专利名称：一种生产乙肝和丙肝病毒PreS－E1－E2疫苗的酵母菌株及制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及一种酵母工程菌株，同时涉及工程菌株的制备方法。该菌株可以产生乙型、丙型肝炎病毒的PreS-E1-E2融合抗原，用该抗原作疫苗免疫试验动物能诱导动物同时产生抗乙肝病毒和抗丙肝病毒抗体，能有效预防乙型和丙型肝炎。
背景技术：
病毒性肝炎(viral hepatitis)是世界上流行广泛、危害极大的传染病，其中以乙型肝炎(hepatitis B)和丙型肝炎(hepatitis C)危害最大，它们均可转变成慢性持续性感染，并进一步导致肝坏死、肝硬化和肝癌。目前对乙肝和丙肝均无特别有效的治疗药物和治疗手段，因此对这两种疾病的预防具有重要意义。国内外都在积极开展乙肝和丙肝疫苗的研究和开发，目前国内外已有第二代乙型肝炎疫苗用于预防乙型肝炎，而丙型肝炎还没有疫苗产品。
第一代乙肝疫苗为血源疫苗，来源于乙肝病人血清中的22nm的粒子，这种粒子不含乙肝病毒DNA，只含表面抗原和脂质，具有很强的免疫原性，免疫效果也最好；但血源疫苗受到来源、安全性等限制，难以满足普遍接种的需要，而且更重要的是产品容易受到血清中存在的各种病毒如艾滋病、丙肝病毒等污染，目前国内已经禁止使用血源来源的乙肝疫苗。第二代乙肝疫苗为基因工程蛋白疫苗，是用酵母或哺乳动物细胞表达的乙肝病毒表面抗原主蛋白(HBsAg，S蛋白)。S蛋白疫苗在预防乙肝传播方面发挥了重要作用，但仍有不足，在免疫试验区仍有少数免疫过的儿童感染乙肝，大约有10-20％的接种人群对S蛋白疫苗无反应或低反应，不能产生足够的保护作用。因此，进一步提高疫苗的免疫原性和加强免疫保护性非常必要。目前国内外正在积极进行第三代乙肝疫苗的研究开发，主要目标是乙型肝炎病毒的大表面抗原(LP)，即全长的PreS抗原(PreS1+PreS2+S)。目前已有研究证实PreS蛋白可以获得比S蛋白更为全面和持久的免疫效果。乙型肝炎基因组的S区有3-4个翻译起始点，分别编码表面抗原主蛋白(S蛋白)、中蛋白(MP蛋白)和大蛋白(LP，全长PreS蛋白)，S蛋白是其中最小的蛋白，中蛋白MP为S蛋白N端加上55aa的PreS2，大蛋白PreS为中蛋白N端加上108aa的PreS1。S蛋白是乙肝病毒外壳和22nm表面抗原颗粒的主要成分，占70-80％。MP和LP(PreS蛋白)主要存在于乙肝病毒颗粒中，并暴露于颗粒表面。三种蛋白均具有很强的免疫原性。近年的研究表明，PreS蛋白虽然在HBV粒子中的含量很少，远不及S蛋白，但具有非常强的免疫原性，PreS蛋白的N端，即PreS1部分，是暴露于病毒颗粒表面的，具有极强的免疫原性，有文献报道，单独使用PreS1肽段即能起免疫保护作用。J.Le.Seyee等人(1999)证实PreS1的第3-77aa影响乙型肝炎的感染力。PreS1还参与乙肝吸附和进入细胞过程，还可能与病毒装配和分泌有关，大量研究结果已经证实PreS1区24-47位氨基酸与肝细胞受体结合，用含这段氨基酸序列的合成肽段免疫黑猩猩，即能产生中和抗体，起到完全的保护作用。PreS2蛋白的C端与S蛋白相连形成MP，PreS2也是暴露于HBV囊膜外层的，其上具有多聚人血清白蛋白(Polymenized HumanSerum Albumin，PHSA)的受体(PHSA-R)，能与PHSA结合。由于肝细胞表面也有PHSA-R，HBV能通过血循环中存在的PHSA的介导，吸附到肝细胞表面。PreS2有良好的免疫原性，能刺激机体产生相应抗体-抗PreS2。此抗体出现于急性感染恢复早期，比抗S抗体出现早而维持时间与抗S抗体一样。抗PreS2亦具有中和作用，可作为机体康复的指标之一。PreS蛋白实际上是PreS1+PreS2+S蛋白，理论上集中PreS1，PreS2和S蛋白的免疫原性，大量的研究结果亦表明PreS蛋白的免疫原性和免疫保护性比S蛋白强。目前，PreS疫苗还处于研究阶段，国际上还没有产品进入市场。
丙型肝炎病毒从上世纪90年代初开始大量研究。由于丙型肝炎基因的易变性，加上没有实用的动物模型以及长期缺乏有效的细胞系统，至今在国内外还没有丙肝疫苗产品。不过，近年来的研究表明HCV疫苗开发具有可行性，主要目标还是HCV的包膜蛋白E1和E2。其中，E2负责与细胞表面受体结合而使HCV病毒附着细胞表面，而E1参与细胞膜溶解和病毒进入细胞过程。最近通过对E2蛋白的研究，表明E2蛋白作为HCV工程蛋白疫苗非常有前途，这些新发现主要有以下几个方面(1)E2蛋白的高变区1(HVR1)缺失的突变株接种黑猩猩仍然可造成急性和慢性感染，证实HVR1起码是感染非必需的，其缺失不影响E2的构象，也不影响E2与受体的结合。(2)E2蛋白HVR1区的变异不是随机的，不同株的HVR1的一些氨基酸是保守的，HVR1的构象和电荷是一样的。(3)E2蛋白的614-622aa区和489-498aa区是CTL表位，可以很好地诱导CTL反应，这两个区域是在保守区内的。(4)CD81已经公认是肝细胞表面的丙肝病毒受体之一，E2蛋白的480-493aa区和544-551aa区可以与CD81结合，参与病毒-细胞间的吸附过程，这些区域是相对保守的，针对这两段的抗体具有中和性。(5)用HCV1a型病毒缺损的RNA基因组免疫黑猩猩，能产生交叉保护，可使黑猩猩抵抗HCV1a和1b型病毒攻击。同时，针对E1蛋白的研究结果也令人鼓舞，作为负责病毒-细胞融合和病毒进入的蛋白，E1蛋白也存在两个抗原性很强的抗原表位(210-223aa区和288-329aa区)，同时，在部分自动康复病人发现具有较高水平的E1抗体，但在慢性丙肝病人中Core、NS3抗体的水平高，而E1的水平低，表明E1抗体极有可能具有保护性。