在电转化仪上于1.5kv，25μF，200Ω条件下转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，并将转化后的酵母菌涂于含zeocin抗性的MDH平板筛选，于30℃培养，至有转化子长出(大约3～7天)。zeocin抗性梯度筛选高拷贝转化子，zeocin浓度分别为100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml，得到的高拷贝转化子。
6、获得表达HPV58L1蛋白的重组毕赤酵母菌株将获得的表达质粒pPICZαB-58L1和pPICZαB-m58L1用SacI酶切后，用琼脂糖电泳回收试剂盒回收线性化pPICZαB-58L1和pPICZαB-m58Ll，定量后取0.2μg线性质粒在电转化仪上于1.5kv，25μF，200Ω条件下转化Pichia pastoris GS115感受态细胞，并将转化后的酵母菌涂于含zeocin抗性的MDH平板筛选，于30℃培养，至有转化子长出(大约3～7天)。zeocin抗性梯度筛选高拷贝转化子，zeocin浓度分别为100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml，得到的高拷贝转化子。
实施例3 HPV6、16和58L1蛋白在重组酵母中的分泌表达1、诱导表达 分为两个阶段，第一是生长阶段，此阶段以甘油为碳源，进行菌体积累，没有目的蛋白的表达。第二是诱导表达阶段，此阶段以甲醇为唯一碳源，菌体增长缓慢，目的蛋白在甲醇诱导下进行分泌表达。培养过程从YPD平板挑取新鲜单菌落接入含30mLBMGY的摇瓶，摇床培养24h作为种子液，吸取1.3mL接入含40mLBMGY的250mL摇瓶进入生长阶段，摇床培养24h，室温离心(6000r/min 6min)，菌体用15mL BMMY悬浮，重新放入摇床培养进入诱导阶段。每24h补1％甲醇(培养条件均为30℃、300rpm)。诱导60小时左右，收获培养物，4000rpm、30分钟，收集上清。
2、目的蛋白的检测 进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，凝胶用考马斯亮兰R250染色，蛋白电泳凝胶经染色、扫描后，用图像处理软件分析特异条带对应蛋白质的分子量、相对含量及占细胞总蛋白百分比。将收获发酵液上清进行SDS-PAGE电泳(见图2)，结果显示重组酵母所表达的L1分子量约为56kD左右。
实施例4 HPV6、16和58L1VLP的制备与鉴定1.重组酵母的发酵按实例3中的发酵方法进行发酵。
2.HPV6、16和58L1 VLP的制备发酵上清(1000mL)加50％饱和硫酸铵沉淀蛋白。室温放置3天，4000rpm水平转头离心，30分钟。用PBS 85ml重溶沉淀。在经10000rpm、15分钟离心，收上清进行DEAE层析。上样量800ml，样品加20mM的PBS溶液稀释(1∶8)。预处理柱，用20mMPBS平衡7个柱体积，上样量达800ml，速度为40，灵敏度为0.1，电压200。用0.3mol/LNaCl 20mMPBS洗至基线，用0.4mol/LNaCl 20mMPBS解析蛋白，所收峰用截留分子量10K的超滤器超滤，用DPBS-Mg洗蛋白，终体积为10ml，SDS-PAGE电泳鉴定(见图3)和Westernblot鉴定(见图4、5、6)。上清加于450g/L蔗糖-0.85mol/LNaCl DPBS垫层的离心管上部，4℃、27500rpm(100000g，BACKMAN SW-28转头)离心240min；弃上清，沉淀加1ml 0.85mol/LNaCl DPBS，收获蛋白-70℃保存。
3、表达产物VLP的鉴定发酵上清经纯化，得到VLP，经2％磷钨酸负染，电镜观察VLP形态(见图7、8、9)。VLP为圆形，直径约55～60nm。
权利要求
1.一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，所述方法包括如下步骤(a)分别将编码所述人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；(b)利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中编码人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因包括从感染人乳头瘤病毒的病理组织中提取的L1基因。
3.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中编码人乳头瘤病毒晚期蛋白(L1)的基因还包括根据酵母偏爱密码子进行基因修饰的L1基因。
4.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中所述人乳头瘤病毒为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18或HPV58型别。
5.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中(a)所用的宿主酵母菌为毕赤酵母GS115、KM71、SMD1168或SMD1168H菌株。
6.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，其中(a)步骤所用表达载体为pPICZαB，也可用其他分泌表达载体如pPIC9K。
7.根据权利要求1所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒方法，其中(b)步骤纯化L1蛋白时至少应用一步层析过程。
8.根据权利要求7所述的制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒方法，其中一步层析包括DEAE阴离子交换柱层析。
全文摘要
本发明涉及一种制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，属于生物技术领域。所述方法包括如下步骤分别将编码所述人乳头瘤病毒晚期蛋白的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒。优点1)分泌表达L1，所得L1蛋白可自组装成VLPs。2)表达产物自组装形成的病毒样颗粒具有与天然相似的结构，能自组装成病毒样颗粒，所形成的病毒样颗粒均一性较好。3)酵母细胞可实现大规模发酵，L1蛋白分泌到发酵上清中，纯化工艺相对简单、成本低，适合于规模生产。
文档编号C07K1/14GK1869215SQ200610016859
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月19日 优先权日2006年5月19日
发明者刘大维, 孔维, 姜春来 申请人:长春高新百克药物研究院有限公司