专利名称：：抗结核杆菌感染的小分子核苷酸dna适配子及其制备方法
技术领域：
：本发明属微生物感染免疫和检验领域,具体涉及一种能抑制感染人的结核杆菌(MycoZ^rfen'wwr"6ercw/o&，朋7AV)[ATCC93009(4)]的DNA适配子(Aptamer)，具有SEQIDNO.l，SEQIDNO.2,SEQIDNO.3,SEQIDNO.4,SEQIDN0.5,SEQIDN0.6，SEQIDN0.7，SEQIDNO.8,SEQIDNO.9,SEQIDNO.IO所示的核苷酸序列。同时还涉及制备一种能与感染人的结核杆菌特异结合，抑制结核杆菌感染的高亲和DNA适配子的方法。
背景技术：
：结核分枝杆菌(Mj;co6ac敝z'wwTwZwcw/o^)感染人体导致的结核病是一种严重危害人民身体健康的慢性传染病。结核病是历史上患病率及死亡率最高的疾病之一。上世纪50年代以来，结核病的流行在一定程度上得到了控制。80年代中期以来，由于耐药结核菌的流行和艾滋病的传播蔓延等因素，使一些已经控制了结核病疫情的国家出现了疫情进一步加重或扩散流行的局面，结核病疫情又有进一步抬头的趋势。据世界卫生组织(WHO)统计资料显示，全球目前有近三分之一的人感染结核杆菌，活动性肺结核病人达2000万，每年有300万人死于结核病，新增患者880万人。1993年，世界卫生组织宣布"全球结核病处于紧急状态"，把结核病列为重点控制的传染病之一。我国是结核病高负担国家，国务院已确定结核病为我国三大重点防治传染病之一。因此，加强对结核病的研发力度，急待研制新型抗结核新药，以便对该病进行有效的治疗和预防，具有很大的研究价值和社会效益。SELEX技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment,系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，基本原理是运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲和力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers),具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，应用范围十分广泛。已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲和性和特异性，具有良好的应用前景。适配子与传统意义上抗体相比，具有分子量小，能更快地渗入细胞，更迅速在血液中清除，能够稳定合成，便于修饰等特点。是极有潜力的作为预防、诊断和治疗疾病的新型试剂。本研究中，我们采用SELEX技术对H37Rv进行筛选，并用BCG进行反筛，以获得能拮抗结核分枝杆菌表面毒力成分的生物活性小分子核苷酸Aptamers分子。为结核杆菌感染机制的研究，结核病治疗性新型药物和新型诊断试剂的开发而奠定基础。
发明内容本发明的目的是在于提供一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，该DNA适配子为预防和治疗结核病提供了新型的拮抗剂，可以克服临床常用药物利福平(rifampin)、链霉素(str印tomycin)等治疗周期长，副作用大的缺点。本发明的另一个目的是提供一种制备能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的方法，该方法通过随机单链DNA文库和引物的构建、合成双链DNA文库、PCR扩增、SELEX筛选、体外抑制细菌侵袭实验，得到能抑制结核杆菌感染小鼠的DNA适配子，并通过动物实验检测效果好，准确率高。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.l，SEQIDN0.2,SEQIDN0.3,SEQIDN0.4,SEQIDN0.5，SEQIDNO.6,SEQIDN0.7,SEQIDN0.8,SEQIDN0.9，SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的制备方法，按下列步骤顺序进行-1、构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链DNA(ssDNA)文库-5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N加-GGGTCAATGCGTCATA-3，，其中N代表碱基A,G，T，C中的任意一个，该文库的容量约为101410t5;构建上游引物5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3'，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性内切酶EcoRI的酶切位点；构建下游引物5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3'，该引物中含有DNA限制性内切酶SflwHI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物可由引物合成公司合成。2、双链DNA(dsDNA)及单链DNA(ssDNA)文库的PCR扩增，保存每轮筛选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。