因此，在研究HCV工程蛋白疫苗时，应当将E2蛋白和E1蛋白结合起来考虑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产乙型肝炎病毒PreS蛋白和丙型肝炎病毒E1-E2蛋白的融合抗原PreS-E1-E2疫苗的酵母工程菌株。该工程菌株可以生产PreS-E1-E2融合抗原，用该抗原作疫苗免疫试验动物能诱导动物同时产生抗乙肝病毒和抗丙肝病毒抗体，能有效预防乙型和丙型肝炎。融合蛋白中的PreS蛋白包含PreS1、PreS2和S三个区域，与乙型肝炎现有的S疫苗(主要成分为HBsAg)相比，PreS蛋白含有更多的抗原表位，PreS2中120-145位氨基酸还含有能中和病毒的抗原决定簇，并且PreS1(21-47位氨基酸)是病毒与肝细胞受体的结合位点，因此PreS蛋白比S蛋白具有更强的免疫原性；为了融合蛋白在酵母菌株中顺利表达，融合蛋白中的HCV E1蛋白缺失C末端43aa的高疏水区域，E2蛋白缺失C末端53aa的高疏水区域，该融合蛋白仍保留了HCV E1和E2的重要抗原表位编码区。
本发明的另一个目的在于制备肝炎病毒的Pres-E1-E2融合抗原的酵母工程菌株的方法，方法简便，易于分离纯化，适用于工业化大生产。
本发明是在多年研究HBV PreS基因和HCV E1、E2基因的基础上，把HBV的PreS蛋白和HCV的E1、E2蛋白进行融合表达，构建PreS-E1-E2融合基因克隆。此融合基因同时含有HBV和HCV的重要抗原表位的编码区，表达的基因工程蛋白可同时诱导机体产生抗HBV和抗HCV的抗体，作为疫苗有望同时预防乙型和丙型肝炎。
酵母表达系统用于表达外源基因，经过十几年的发展已经相当完备。酵母作为单细胞真核生物，具有生长快速、培养基廉价、操作简便的特点，并可实现外源蛋白的分泌表达，使纯化工艺简化，同时酵母表达系统也可对表达的外源蛋白进行翻译后修饰，使之更接近于天然状态。近年来甲醇营养型酵母(Methy-lotrophicyeast)表达系统，主要是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，以其高稳定、高表达、高分泌等特点得到广泛利用。本发明涉及一种能表达PreS-E1-E2融合抗原的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2及其制备方法。
该酵母工程菌株命名为巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastorisSMD1168/PreS-E1-E2，菌株已提交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2006年7月19日，保藏编号为CCTCC NOM206069.分类命名巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2，工程菌株巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2。该酵母菌株染色体上整合有HBV和HCV的PreS-E1-E2融合基因序列。巴斯德毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2的构建流程如图1所示，将HBV的PreS基因和HCV的E1、E2基因序列分别用PCR方法进行扩增，经过图1所示步骤相互连接，插入到载体质粒pPIC9K(购自invitrogen公司)中获得重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2。该酶切质粒通过酶切线性化后，采用电转法转入巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168(购自invitrogen公司)中，经过MD-G418筛选得到巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2。巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2由以下步骤制备1.HBV PreS基因、HCV E1、E2基因的获得采用PCR方法扩增PreS基因、HCV E1、E2基因。各基因的引物序列如下a.PreS正向引物5’GAATTCTACGTAATGGGAGGTTGGTC 3’(BamH I，SnaB I)b.PreS反向引物5’CTGCAGAGATCTAATTCAAATGTATACCCAAAG 3’(Pst I，Bgl II)c.E1正向引物5’AGATCTGTGCCCGCTTCAGCC3’(Bgl II)d.E1反向引物5’CTGCAGGTCCATGATGGCTTG 3’(Pst I)e.E2正向引物5’CTGCAGGCGGAAACCCACGTC 3’(Pst I)f.E2反向引物5’AAGCTTGCGGCCGCTACACGTCCACAATGTT 3’(HindIII，Not I)用乙型肝炎病人阳性血清中提取的HBV基因组DNA作为模板，用引物a/b PCR扩增得到全长PreS基因，将PreS cDNA片段连接到到pMD18-T(购自TaKaRa公司)载体上，获得pMD18T-PreS质粒。
再利用引物c/d和e/f分别PCR扩增E1和E2基因，PCR扩增出的E1基因不含E1蛋白C末端43aa的编码序列，E2基因不含E2蛋白C末端53aa的编码序列，扩增的E1、E2基因片段，将两片段分别连接到pMD18-T载体上，用限制性内切酶Pst I和HindIII酶切，电泳回收，分别获得pMD18-T-E1和E2片段，将这两个片断连接得到pMD18T-E1E2质粒。
