专利名称：抗25-羟基维生素d的抗体的制作方法
抗25-羟基维生素D的抗体5背景技术本发明涉及生产抗25-羟基维生素D的抗体的方法，根据本发明 的方法生产出的抗体以及用其4全测2-羟基维生素D的方法。术语"维生素"中暗示了充足的维生素D供给是生命攸关的。维生 素D的匮乏会导致例如佝偻病或骨质疏;^症等严重疾病。虽然在上 io 个世纪初，维生素D仍然被看作是一个单独的物质，在过去30年中， 维生素D体系已经发展为一个复杂和多样的维生素D代谢物系统。 现在已知的维生素D代谢产物已经超过40种(Zercrkh,J.E.， Ann. Clin. Biochem. 41 (2004) 272-281 )。人体只能通过太阳光照射在皮肤上时，由紫外线作用产生维生素15 D3或钙化醇。在皮肤中产生的维生素D3与所谓维生素D结合蛋白相结合并被运送到肝脏，在那里通过25-羟基化作用转化为25-羟基维 生素D3。除了以上被提及的皮肤和肝脏两个器官外，现今大量的其 他组织也被证实参与了维生素D的代谢(查阅Schmidt-Gayk，H.等， (eds. )， "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and cyclic20 AMP(可调节激素、维生素D代谢物和环腺普酸的4丐)"，Springer Verlag, Heidelberg (1990), pp. 24-27 )。在总量上来说，25-羟基维生素 D,确切地说是25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3是人体内储存 维生素D的主要形式。当需要时，这些前体可在肾脏中被转化为生 物体内活性的la,25-二羟基维生素D,即所谓的激素D。 生物体内25 活性的维生素D不仅调节钙摄取，其中有自肠和骨矿化作用中的4丐 摄取，它还影响着其他大量的代谢途径，如胰岛素系统。测量维生素水平本身对于测定病人的维生素D状况并没有什么 帮助，因为维生素D (维生素D2和维生素D3)的浓度会冲艮据食物的吸收大幅波动。另外循环中的(24小时)维生素D的生物半衰期相 对较短，这也是它不能作为测定病人维生素D状况合适参数的另一 原因。这同样也适用于生理学活性形式的维生素D(l,25-二羟基维生 素D)上。相比于25-羟基维生素D，这些生物活性形式的浓度也相对 5 较小及波动极大。综上所述，对于综合分析病人总的维生素D状况， 量化25-羟基维生素D是一种适当的手段。由于25-羟基维生素D高度的临床价值，文献中提及了大量的多 少有些可靠性的测定25-羟基维生素D的方法。例如在Haddad, J. G.等，J. Clin. Endocrinol. Metab. 33 (1971) 10992-995和Eisman， J, A.等，Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305中描 述了利用高效液相色谱法(HPLC )来测定血液样品中25-羟基维生素 D的浓度。测定25-轻基维生素D的其他途径之一利用例如存在于牛奶中的 维生素D结合蛋白。Holick, M. F.和Ray, R. (US 5,981,779)和15DeLuca等.(EP 0 583 945)中描述了 一种维生素D检测法，该方法基 于利用维生素D结合蛋白与羟基维生素D和二羟基维生素D结合， 并通过一种竟争性测试程序来测定他们的浓度。然而，这种方法的首 要条件是被测定的维生素D代谢物必须是从原血液或血清样品中有 机萃取分离出的形式，以及必须经过如层析柱等的纯化。20 Armbruster, F. P.等(WO 99/67211)中讲授了需要通过乙醇沉淀法制备血清或血浆的样品来进行维生素D测定。在这个方法中，蛋 白质沉淀物通过离心被移除，剩下包含可溶性维生素D代谢物的乙 醇上清液。这些可以通过竟争性结合分析法测定。另夕卜，EP 0 753 743讲授了利用高碘酸盐将蛋白质从血液或血清25 样品中分离出来。在这个案例中，用高碘酸盐处理样品，测定样品的 无蛋白上清液中维生素D化合物。