为了稳定条件，不改变反应程序94°C4min,94°C30s,56°C45s，72°Clmin30s，18~25个循环，72°C7min。调节循环次数以获得最佳扩增效果(18~25个循环)。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒回收纯化。3、PCR扩增产物的纯化。用含0.5ug/ml溴化乙锭的296琼脂糖凝胶，对步骤2中PCR扩增产物进行电泳，然后将其放在260nm荧光透视板上，把呈橘红色条带的PCR扩增产物切下，用德国Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化；4、SELEX筛选。每轮筛选所用的ssDNA量均为8ug，使用前置于85"C水浴15min后，迅速冰浴5min，取等量于筛选缓冲液(1Xbuffer)中与细菌作用，37。C轻振15min，12000rpm5min，弃上清，再加入筛选洗脱液(1Xbuffer)反复洗涤4~6次。所得细菌用50ul灭菌ddH20吹匀，煮沸5min,冰浴，用酚/氯仿(25:24)抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，即为下一轮筛选的模板。上述SELEX筛选缓冲液(2X)为25mraol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl),5Ommol/L氯化钾(KC1),200mmol/L氯化钠(NaCl)，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5%甘油(Glycerol)，0.5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。上述SELEX筛选洗脱液(2X)为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl),5Ommol/L氯化钾(KC1),lmol/L氯化钠(NaCl)，0.2mtnol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5%甘油(Glycerol),0.5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。5、为了获得特异性筛选，选用梯度筛选以增加选择压力。前三轮用108CFU(菌落形成单位)H37RV(购自北京药物制品研究所)筛选；6、第四轮开始加入BCG进行反筛，收集第三轮中所得ssDNA适配子8ug，使用前置于85'C水浴15min后，冰浴5rain，取筛选缓冲液/1X与106CFUBCG(购自北京生物制品研究所)作用，37。C振15min,12000rpm5min，弃上清，再加入筛选洗脱液/lX洗涤，12000rpm离心5分钟，弃沉淀，将上清液与107CFUH37Rv作用，方法同上，离心后所得细菌用50ul灭菌ddH20吹匀，煮沸5min,冰浴，用酚/氯仿/25:24抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，为下一轮筛选的模板，以此模板扩增出下一轮筛选的ssDNA适配子。7、重复上述步骤八次。第四至第六轮用107CFUH37RV筛选，用106CFUBCG开始反筛；第七至第九轮用106CFUH37RV筛选，并用107CFUBCG反筛；第十至十二轮用105CFUH37RV筛选，并用108CFUBCG反筛，完成十二轮筛选。8、比较各轮筛选后所得适配子库与结核杆菌的亲合力，方法同步骤5，分别取各轮适配子8ug，与1()8CFU的H37RV作用，紫外分光光度计260nm检测作用后剩余的单链DNA量。通过检测，可知第十轮适配子库与结核杆菌的亲合力最大。将第十轮得到的单链DNA进行PCR扩增，得到双链DNA产物，经DNA限制性内切酶五coRI和SamHI消化，连于质粒pUC19(Yanisch-Perron,C.，etal.,1985)上，转化到大肠杆菌DH5a(Hanahan,D.,1983;Tartof，K.D.,eta1.，1987)，氨节抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序，得到上述SEQIDNO.l,SEQIDN0.2,SEQIDN0.3,SEQIDN0.4,SEQIDN0.5,SEQ画0.6,SEQIDN0.7,SEQIDN0.8,SEQIDN0.9,SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。本发明的优点和效果一能特异性的结合在结核杆菌致病过程中发挥作用的毒力因子，可降低结核杆菌侵入巨噬细胞的能力，抑制结核杆菌感染小鼠。DNA适配子可直接作为结核杆菌的拮抗剂使用，可预防和治疗结核病。因为采用了新的组合化学技术-SELEX技术进行结核杆菌全菌的DNA适配子的筛选，确保了获得的DNA适配子可特异性结合在结核杆菌菌体毒力因子上，从而封闭了结核杆菌的致病位点，使其不能进入巨噬细胞，从而不能在机体内持留和增殖，有利于免疫系统对其清除。二为克服临床上结核治疗出现的日益严重的耐药问题和副作用大的情况，提供了新的解决途径。