2.pPIC9K-PreS-E1-E2质粒的构建用Bgl II和Hind III双酶切pMD18T-PreS质粒和pMD18T-E1-E2质粒，电泳回收pMD18T-PreS载体线性片段和E1-E2 DNA片段，两片段连接获得pMD18T-PreS-E1-E2质粒，提取质粒进行酶切和PCR鉴定。再以PCR方法得到PreS-E1-E2片段，引物如下正向引物5’GAATTCTACGTAATGGGAGGTTGGTC 3’(BamH I，SnaB I)反向引物5’AAGCTTGCGGCCGCTACACGTCCACAATGTT 3’(HindIII，Not I)PCR得到的扩增片段和载体质粒pPIC9K均以SnaB I和Not I进行双酶切，电泳回收酶切产物，两片段连接获得重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2，SnaB I、NotI双酶切和PCR鉴定重组质粒。最终，重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2经过测序得以确定。序列为SEQIDNO1和SEQIDNO23.巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2的获得采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168菌株及筛选His+Mut+表型转化菌株。经Sal I酶切完全线性化后的pPIC9K-PreS-E1-E2，电转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168感受态细胞，经MD-G418平板筛选，获得抗高浓度(4mg/ml)G418的巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2。提取其酵母菌株的基因组DNA，PCR鉴定。
本发明获得的巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris SMD1168/PreS-E1-E2具有如下特点1.巴斯德毕赤酵母Pichia Pastoris SMD1168/PreS-E1-E2，基因工程菌株，菌体呈球形，菌落光滑，呈乳白色，最适生长温度29℃-30℃，代谢型为His+Mut+。
2.该菌株的基因组中含有HBV、HCV的PreS-E1-E2融合基因序列，经0.5％-1％甲醇诱导后可以分泌型表达PreS-E1-E2融合蛋白，分子量为140kD。表达产量在实验条件下可达20mg/L以上，并且具有良好的抗原性，因此该酵母菌株具有良好的生产应用价值。
本发明在于提供一种该酵母菌株生产PreS-E1-E2融合疫苗的发酵纯化工艺。利用本发明所提供的酵母菌株，发酵工艺简便，表达的PreS-E1-E2蛋白分泌到发酵液中，易于分离纯化，适于工业化大规模生产。
发酵所用培养基为BMGY和基本盐培养基，其中BMGY培养基为摇瓶种子培养基，含1％酵母抽提物，2％蛋白胨，100mM磷酸钾，1.34％YNB，1％甘油，pH6.0；基本盐培养基为发酵培养基，每升培养基中含有26.7ml85％磷酸，0.93g硫酸钙，18.2g硫酸钾，14.9g七水硫酸镁，4.13g氢氧化钾，40g甘油，发酵前用30％的氨水调pH5.0。
发酵流程为将巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2接种到BMGY液体培养基中，30℃培养24-28小时，转种至10倍体积的BMGY液体培养基中扩大培养，30℃培养至A6002.0-2.5，再接种到发酵罐(基本盐培养基)中，28℃培养，培养至菌体量为80mg/ml时补甘油2％，继续培养至溶解氧上升到20％以上，加入甲醇诱导，甲醇浓度维持在0.5％-1％。诱导表达72小时，离心收集上清。收集的上清液经过膜浓缩器进行脱盐和浓缩，再经过柱层析分离纯化得到PreS-E1-E2蛋白。
本发明的优点和效果利用本发明提供的菌株，分泌表达的PreS-E1-E2蛋白可以达到20mg/L以上。Western Blot表明该融合蛋白可以与乙肝病人血清、丙肝病人血清、E1抗体和E2抗体反应。ELISA检测也证明该蛋白可以和HBV和HCV阳性患者的血清发生反应。用PreS-E1-E2融合蛋白免疫家兔，在初次免疫后2-3周，即能产生的针对PreS、E1、E2蛋白的IgG抗体，各抗体在第8-9周达到峰值，其中抗PreS抗体的滴度可达1∶3500，抗E1抗体的滴度可达1∶5400，抗E2抗体滴度可达1∶6400；在随后(第10-13周)各抗体仍维持在较高的水平。因此，本发明提供的PreS-E1-E2融合蛋白能同时产生抗HBV和HCV的两种抗体，并且免疫原性良好，作为疫苗可望有效同时预防或治疗乙肝和丙肝这两种病毒性疾病。
本发明的显著有点是培养一种工程菌株就能生产抗两种肝炎病毒的融合蛋白疫苗。具有产量高、容易提纯、成本低等优点。
图1.巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2的构建流程图将HBV的PreS基因和HCV的E1和E2基因分别用PCR方法进行扩增，经过如图的步骤相互连接，插入到载体质粒pPIC9K中获得重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2。该质粒通过酶切线性化后，采用电转法转入巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris SMD1168中，经过MD-G418筛选得到巴斯德毕赤酵母PichiaPastoris SMD1168/PreS-E1-E2。