在某些商业检测中，推荐了利用 乙腈作为从血清或血浆样品中萃取的介质(例如，DioSorin的放射免 疫测定或者"Immundiagnostik，，公司的维生素D斥全测)。近年来计划发布大量不同的释放试剂，原则上均适合用来从样品 中的结合蛋白上释放维生素D化合物。然而，这种释放或分离应该 在相对温和的条件下进行，从而可以在结合测试中可直接使用已被释放试剂处理过的样品。(参见例如WO 02/57797和 US 5 2004/0132104)。尽管近年来巨大的成果，所有现有维生素D的检测 方法都有一些缺点，如样品制备费人力，标准化的匮乏，测试程序之 间缺乏一致性或掺加(spiked )维生素D收率低。(特别见Zerwekh, J. E.， supra)。特别是在先技术中没有提及能生产出测定25-羟基维生素D的可 io靠方法。因此本发明的目的是找到一种能生产出适合用来做25-羟基 维生素D测定的抗体的可靠方法。下面描述的方法，既有生产抗体 的方法，也包括用这些抗体测定维生素D的方法和试剂盒。 发明概述本发明涉及生产能抗25-羟基维生素D的抗体的方法，包含以下 15 步骤a) 将含25-羟基维生素A或25-羟基维生素02作为半抗原的 缀合物，免疫接种到一种实验用动物体内，b) 分离上述实验用动物的血清或血浆，以及c) 通过免疫吸附到分别包含25-羟基维生素D2或25-羟基维生 20 素D3的互补基质上，从而将血清或血浆中的抗体提纯出来。此外，本发明涉及的抗25-羟基维生素D3的抗体可与10%至 1000%的数量级的25-羟基维生素D2交叉反应。本申请还描述了如何利用本发明生产出的抗体在自动化测试中 25检测25-羟基维生素D。另外，公开了一种可用来检测25-羟基维生素D的测试盒，包括 测试程序中所需试剂组合物以及本发明中所包含的抗25-羟基维生素 D的抗体。发明详述本发明涉及生产能抗25-羟基维生素D的抗体的方法，包含以下 步骤a) 将含25-羟基维生素03或25-羟基维生素02作为半抗原的 5 缀合物，免疫接种到一种实验用动物体内，b) 分离上述实验用动物的血清或血浆，以及c) 通过免疫吸附到分别包含25-羟基维生素D2或25-羟基维生 素D3的互补基质上，从而将血清或血浆中的抗体提纯出 来。io 如无另外声明，根据下列结构式i和n,术语"维生素D"应理解为包括维生素D2和维生素D3两种形式。式I<formula>formula see original document page 6</formula>式II依照类固醇命名法标明了结构式I和II中维生素D的各个位置。25-羟基维生素D表示结构式I和II中C-25位置被羟基化的维生素D代 谢物，即25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3。如上所述，25-羟 5基维生素D2和25羟基维生素D3是诊断学上显著相关的维生素D形 式。提到维生素D的活性形式1,25-二羟基维生素D (所谓的激素 D)，是由结构式I和II中C-l和C-25位置被羟基化形成的。另外所知的维生素b代谢物有24-二羟基维生素D2、 25-二羟基 io维生素D2、 24-二羟基维生素D3和25-二羟基维生素D3。所有已知的维生素D代谢物本身都不能产生免疫反应。将维生是件容易的事情。因此，为了使免疫成功，必备条件是制备一种如包 含25-羟基维生素D作为半抗原的缀合物。这里术语半抗原被本领域 15 技术人员看作是一种本身不产生免疫性的物质，但是经过与一种较大 载体分子结合后，表现出抗原性从而可以促使针对其的抗体产生。本 领域技术人员知道能产生半抗原缀合物的适宜载体材料。通常用来作 为载体材料的有牛血清白蛋白、(3-半乳糖苷酶或者所谓的匙孔蜮血蓝蛋白(KLH)。KLH被证实尤其适合在本发明所提供的方法中作载体。因此，25-羟基维生素D与KLH的缀合物优选的用于免疫。如式I和II中所示，该结构的各位置原则上都适合用于活化和与 载体材料偶合。例如现已证实经25-羟基维生素D2或25-羟基维生素 5 D3的3位偶合有利于与25-羟基维生素D以合适方式相结合的抗体的 产生。因此在优选实施方式中，依据本发明中用于免疫的缀合物，均 包含经主链的3位偶合的25-羟基维生素D3或25-羟基维生素D2(比 4交式I和II )。