目前治疗伤寒感染多采用广谱抗菌素，如异菸肼(isoniazid)、利福平(rifampin)、链霉素(str印tomycin)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、乙胺丁醇(etambutol)和氨硫脲(bethiozone),这些药物不仅杀伤结核杆菌也杀伤寄生在人体内的多种有益菌群，并且副作用大，周期长；同时结核杆菌的对这些药物产生的耐药问题也日益严重。本发明制备的DNA适配子为小分子核酸，其分子结构不同与任何广谱抗生素，因而无耐药性之忧；同时DNA适配子只针对结核杆菌发挥作用，对人体内的多种有益菌群并无危害。DNA适配子也别于传统的蛋白质抗体，其分子量小，可快速渗入细胞，无抗原性，不引起副作用。三由下表可知，动物实验中，小鼠攻毒后19天取肺脏和脾脏进行细菌计数，可发现用DNA适配子处理结核杆菌H37Rv后，结核杆菌的数目明显要少于未加DNA适配子处理组。说明本发明的适配子能有效地抑制结核杆菌侵入巨噬细胞，促进了结核杆菌在机体内的清除，可以直接作为结核杆菌的拮抗剂使用。此外，该DNA适配子及适配子库已克隆到pucl9质粒上，并且该质粒已转化到大肠杆菌DH5a中，可直接用该菌株进行大规模生产制备。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>图1.SELEX技术筛选特异性抑制结核感染适配子示意图。用合成的随机单链寡核苷酸文库与结核杆菌有毒株H37Rv作用，去掉不能结合的部分，筛选三轮后加入BCG进行反筛，共筛选十二轮。图2.单链DNA和双链DNA的扩增示意图。每轮筛选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。此图选用第3，5，7，9，ll轮的ssDNA和dsDNA作为示例。图3.有毒株结核杆菌吸附各轮(3~12)筛选后所得到的ssDNA适配子的能力比较示意图。全部筛选完后，分别取8ug每轮筛选后得到的ssDNA与108CFUH37RV作用，发现第十轮适配子库于结核杆菌有最强的结合能力。图4A、4B.等温滴定量热法检测核苷酸SEQIDNO.l与H37Rv和BCG亲合力示意图。以Microcal公司提供的Origin5.0软件对SEQIDNO.l适配子和细菌反应的稀释热进行双位点模型非线性最小方差拟和，可以得到SEQIDNO.l适配子和细菌作用的本征结合常数Ka。其中SEQIDNO.l适配子与BCG的结合常数分别为Kla:7.20xl04(±3.6xl03)Lmori，厶G产3.124xl05(±3.674xl04)J;K2a:1.52xl()5(土9.8xl03)Lmor1，AG2=7.247x104(±2.94xl03)J(图4A)。而SEQIDNO.l适配子与H37Rv的结合常数分别为Kla:1.84xl04(士1.5xl()3)Lmor1，AG产6.248xl05(±4.517xl04)J;K2a:7.65xl05(±6.0xl04)Lmol-1,AG2=-3.739xl05(±8.968xl04)J(图4B)。从数据可知，SEQIDNO.l适配子与结核杆菌有两个结合位点，与BCG结合时，都为吸热反应，而与H37RV结合时，其中一个位点为放热反应，且亲合力较高，说明反筛是有效的，因而筛选所得到的适配子特异性的。图5.抑制结核杆菌侵袭巨噬细胞的能力示意图。由图可知，结核杆菌和适配子作用后侵入巨噬细胞的数量明显减少，SEQIDNO.1-10混合适配子的作用比单个SEQIDNO.l适配子的作用更为明显。图6.适配子延长小鼠生存时间和提高生存率示意图。适配子在与结合杆菌作用后，可以明显延长小鼠感染结核杆菌后的生存时间，并且生存率也得到提高。其中A为结核杆菌H37Rv感染小鼠组，B为结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.l适配子作用后感染小鼠组，C为结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.1-10混合适配子作用后感染小鼠组。从图中可以看出，结核杆菌与适配子作用后，半数死亡率可推迟3天，生存率可提高l倍。图7.适配子对结核杆菌损害小鼠肺脏的病理改变示意图。由图可知，结合杆菌在与适配子作用后，对小鼠肺脏病理损害明显减轻。其中A为正常小鼠肺脏，B为结核杆菌H37Rv感染小鼠肺脏，C为结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.1适配子作用后感染小鼠肺脏,D结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.1-10混合适配子作用后感染小鼠肺脏。图8.适配子减少结核杆菌感染小鼠后肺脏带菌量示意图。抗酸染色证实，结核杆菌H37Rv与适配子作用后感染小鼠，与未与适配子作用相比，小鼠肺脏的带菌量明显减少。其中A为为结核杆菌H37Rv感染小鼠肺脏，B为结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.l适配子作用后感染小鼠肺脏，C结核杆菌H37Rv和SEQIDNO.1-10混合适配子作用后感染小鼠肺脏，D为链霉素治疗后小鼠肺脏，箭头所指为结核杆菌。具体实施例方式一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.(1_10)所示的核苷酸序列。一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的制备方法按下列步骤顺序进行1、构建随机单链DNA(ssDNA)文库和引物。