图2.重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2的酶切和PCR鉴定(0.7％琼脂糖凝胶电泳)。
1.DNA分子量标识(Marker)(λ/HindIII)2.重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2的单酶切(SnaB I)鉴定结果，得到一条12kb的带。
3.重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2的双酶切(SnaB，Not I)鉴定结果，获得两条大小分别为9.3kb(pPIC9K载体)和2.7kb(PreS+E1+E2融合基因)的带。
4.PCR鉴定结果，得到单一的2.7kb的带图3巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2的PCR鉴定1.以巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2基因组为模板PCR产物，大小为2.7kb。
2.DNA分子量标识(Marker)(λ/HindIII)图4.巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2诱导表达PreS-E1-E2融合蛋白(10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测)及Western Blot检测
M.蛋白质分子量标识(Marker)1，3，5，7.阴性对照，含pPIC9K载体的巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastorisSMD1168酵母经过甲醇诱导后的上清。2，4，6，8.巴斯德毕赤酵母菌株Pichiapastoris SMD1168/PreS-E1-E2经过诱导后的上清。
1，2.10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。阴性对照出现66kD蛋白带，巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2除了66kD蛋白质带外，主要有140kD，70kD和40kD等三条蛋白质带。
3，4.用HBV的S蛋白抗体进行Western blot，阴性对照无带，巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2培养上清样品在140kD和40kD处出现阳性带。
5，6.用HCV的E1蛋白抗体进行Western blot阴性对照无带，巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2培养上清样品在140kD和70kD处出现阳性带。
7，8.用HCV的E2蛋白抗体进行Western blot阴性对照无带，巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2培养上清样品在140kD和70kD处出现阳性带。
图5PreS-E1-E2融合蛋白免疫家兔的抗体产生情况用融合抗原免疫家兔，初次免疫后2-3周，即能产生的针对PreS、E1、E2蛋白的IgG抗体，各抗体在第8-9周达到峰值，其中抗PreS抗体的滴度可达1∶3500，抗E1抗体的滴度可达1∶5400，抗E2抗体滴度可达1∶6400；在随后(第10-13周)各抗体仍维持在较高的水平；就各蛋白而言，在免疫的整个阶段，抗体产生水平的高低依次为E2抗体＞E1抗体＞PreS抗体。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。实施例中的实验方法，按常规条件进行，参考如萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》(第三版，2002年，科学出版社)中所述实验方法。
1.HBV全长PreS基因的PCR扩增根据HBV标准株序列设计引物a.正向引物5’GAATTCTACGTAATGGGAGGTTGGTC 3’(BamH I，SnaB I)b.反向引物5’CTGCAGAGATCTAATGTATACCCAAAG 3’(Pst I，Bgl II)从乙型肝炎病人阳性血清中提取HBV基因组DNA，以之作为模板，用引物a/b进行PCR扩增，得到全长PreS基因。将PreS cDNA片段连接到pMD18-T载体上，获得pMD18T-PreS质粒，转化E.coli DH5α感受态细胞(感受态细胞制备参照《分子克隆实验指南》中CaCl2法进行)，在含Amp的LB培养基平板上筛选阳性克隆。筛出的阳性克隆用测序进行确定。测序结果证实本发明所克隆的DNA片段为HBV PreS基因，全长1206bp，基因型为Adr亚型。
2.HCV的E1和E2基因的PCR扩增E1的引物为c.正向引物5’AGATCTGTGCCCGCTTCAGCC3’(Bgl II)d.反向引物5’CTGCAGGTCCATGATGGCTTG 3’(Pst I)