作为本发明的 一 部分工作所做的 一 系列实验中，尝试将 一 个用io25-羟基维生素D3免疫原免疫吸附到一个25-羟基维生素D3基质上所 产生的抗体提纯，并且用到相应的测试中去。虽然这些实验并没有成 功，但是令人惊讶地发现，通过免疫吸附到25-轻基维生素D2基质上 可以从同样的血清中获得适合的抗体。现已证实这种方法是可靠的， 并且重现性良好。因此本发明的方法包含了一种可将抗25-羟基维生15 素Dx (这里x=2或3 )的抗体利用免疫吸附到一个包含25-羟基维生 素D的各自互补形式的缀合物的基质上进行^提纯的步骤。在这个意 义上，25-羟基维生素D3与25-羟基维生素Dz互补，反过来25-羟基 维生素D2也与25-羟基维生素D3互补。这说明当用25-羟基维生素 D3免疫时，进行与25-羟基维生素02的免疫吸附；当用25-羟基维生20素D2免疫时，进行与25-羟基维生素D3的免疫吸附。此外，已证实利用维生素D主链上同一位置进行化学偶合是有 利的，不论是在用作免疫作用的25-羟基维生素D缀合物中还是在用 作免疫吸附的基质中。在免疫作用中25-羟基维生素D3缀合物优选地 结合在25-羟基维生素D3的3位上，同样的，25-羟基维生素02也优25选地结合在基质的3位上。逆向程序也可行，即，利用25-羟基维生素D2缀合物免疫，利用 偶合25-羟基维生素D3的基质免疫吸附。本发明中另外一个优选实施 方案中，25-羟基维生素D2缀合物用作免疫原缀合物，将用这种免疫原产生的抗体免疫吸附到25-羟基维生素D3基质上去。EAH-琼脂糖凝胶(Sepharose)被证明尤其适合作免疫吸附的基 质材料。在一个优选实施方案中，由免疫作用在血清或血浆中产生抗 25-羟基维生素03或者25-羟基维生素D2的抗体，通过利用包含25-5羟基维生素D2或25-羟基维生素D3的基质进行免疫吸附进而提纯。 EAH-琼脂糖凝胶是一种优选的柱填料。运用之前描述的详细程序，即用25-羟基维生素D3缀合物进行免 疫，利用25-羟基维生素D2缀合物进行免疫吸附，可能重复生产出能 够与25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3两种25-羟基维生素D形io 式均能反应的抗体。这种方法所获得的抗体的交叉反应的数量级为 10%至1000%之间。因此在本发明的一种优选实施方案中，涉及例如 抗25-羟基维生素D3的抗体，与25-羟基维生素02有10%至1000% 的交叉反应。与互补的25-羟基维生素D形式优选有20%至500%范 围内的交叉反应。交叉反应的范围是在一种利用本发明生产的抗体所15 做的免疫学测试法中测定的。如果用相同分析物浓度的25-羟基维生 素D2或25-轻基维生素D3时，在用25-羟基维生素D3绘制的校准曲 线上仅读出了十分之一的25-羟基维生素D3，则抗作为半抗原的25-羟基维生素D3产生的抗体对25-羟基维生素D2的交叉反应性为10 % 。20 25-羟基维生素D的自动化测试。因此本发明优选涉及在检测25-羟基 维生素D的免疫学测试中抗25-羟基维生素D的抗体的用途。25-羟 基维生素D的测试优选是完全自动化的。本发明生产出的抗体尤其 优选地用于可在罗氏诊断公司出品的自动化Elecsys 分析4义中进行 的一种测试中。25 根据本发明的讲授，可以令本领域技术人员将包含所有需要用来做25-羟基维生素D检测的组件组合成一个测试盒。优选的25-羟基 维生素D测试盒的特征在于，这种测试盒包含了抗25-羟基维生素D 且可以识别出两种25-羟基维生素D形式的抗体，即，与每种互补形式的25-羟基维生素D有10%至1000%的交叉反应。优选作为竟争性免疫测定进行测试，其中本发明生产的抗25-羟 基维生素D的抗体被优选用作检测试剂。在这种竟争性测试中，加 入一定量的25-羟基维生素D"胞壁抗原"与样品中的25-羟基维生素D 5竟争检测抗体的结合位点。样品中的25-羟基维生素D越多，检测信 号越少。另外已经被证实以胞壁抗原的形式出现在竟争性测试中的25-羟基维生素D的形式与用于免疫吸附的形式相一致是有利的。