构建长度为88个碱基的单链DNA(ssDNA)文库5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-Nm-GGGTCAATGCGTCATA-3，,其中N代表碱基A,G，T,C中的任意一个，该文库的容量约为10141015;构建上游引物5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3'，其中画线部分为T7启动子的序列，该引物含有DNA限制性内切酶五oRI的酶切位点；构建下游引物5'-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3'，该引物中含有DNA限制性内切酶5a/nHI的酶切位点。随机单链DNA文库和引物可由上海生物工程公司合成。2、双链DNA(dsDNA)及单链DNA(ssDNA)文库的PCR扩增每轮筛选前先将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库。为了稳定条件，不改变反应程序94°C4min，94°C30s，56°C45s，72°Clmin30s，18~25个循环，72°C7min。调节循环次数以获得最佳扩增效果(18~25个循环)。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒回收纯化。3、PCR扩增产物的纯化。用含0.5ug/ml溴化乙锭的2呢琼脂糖凝胶，对步骤2中PCR扩增产物进行电泳，然后将其放在260ran荧光透视板上，把呈橘红色条带的PCR扩增产物切下，用德国Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化；4、SELEX筛选。为了获得特异性筛选，采用梯度筛选以增加选择压力。前三轮用10tFUH37RV筛选；第四轮至第六轮用10tFUH37RV筛选，并用106CFUBCG开始反筛；第七至第九轮用106CFUH37RV筛选，并用IO'CFUBCG反筛；第十至十二轮用105CFUH37RV筛选，并用108CFUBCG反筛。每轮筛选所用的ssDNA量均为8ug，使用前置于85。C水浴15min后，迅速冰浴(0°C)5min，取适量于筛选缓冲液(IXbuffer)中与细菌感作，37t轻振15min，12000rpm5min,弃上清，再加入筛选洗脱液(1Xbuffer)反复洗涤4~6次。所得细菌用50ul灭菌dc!H20吹匀，煮沸(IO(TC)5min，冰浴((TC)，用酚/氯仿(25:24)抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，即为下一轮筛选的模板。上述SELEX筛选缓冲液(2X)为25mraol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl),50mmol/L氯化钾(KC1),200mmol/L氯化钠(NaCl),0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),5%甘油(Glycerol),0.5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。上述SELEX筛选洗脱液(2X)为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl),5Ommol/L氯化钾(KC1)，lraol/L氯化钠(NaCl)，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，50/o甘油(Glycero1)，0.5mmol/L二硫苏糖醇(DTT)。5、完成十二轮筛选后，比较各轮筛选后所得适配子库与结核杆菌的结合能力，方法同步骤5，分别取各轮适配子8ug，与10tFU的H37RV作用，紫外分光光度计260nni检测作用后剩余的单链DNA量。通过检测，可知第十轮适配子库与结核杆菌的结合能力最大。6、将第十轮得到的单链DNA进行PCR扩增，得到双链DNA产物，经DNA限制性内切酶五coRI和^mffl消化，连于质粒pUC19上，转化到大肠杆菌DH5oc，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序；7、将出现频率最多克隆的单个生长菌落所对应的DNA适配子和第10轮适配子库各8ug分别加入含有1(TCFU的结核杆菌[ATCC93009(4)]菌液中感作，作用方法同步骤5，感作后的细菌做小鼠(C57BL/6)攻毒实验，同时以没有处理的结核杆菌做攻毒对照。将小鼠分为四组，每组8只。第一组为攻毒组，注射1()7CFUH37RV/只；第二组将107CFUH37RV与第10轮ssDNA库8ug,37。C感作30min后再注射；第三组为第10轮出现频率最大适配子NK2与107CFUH37RV作用后注射，方法同第二组；第四组为链霉素治疗组，注射10'CFUH37RV后24h，再用链霉素治疗(lmg/0.5ffll.只/天)，共六天。同时取4只小鼠只注射筛选缓冲液(lx)和0.05%Tween-80的生理盐水作为空白对照，所有小鼠均为尾静脉注射400ul。实验前H37RV都经小鼠体内传代，以增强毒力，以便于结果稳定。实验证明，适配子库和单适配子均能延长小鼠的生存时间，并能明显减少活体肺组织的带菌量。因此，第十轮适配子库即为能抑制结核杆菌感染小鼠的DNA适配子库，其中出现频率最大的单适配子即为能抑制结核杆菌感染小鼠的DNA适配子。