E2的引物为e.正向引物5’CTGCAGGCGGAAACCCACGTC 3’(Pst I)f.反向引物5’AAGCTTGCGGCCGCTACACGTCCACAATGTT 3’(HindIII，Not I)利用引物c/d PCR扩增出的E1基因不含E1蛋白C末端43aa的编码序列，用引物e/f PCR扩增出的E2基因不含E2蛋白C末端53aa的编码序列。扩增的E1、E2基因片段分别连接到pMD18-T载体上，分别获得pMD18-T-E1和pMD18-T-E2，再分别用限制性内切酶Pst I和HindIII酶切，电泳回收获得pMD18-T-E1片断和E2片断，再用T4 DNA连接酶16℃连接16小时，获得pMD18T-E1E2质粒，转化E.coli DH5α感受态细胞，在含Amp的LB培养基平板上筛选阳性克隆，重组质粒经过测序确定。
3.pPIC9K-PreS-E1-E2质粒的构建碱裂解法提取pMD18T-PreS质粒和pMD18T-E1E2质粒，各用Bgl II和HindIII进行双酶切，电泳回收pMD18T-PreS载体线性片段和E1-E2 cDNA片段，用T4 DNA连接酶16℃连接16小时，转化E.coli DH5α感受态细胞，在含Amp的LB平板上筛选阳性克隆，获得pMD18T-PreS-E1-E2质粒，提取质粒进行酶切和PCR鉴定。再以PCR方法得到PreS-E1-E2片段，引物如下正向引物5’GAATTCTACGTAATGGGAGGTTGGTC 3’(BamH I，SnaB I)反向引物5’AAGCTTGCGGCCGCTACACGTCCACAATGTT 3’(HindIII，Not I)PCR得到的扩增片段和载体质粒pPIC9K均以SnaB I和Not I进行双酶切，电泳回收酶切产物，T4 DNA连接酶16℃连接16小时，转化E.coli DH5a感受态细胞，在含Amp和Kan的LB平板上筛选阳性克隆。图2是重组质粒的双酶切和PCR鉴定结果。用SnaB I和Not I进行双酶切鉴定，获得两条大小分别为9.3kb(pPIC9K载体)和2.7kb(PreS-E1-E2基因)的带，以pPIC9K-PreS-E1-E2质粒为模板进行PCR，得到单一的2.7kb的带，以上结果与预期相符。最终，重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2经过测序确定。
4.巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2的获得采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌株Pichia Pastoris SMD1168菌株后，筛选His+Mut+表型转化菌株。经Sal I酶切完全线性化后的pPIC9K-PreS-E1-E2，电转化巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168感受态细胞，转化条件0.5mm电转杯，电压1500V，电容50uF，时间10ms，电转结束后，立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，混匀，取0.5mL涂布在组氨酸缺陷的MD平板上28℃培养4天，挑取单菌落，再用0.5-4mg/ml的G418筛选获得抗高浓度G418的酵母菌株，提取其基因组用5’AOX1和3’AOX1引物进行PCR鉴定。
5’AOX1引物5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’3’AOX1引物5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’PCR扩增结果见图3，得到了预期的2.7kb的带。
5.巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2发酵和PreS-E1-E2融合蛋白的诱导表达所构建的表达菌株巴斯德毕赤酵母菌株Pichiapastoris SMD1168/PreS-E1-E2和用载体质粒pPIC9K转化的巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/pPIC9K菌株(阴性对照)分别在50mLBMGY液体培养基中，28℃摇床培养至A600值4～5。离心收集菌体，重悬于含100mL基本盐培养基中。28℃0.5％-1％甲醇诱导表达72小时，离心收集上清，待检测。
SDS-PAGE凝胶电泳鉴定表达产物诱导表达后的培养液上清经超滤膜脱盐并浓缩45倍后，加入等体积蛋白质样品处理液，100℃水浴10min后取20μL加样电泳。聚丙烯酰胺凝胶浓度为10％。SDS-PAGE结果见图4，对照组出现了66kD的蛋白带，在试验组中，除了在66kD处出现了对照组也出现的蛋白质带外，在140KD、70KD、40KD处有三条主要的蛋白质带。分别以E1和E2兔抗血清进行Western Blot，在140KD、70KD处的蛋白质带都呈阳性反应。以HBV的S蛋白抗体进行Western Blot，在140KD、40KD处的蛋白质带呈阳性反应。以上结果说明表达的140kD蛋白带就是PreS-E1-E2融合蛋白，PreS-E1-E2融合基因大小为2.7kb，在不考虑蛋白质糖基化的条件下，预计编码蛋白质大小为100kD左右，但多种文献报道，当HCV的E1、E2蛋白质在外源表达系统中表达时，经常出现糖基化，从而使蛋白质分子量发生增加。此外，在70kD处和40kD处出现的Western blot阳性带，说明该菌株表达的融合蛋白有部分被酵母的蛋白酶切割。
140KD蛋白可经G150柱和Q-S-FF柱进一步纯化。该140KD蛋白在原发酵培养液上清中浓度为约20mg/L。