如果其中一种免疫用包含25-羟基维生素D3的免疫原，则在25-羟基维生素 io D2基质上进行免疫吸附，而25-羟基维生素Dz的衍生物优选作为胞壁抗原用于测试中。胞壁抗原的修饰位置优选与免疫原以及用在免疫吸附的基质上的25-羟基维生素D的环位置相同。本发明的另 一种优选实施方案涉及一种免疫学检测25-羟基维生素D的方法，此方法中用到的多克隆抗体是用25-羟基维生素D缀合 15物免疫，并免疫吸附于互补的25-羟基维生素D缀合物上获得的，其中在一个竟争性测试中，互补于免疫原的25-羟基维生素D衍生物被用作胞壁抗原。下列实施例及附图进一步阐明了本发明。本发明的准确保护范围 限定于本发明所附的权利要求书中。附图简述
图1: 25-羟基维生素D3免疫原的合成图解。维生素D3经式II主链上3位被激活，并与作为载体的匙孔蜮血 蓝蛋白(KLH)偶合。 25 图2， 25-羟基维生素D2免疫吸附剂的合成图解。维生素D2经式I主链上3位:帔激活，并与基质材料EAH-琼脂糖 凝胶偶合。图3,生物素酰化的维生素D2的合成图解。图示了可用作胞壁抗原的25-羟基维生素D2的合成步骤。图4:用在先技术的抗体做免疫测定。25-羟基维生素D的含量是通过免疫测定法和HPLC法对总共32 个样品的分析来确定。免疫测定的数值标示在Y轴上而HPLC的数 5 值标示在了X轴上。图5:高效液相色谱法(HPLC)和LC-MS-MS的比较。25-羟基维生素D的含量是通过液相层析串联质谱仪LC-MS-MS 和高效液相色谱法(HPLC)对总共66个样品的分析所确定的。 LC-MS-MS的数值标示在Y轴上而HPLC的数值标示在了 X轴上。 io 图6:本发明中的抗体所做的免疫测定与LC-MS-MS的比较。25-羟基维生素D的含量是通过HPLC法和基于本发明中抗体所 做的免疫测定对总共66个样品的分析所确定的。免疫测定的数值标 示在了 Y轴上而HPLC的数值标示在了 X轴上。 实施例11525-羟基维生素Dr3-半琥珀酸酉旨-KLH的合成这个合成中，化学活化25-羟基维生素D3的3位，并与作为免疫 原支持物的KLH耦合。这个合成经过25-羟基维生素D3-3-半琥珀酸 酯和25-羟基维生素D3-3-半琥珀酸酯-N-轻基琥珀酰亚胺酯等中间步 骤，均被图解在图一中。 201.1 25-雍基维生素Dr3-半琥珀酸酯的制备取10 mg (25 |imol) 25-羟基维生素D3 ( Sigma-Aldrich， No. H-4014)溶解在lml无水吡咬中，将其与125 mg (1.25mmol)的琥 珀酸酐在室温下暗室搅拌4天。将反应混合物吸收入10 ml的乙酸乙 酯中，分别用2xl0ml的水，O.IM盐酸洗涤，随后再次用水洗涤。 25 用约lg无水硫酸钠干燥有机相，过滤并真空除去溶剂。用高真空干 燥剩余固体。获得10.5mg (产率84%)的无色固体。 1.2 25-羟基维生素D3-3-半琥珀酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备取10.0 mg ( 20|iimol)的25-羟基维生素03-3-半琥珀酸酯溶解于7 ml的无水二氯曱烷中，并与2.76 mg ( 24|iimol)的N-羟基琥珀酰亚胺和3.72 mg (24)imol)的>^3-二甲基氨基丙基)^，-乙基-碳二亚胺 (EDC) —起混合。在氩气下搅拌过夜，用lOml的水洗涤有机相两次，用约lg无水硫酸钠干燥并过滤。用真空除去溶剂，剩下的反应 5产物在高真空中干燥3小时。获得11.3mg(产率94%)无需进一步提纯并可用于缀合的N-羟基琥珀酰亚胺酯。1.3 25-羟基维生素Dr3-半琥珀酸酯-KLH的合成取150 mg的匙孔蜮血蓝蛋白(KLH; Sigma-Aldrich No. H 8283 )溶解在25 ml 0.1 M的pH 8.0磷酸钾緩沖液中，加入含有11.3 mg的 io N-羟基琥珀酰亚胺酯的2mlDMSO溶液。在室温下过夜搅拌，随后产物用凝胶柱法纯化(AcA202，柱体体积0.5 L; 0.1 M的pH 7.0的磷酸钾緩沖液)。用紫外吸收光谱法(X=256nm)检测并收集含缀合蛋白的流分。