上述SELEX筛选缓冲液(2X)为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液(Tris-Cl),50mmol/LKC1,200mmol/LNaCl，0.2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，5%甘油(Glycerol),O.5mraol/L二硫苏糖醇(DTT)。SEQUENCELISTING〈110〉抗结核杆菌感染的小分子核苷酸DNA适配子及其制备方法〈120〉武汉大学〈130〉章晓联，陈凡〈140〉10〈141〉Patentinversion3.1Sequence〈213〉OrganismName:合成<400〉PreSequenceString:tttaatcacacaacaccgtgcttcaagctt30〈212〉Type:DNA<211〉Length:30SequenceName:1SequenceDescription:单链DNA适配子Sequence<213〉OrganismName:合成〈400>PreSequenceString:tttaatcacacaacaccgtgtttcaagctt30〈212〉Type:腿〈211〉Length:30SequenceNa肥2SequenceDescription:单链DNA适配子Sequence<213〉OrganismNarae:合成〈400〉PreSequenceString:tttaatcacacaacaccgtgcttctagctt30〈212〉Type:DNA〈211〉Length:30SequenceName:3SequenceDescription:单链DNA适酉己子Sequence〈213〉OrganismName:合成〈400>PreSequenceString:tttaatcacacaacaccgtgctactagctt30〈212>Type:画〈211>Length:30SequenceName:4SequenceDescription:单链DNA适配子Sequence〈213>OrganismName:合成<400〉PreSequenceString:tttaatcctcaacaccgtgcttcaagctca30〈212〉Type:DNA〈211〉Length:30SequenceName:5SequenceDescription:单链DNA适酉己子Sequence<213〉OrganismName:合成<400>PreSequenceString:cgacaggggtctgaatcacgtacattcgta30〈212〉Type:DNA〈211〉Length:30SequenceNanie:6SequenceDescription:单HDNA适酉己子Sequence〈213〉OrganismName:合成〈400〉PreSequenceString:cgac鄉ggtctgaaccacgtacattcgta30<212〉Type:DNA<211>Length:30SequenceName:7SequenceDescription单链腿适配子Sequence〈213〉OrganismName:合成<400>PreSequenceString:ataactggatccgtccacaccttcaaactg30<212>Type:DNA〈211〉Length:30SequenceName:8SequenceDescription:单链DNA适配子Sequence<213〉OrganismName:合成<400〉PreSequenceString:acccacttcgaatccagattcatgaaccaa30<212>Type:腿<211>Length:30SequenceName:9SequenceDescription:单链腿适配子Sequence〈213>OrganismName:合成<400〉PreSequenceString:cccatactacattcatcccggaacacgtgg30〈212〉Type:DNA<211>Length:30SequenceName:10SequenceDescription:单链腿适配子权利要求1、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。3、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDN0.3所示的核苷酸序列。4、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。5、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。6、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDN0.6所示的核苷酸序列。7、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDN0.7所示的核苷酸序列。8、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDN0.8所示的核苷酸序列。9、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDN0.9所示的核苷酸序列。