6.PreS-E2-E2融合蛋白的ELISA检测取2μL纯化的PreS-E1-E2融合蛋白，加20μL5×碳酸盐缓冲液(每升中含Na2CO37.95gNaHCO314.65g)包被一孔酶标反应板，4℃过夜，5％脱脂牛奶37℃封闭2小时。分别以乙型肝炎病人阳性血清，丙型肝炎阳性血清以及正常人血清(阴性血清)作为一抗；二抗为1/1000辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。阴性对照用巴斯德毕赤酵母菌株Pichiapastoris SMD1168/pPIC9K诱导上清的浓缩液。以P/N值＞2为阳性，OPD显色10分钟后加50μL 2mol/L H2SO4中止反应，酶标仪测定OD492值。结果见表1，PreS-E1-E2融合蛋白与HBV阳性血清和HCV阳性血清ELISA的P/N值分别达到12.3和13.5，显示出本发明的PreS-E1-E2融合蛋白具有HBV和HCV两种抗原性质，且与HBV患者和HCV患者血清都能起强烈反应。
7.PreS-E1-E2免疫实验动物研究用无菌生理盐水稀释纯化的PreS-E1-E2蛋白，调整为1μg/μl，并按照20ug/ml的剂量加入佐剂Al(OH)3，作为免疫实验动物的样品。实验动物为体重2～2.5Kg昆明种纯系兔，第一组两只注射PreS-E1-E2蛋白，第二组两只注射生理盐水作为阴性对照。在兔子左右后肢皮下和背脊部位皮下多点注射，第一次免疫14天后加强免疫一次，第21天再加强免疫一次，共免疫3次，免疫剂量为0.5mg/只次。在初次免疫后第七天开始对免疫兔进行耳静脉取血，以后每周定期取血，每次每只采血1ml左右。
抗体产生情况及其滴度水平用ELISA方法检测分别用PreS蛋白，E1蛋白和E2蛋白包被酶标反应板，以免疫兔的抗血清作为一抗；二抗为1/1000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，分别检测免疫兔血清中PreS抗体，E1抗体和E2抗体的产生情况和滴度。血清抗体阳转的阈值定为阴性对照血清读数的平均值乘2，高于上述阈值读数的最高稀释度，即为该血清的滴度。
结果见图5，用融合抗原免疫家兔，初次免疫后2-3周，即能检测到针对PreS、E1、E2蛋白的IgG抗体，各抗体在第8-9周达到峰值，其中抗PreS抗体的滴度可达1∶3500，抗E1抗体的滴度可达1∶5400，抗E2抗体滴度可达1∶6400；在随后(第10-13周)各抗体仍维持在较高的水平；产生抗体的水平高低顺序依次为E2抗体＞E1抗体＞PreS抗体。以上结果表明PreS-E1-E2具有HBV和HCV的两种免疫性质，且免疫原性良好，作为疫苗能可望同时预防乙肝和丙肝这两种病毒性疾病。
表1PreS-E1-E2融合蛋白的EILSA检测用4份乙肝病人血清(抗体阳性)和4份丙肝病人血清(抗体阳性)，以及4份健康人血清(抗体阴性对照)对PreS-E1-E2融合蛋白进行ELISA检测。阴性对照用SMD1168/pPIC9K诱导上清的浓缩液。检测结果显示丙肝血清检测的P/N值达到13.5，乙肝血清检测的P/N值达到12.3，显示出本发明的PreS-E1-E2融合蛋白具有HBV和HCV两种抗原性质，且免疫原性良好。
表1PreS-E1-E2融合蛋白的ELISA检测结果(OD492)
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>一种表达乙型、丙型肝炎病毒PreS-E1-E2融合抗原的酵母工程菌株及制备方法<130>一种表达乙型、丙型肝炎病毒PreS-E1-E2融合抗原的酵母工程菌株及制备方法<160>PreS-E1-E2<170>PatentIn version3.1<210>1<211>1206<212>DNA<213>hepatitis B virus<400>PreSequenceStringtacgtaatgg gaggttggtc ttccaaacct cgacaaggca tggggacaaa tctttctgtt 60cccaatcctc tgggattctt tcccgatcac cagttggacc ctgcgttcgg agccaattca 120aacaatccag attgggactt caaccccaac aaggatcact ggccagaggc aaatcaggta 180ggagcgggag cattcgggcc agggttcacc ccaccacacg gaggtctttt ggggtggagc 240cctcaggctc agggcatatt gacaacagtg ccagtagccc ctcctcctgc ctccaccaat 300cggcagtcag gaagacagcc tactcccatc tctccacctc taagagacag tcatcctcag 360gccatgcagt ggaactccac aacattccac caagctctgc tagaccccag agtgaggggc 420ctatactttc ctgctggtgg ctccagttcc ggaacagtaa accctgttcc gactactgcc 480tcacccatat cgtcaatctt ctcgaggact ggggaccctg caccgaacat ggagaacaca 540acatcaggat tcctaggacc cctgctcgtg ttacaggcgg ggtttttctt gttgacaaga 600atcctcacaa taccacagag tctagactcg tggtggactt ctctcaattt tctaggggga 660gcacccacgt gtcctggcca aaattcgcag tccccaacct ccaatcactc accaacctct 720tgtcctccaa tttgtcctgg ctatcgttgg atgtgtctgc ggcgttttat