加入10%的甘油并将这种灰乳白色的溶液用于免疫。实施例215生产和分离抗25-羟基维生素D3的抗体。 2.1免疫作用在绵羊体内产生抗体。由实例一中获得的25-羟基维生素Dr3-半琥珀酸酯-KLH的缀合物用于免疫。免疫剂量为每只动物0.1 mg。 第一次在完全弗氏佐剂下进行免疫。接下来每间隔4个星期，在不完 20全弗氏佐剂下进行免疫，需时10个月。每次免疫间隔中间收集免疫 血清。2.2多克隆绵羊抗体的纯化在Aerosil ( 1.5%)的帮助下，用25-羟基维生素03-3-半琥珀酸 酯-KLH缀合物从免疫的绵羊血清中移除含脂质的成分。随后用硫酸 25 铵(1.7 M)沉淀出免疫球蛋白。沉淀物在包含50 mM NaCl的15 mM 磷酸钾緩沖液(pH7.0)中透析，并用DEAE-琼脂糖基质层析提纯。 从层析柱流穿液(flow-through)获得IgG流分(=PAB< 25-羟基维生 素D3> S-IgG (DE))。2.3利用亲和层析法纯化25-羟基维生素D特异性抗体。制备了 一种包含了作为特异性决定子的缀合的25-羟基维生素D2 且可用作免疫层析纯化多克隆抗体的免疫吸附剂。这种免疫吸附剂由 以下步骤获得 5a)轻基维生素03-3-2，-氰乙基醚的合成在氩气条件下，在内有温度计的一个25ml三颈圆底烧瓶中，将 20.6 mg (50|iimol)的25-羟基维生素D2 ( Fluka No. 17937 )溶解于10 ml干燥乙腈。将1.5 ml叔丁醇/乙腈(9:1)加入溶液中，并水浴冷却 到6°C。随后加入820 pl的丙烯腈溶液(86|il的丙烯腈溶于1.0 ml io 的乙腈中)并在6。C下搅拌15分钟。然后加入205 (il的氢化钾溶液 (25mgKH溶于0.5ml叔丁醇/乙腈(9:1)中)。产生短暂的絮凝后得 到清澈溶液。继续在6。C下搅拌反应溶液45分钟随后在4"C下搅拌 60分钟。接着，反应溶液用10ml的曱基叔丁基醚稀释并用10ml的水洗 15涤两遍。用约lg无水硫酸钠干燥有机相，通过G3玻璃过滤器过滤 后再用旋转脱水器脱水。最后用高真空干燥，得到质量约55mg清澈 的粘性剩余物。b)轻基维生素D2-3-3，-氨基丙基醚的合成将上面所获得的全部腈溶解于15 ml的二乙醚中，并在搅拌下与20 7.5 mg氢化锂在7.5ml 二乙醚中的悬浮液混合。在室温下搅拌反应 混合物一个小时，然后加入38.4 mg的氬化铝锂在6.6 ml的二乙醚中 的悬浮液，得到一个极度浑浊的混合物。室温下继续搅拌反应混合物 一个小时，然后冰浴反应混合物冷却到0-5。C并小心地加入35 ml的 水。最后加入6.6ml的10M氢氧化钾溶液使混合物具强石威性。25 每次用65 ml的曱基叔丁基醚萃取三次，并用约5 g无水硫酸钠干燥合并的有机相，过滤，在室温下用旋转脱水器脱水。剩余物用油 泵干燥直至质量恒定。粗制的产物溶解于5mlDMSO和3.0ml的乙 腈中并用制备性HPLC法进行纯化。洗脱剂A = Millipore水+ 0.1%的三氟醋酸；
洗脱剂B = 95%的乙腈+ 50/。的Millipore水+ 0.1 %的TFA;
梯度100分钟内从50%的B到100%的B。
流速30 ml/分钟 5温度 室温下
柱体尺寸半径=5.0 cm;长度=25 cm;
柱体填料VydacC18/300A/15-20(^im
检测波长226證
将分析HPLC ( Vydac C18/300A/5pm; 4.6x250 mm )测得的产物 io含量高于85°/。的流分收集到一个圆底烧瓶中并且冻干。最后获得13.7
mg (产率58%)的无色冻干粉。
c )合成羟基维生素D2-3-3，-N-(半环庚基)氨基丙基醚-N-羟基琥珀酰 亚胺酯
11.7 mg ( 25|umol)的氨基衍生物溶解于5 ml新鲜蒸馏的DMF 15 并且加入92 mg ( 250pmo1)的软木酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。加入3.5 pi的三乙胺并在氩气下搅拌过夜。粗制产品通过制备性HPLC法(条 件如上所述)纯化，经过冻干处理后获得10.1 mg (产率56%)的 N-羟基琥珀酰亚胺酯。 d)合成羟基维生素D2免疫吸附剂 20 在一个G3 3皮璃过滤器上用200 ml 0.5 M的氯化钠溶液洗涤20 ml