10、一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子，其具有SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。11、权利要求1所述的一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤a、构建单链DNA文库5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-N:i-GGGTCAATGCGTCATA-3',构建上游引物5'-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，构建下游引物5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3';b、将步骤a中单链DNA文库扩增成双链DNA，保存；筛选前将ssDNA文库扩增成dsDNA文库，保存，并以dsDNA文库为模板扩增出下一轮筛选的ssDNA文库；单链DNA文库2ul、上游引物0.lnmol、下游引物0.1,1、25mmol/LMgCl26ul、2mmol/LdNTPlOul,10倍DNA聚合酶反应缓冲液10ul和DNA聚合酶2.5个活性单位，加入双蒸水/ddH20中，使总体积为100ul;然后放入PCR仪中，反应程序设定为94。C4min，94。C30s，56°C45s，72°Clmin30s，18~25个循环，72°C7min，调节循环次数18~25;c、将步骤b中的PCR扩增产物用含0.5ug/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶进行电泳，然后将其放在260咖荧光透视板上，把呈橘红色条带的PCR扩增产物切下，用DNA纯化回收试剂盒纯化；d、收集步骤c中所得ssDNA适配子8ug，使用前置于85'C水浴15min后，冰浴5min,取筛选缓冲液/1X与108CFUH37RV作用，37。C振15min，12000rpm5min,弃上清，再加入筛选洗脱液/1X反复洗涤4~6次,所得细菌用50ul灭菌ddH20吹匀，煮沸5min，冰浴，用酚/氯仿/25:24抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，为下一轮筛选的模板，以此模板进行单链扩增，并用步骤c纯化，得到下一轮筛选的ssDNA适配子；e、重复步骤d二次，将步骤d中收集步骤c中所得ssDNA适配子8ug用筛选后所得的适配子代替；f、收集步骤e中所得ssDNA适配子8ug，使用前置于85'C水浴15min后，冰浴5min，取筛选缓冲液/1X与106CFUBCG作用，37。C振15min，12000rpm5min，弃上清，再加入筛选洗脱液/lX洗涤，12000卬m离心5分钟，弃沉淀,将上清液与107CFUH37Rv作用，方法同上，离心后所得细菌用50ul灭菌ddH20吹匀，煮沸5min，冰浴，用酚/氯仿/25:24抽提，取上清，PCR扩增dsDNA库，为下--轮筛选的模板，以此模板扩增出下一轮筛选的ssDNA适配子；g、重复步骤f八次，将步骤f中收集步骤e中所得ssDNA适配子8ug用筛选后所得的适配子代替，重复步骤f第三次至第五次时，将步骤f中BCG菌量改为IO化FU，将HR37v菌量改为106CFU，重复步骤f第六次至第八次时，将步骤f中BCG菌量改为108CFU，将HR37v菌量改为105CFU;完成十二轮筛选；h、比较十二轮筛选所得到的ssDNA与结核杆菌的亲合力，将与结核杆菌亲合力的一轮适配子库用步骤b的方法扩增成dsDNA;经DNA限制性内切酶￡coRI和5flwHI消化，连于质粒pUC19上，转化到大肠杆菌DH5a，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落进行测序。12.介苗进行反筛。13、根据权利要求2所述的一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子的方法，其特征在于歩骤d所述的SELEX筛选缓冲液/2X为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液、50mraol/LKCl、200mmol/LNaCl、0.2mmol/L乙二胺四乙酸、5%甘油、0.5mraol/L二硫苏糖醇；所述的SELEX筛选洗脱液/2X为25mmol/L崔氏碱盐酸缓冲液、50mmol/LKCl、lmol/LNaCl、0.2mmol/L乙二胺四乙酸、5%甘油、0.5mmol/L二硫苏糖醇；所述的离心其转速为12000转/分钟，时间为5分钟。全文摘要本发明公开了一种能抑制结核杆菌感染的DNA适配子及制备方法，DNA适配子具有SEQIDNO.1-10所示的核苷酸序列，其制备方法包括以下步骤首先是构建随机单链DNA文库的；其次是合成双链DNA文库；第三是SELEX筛选；第四是PCR扩增、第五是克隆和测序，第六是通过体内和体外实验证实DNA适配子的效果。该DNA适配子可直接作为结核杆菌拮抗剂使用，可用于预防和治疗结核病，克服临床常用药物利福平(rifampin)、链霉素(streptomycin)等治疗周期长，副作用大的缺点。文档编号C07H21/00GK101109013SQ20061001967公开日2008年1月23日申请日期2006年7月20日优先权日2006年7月20日发明者章晓联,凡陈申请人:武汉大学