catattcctc 780ttcatcctgc tgctatgcct catcttcttg ttggttcttc tggactacca aggtatgttg 840cccgtttgtc ctctacttcc aggaacatca actaccagca cgggaccatg caagacctgc 900acgattcctg ctcaaggaac ctctatgttt ccctcttgtt gctgtacaaa accttcggac 960ggaaactgca cttgtattcc catcccatca tcctgggctt tcgcaagatt cctatgggag1020tgggcctcag tccgtttctc ctggctcagt ttactagtgc catttgttca gtggttcgta1080gggctttccc ccactgtttg gctttcagtt atatggatga tgtggtattg ggggccaagt1140ctgtacaaca tcttgagtcc ctttttacct ctattaccaa ttttcttttg tctttgggta1200tacatt 1206<210>2<211>1449<212>DNA<213>hepatitis C virus
<400>PreSequenceStringagatctgtgc ccgcttcagc ctaccaagtg cgcaattcct cggggcttta ccatgtcacc 60aatgattgcc ctaattcgag tattgtgtac gaggcggccg atgccatcct gcacactccg 120gggtgtgtcc cttgcgttcg cgagggtaac gcctcgaggt gttgggtggc ggtgaccccc 180acggtggcca ccagggacgg caaactcccc acaacgcagc ttcgacgtca tatcgatctg 240cttgtcggga gcgccaccct ctgctcagcc ctctacgtgg gggacctgtg cgggtctgtt 300tttcttgttg gtcaactgtt taccttctct cccaggcgcc actggacgac gcaaagctgc 360aattgttcta tctatcccgg ccatataacg ggtcatcgca tggcatggga tatgatgatg 420aactggtccc ctacggcagc gttggtggta gctcagctgc tccggatccc acaagccatc 480atggacctgc aggtcgacgc ggaaacccac gtcaccgggg gaagtgccgg ccacaccacg 540gctgggcttg ttggtctcct tacaccaggc gccaagcaga acatccaact gatcaacacc 600aacggcagtt ggcacatcaa tagcacggcc ttgaactgca acgatagcct taccaccggc 660tggttagcag ggctcttcta tcgccacaaa ttcaactctt caggctgtcc tgagaggttg 720gccagctgcc gacgccttac cgattttgcc cagggctggg gtcccatcag ttatgccaac 780ggaagtggcc ttgacgaacg cccctactgt tggcactacc ctccaagacc ttgtggcatt 840gtgcccgcaa agagcgtgtg tggcccggta tattgcttca ctcccagccc cgtggtggtg 900ggaacgaccg acaggtcggg cgcgcctacc tacagctggg gtgcaaatga tacggatgtc 960ttcgtcctta acaacaccag gccaccgctg ggcaattggt tcggttgtac ctggatgaac1020tcaactggat tcaccaaagt gtgcggagcg cccccttgtg tcatcggagg ggtgggcaac1080aacaccttgc tctgccccac tgattgcttc cgcaaacatc cggaagccac atactctcgg1140tgcggctccg gtccctggat tacacccagg tgcatggtcg actacccgta taggctttgg1200cactatcctt gtactatcaa ttacaccata ttcaaagtca ggatgtacgt gggaggggtc1260gagcacaggc tggaagcggc ctgcaactgg acgcggggcg aacgctgtga tctggaagac1320agggacaggt ccgagctcag cccattgctg ctgtccacca cacagtggca ggtccttccg1380tgttctttca cgaccctgcc agccttgtcc accggcctca tccacctcca ccagaacatt1440gtggacgtg1449
权利要求
1.一种生产乙型肝炎病毒PreS蛋白和丙型肝炎病毒E1-E2蛋白的融合抗原PreS-E1-E2疫苗的酵母工程菌株，其特征在于巴斯德毕赤酵母菌株Pichiapastoris SMD 1168/PreS-E1-E2，CCTCC NOM206069。
2.根据权利要求1所述的一种生产乙型肝炎病毒PreS蛋白和丙型肝炎病毒E1-E2蛋白的融合抗原PreS-E1-E2疫苗的酵母工程菌株，其特征是巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2的基因组中含有乙肝、丙肝病毒的PreS-E1-E2融合基因序列，经甲醇诱导后分泌表达PreS-E1-E2融合蛋白，融合蛋白分子量为140kD。
3.根据权利要求1所述的一种生产乙型肝炎病毒PreS蛋白和丙型肝炎病毒E1-E2蛋白的融合抗原PreS-E1-E2疫苗的酵母工程菌株，其特征是表达的融合蛋白含有HBV的PreS1，PreS2和S表位以及HCV的E1和E2表位。
4.一种用于实现权利要求1所述的一种酵母工程菌株的制备方法，它包括下列步骤A、HBV全长PreS基因的PCR扩增，设计引物a.正向引物5’GAATTCTACGTAATGGGAGGTTGGTC 3’b.反向引物5’CTGCAGAGATCTAATGTATACCCAAAG 3’用直接提取法从乙型肝炎病人血清中提取HBV基因组DNA为模板，用引物a/b进行PCR扩增，得到全长PreS基因，将PreS cDNA片段连接到pMD18-T载体上，获得pMD18T-PreS质粒，转化E.coli DH5α感受态细胞(购自武汉凌飞科技有限公司)，在含Amp的LB培养基平板上筛选阳性克隆，克隆的DNA片段为HBV PreS基因，全长1206bp，基因型为Adr亚型；B、HCV的E1和E2基因的PCR扩增，设计引物E1的引物为c.正向引物5’AGATCTGTGCCCGCTTCAGCC3’d.反向引物5’CTGCAGGTCCATGATGGCTTG 3E2的引物为e.正向引物5’CTGCAGGCGGAAACCCACGTC 3’f.反向引物5’AAGCTTGCGGCCGCTACACGTCCACAATGTT 3’利用引物c/d PCR扩增出的E1基因不含E1蛋白C末端43aa的编码序列，利用引物e/f PCR扩增出的E2基因不含E2蛋白C末端53aa的编码序列，扩增的E1、E2基因片段分别连接到pMD18-T载体上，分别获得pMD18-T-E1和pMD18-T-E2，再用限制性内切酶Pst I和Hind III酶切，电泳回收获得pMD18-T-E1片断和E2片断，再用T4DNA连接酶16℃连接16小时，获得pMD18T-E1E2质粒，转化E.coli DH5α感受态细胞，在含Amp的LB培养基平板上筛选阳性克隆，重组质粒经过测序确定；C、pPIC9K-PreS-E1-E2质粒的构建碱裂解法提取pMD18T-PreS质粒和pMD18T-E1E2质粒，各用Bgl II和Hind III进行双酶切，电泳回收pMD18T-PreS载体线性片段和E1-E2 cDNA片段，用T4 DNA连接酶16℃连接16小时，转化E.coli DH5α感受态细胞，在含Amp的LB平板上筛选阳性克隆，获得pMD18T-PreS-E1-E2质粒，提取质粒进行酶切和PCR鉴定，再以PCR方法得到PreS-E1-E2片段，引物如下正向引物5’GAATTCTACGTAATGGGAGGTTGGTC 3’反向引物5’AA GCTTGCGGCCGCTACACGTCCACAATGTT 3’PCR得到的扩增片段和载体质粒pPIC9K均以SnaB I和Not I进行双酶切，电泳回收酶切产物，T4 DNA连接酶16℃连接16小时，转化E.coli DH5a感受态细胞，在含Amp和Kan的LB平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2克隆，提取该质粒DNA用SnaB I和Not I进行双酶切鉴定，获得两条分别为9.3kb的pPIC9K载体和2.7kb的PreS-E1-E2 DNA的带，以pPIC9K-PreS-E1-E2质粒为模板进行PCR，得到单一的2.7kb的带，重组质粒pPIC9K-PreS-E1-E2经过测序确定；D、巴斯德毕赤酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS-E1-E2的获得经SalI酶切完全线性化后的pPIC9K-PreS-E1-E2，电转化巴斯德毕赤酵母菌株Pichiapastoris SMD1168感受态细胞，转化条件0.5mm电转杯，电压1500V，电容50uF，时间10ms，电转结束后，加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，混匀，取0.5mL涂布在组氨酸缺陷的MD平板上28℃培养4天，挑取单菌落，再用0.5-4mg/ml的G418筛选获得浓度G418的酵母菌株，提取其基因组用PCR鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种生产乙肝和丙肝病毒PreS－E1－E2疫苗的酵母菌株及制备方法。本发明提供的酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS－E1－E2，CCTCC NOM206069，基因组中含有乙型、丙型肝炎病毒的PreS－E1－E1融合基因。酵母菌株Pichia pastoris SMD1168/PreS－E1－E2经过诱导，可以分泌表达PreS－E1－E2融合蛋白，表达量可以达到20mg/L。该融合蛋白兼具乙肝病毒和丙肝病毒两种抗原性质，免疫家兔后可以产生抗PreS、抗E1和抗E2的抗体，并且免疫原性良好，作为疫苗能可望同时预防乙肝和丙肝这两种病毒性疾病。
文档编号C07K14/005GK1908157SQ20061001974
公开日2007年2月7日 申请日期2006年7月28日 优先权日2006年7月28日
发明者叶林柏, 吴正辉, 佘应龙, 叶力, 郜金荣 申请人:武汉大学