的EAH琼脂糖凝胶(Amersham Biosciences, No. 17-0569-03 )。用200 mi0.03M的磷酸钟緩冲液(pH7.1 )平衡。通过玻璃过滤器排掉多余 的液体后，将悬浮液加进200ml的相同緩冲液中，并加入溶解了 1.7 mg (2.3jamol) N-羟基琥珀酰亚胺酯的10 ml DMSO。在室温下用混 25 合器搅动反应混合物过夜。将混合物再次转移到一个G3玻璃过滤器 中排干并用500 ml 0.05 M的磷酸钾緩冲液/0.15 M的氯化钠(pH 7.0 ) 洗涤。完全排出后，重悬于25ml的相同緩冲液并加入0.15ml浓度 为25%的叠氮化钠保存备用。e)纯化抗体
10 ml d)中的亲和基质被填入柱体内，并用包含50 mM磷酸钾和 150mMNaCl的緩冲液(pH7.5) (PBS)平衡。将3.6 g的PAB< 25-羟基维生素D3> S-IgG (DE)加载进柱体中。分别用PBS緩沖液和包 5 含0.05% Tween 20和30 mM氯化钠的0.5 M NaCl溶液洗涤柱体。 用3 mM HC1溶液将特异性结合的免疫球蛋白从亲和基质上分离下 来。用lmM的乙酸乙酯透析HCl洗脱液，随后将其冻干。将冻干粉 溶解于PBS中，并用Superdex200⑧层析移除聚集体，由此方法得到 的免疫吸附的多克隆抗体将被用在接下来的步骤里。用1 M的丙酸再 io 生免疫亲和基质并保存在含有0.9%叠氮化钠的PBS溶液中。 实施例3
-险测25-羟基维生素D的测定
商业测定根据制造商的使用说明进行使用。文献中记述了通过 HPLC法(测试25(OH)维生素D3,来自"Immundiagnostik，，公司， 15Bensheim,订单号.KC 3400 )或LC-MS-MS法(Vogeser， M.等，Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417 )来完成25-羟基维生素D的测定。
在依照本发明生产出的抗体的基础上，成分的制备以及一种新免 疫学测试的通用程序描述如下
3.1合成羟基维生素D2-3-3，-N-(半环庚基)氨基丙基醚-生物素
20 -(卩-Ala)-Glu-Glu-Lys(s)缀合物(=Ag-Bi)
将13.7 mg ( 25)iimol)的羟基维生素02-3-3，-氨丙基醚溶解于3.5 ml DMSO溶液中，并混入28.7 mg ( 30|amol )的生物素-((3-Ala)-Glu-Glu-Lys(s)-半辛二酸-N-幾基琥珀酰亚胺酯(Roche Applied Science, No. 11866656)和12.5|al的三乙胺，在室温下搅拌过
25夜。反应溶液用4.5 ml的DMSO溶液稀释，并以0.45pm的孩史过滤 Millipore器滤出，随后用制备性HPLC法提纯(条件见实例2.3b )。 收集分析性HPLC检测出的产物含量超过85%的流分并将其冻干。最 后获得9.8mg (产率30%)的已纯化生物素缀合物。3.2用亲和层析法提纯钌化的可抗25-羟基维生素D的多克隆抗体 (=PAB-Ru)
按照实施例2.3 e)的方法将亲和纯化的抗体转移到100mM的磷 酸钾缓沖液中(pH 8.5)并将蛋白浓度调至l mg/ml。钌化试剂(钌
5 (II)三(联吡咬)-N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解于DMSO中，并以 摩尔比为7.5: 1的比例加到抗体溶液中。反应持续60分钟后，加入 L-赖氨酸使反应停止，多余的标记试剂在Sephadex G25上用凝胶渗 透层析法分离出去。 3.3免疫测定的检测过程。
io 利用罗氏诊断公司的Elecsys 系统测量样品。25(^1的样品与
30(al的释放试剂混合，同时或先后加入15^1的钌化检测抗体并且温 育9分钟。接下来，加入生物素酰化的胞壁抗原(50jxl)并通过加入 释放试剂(50)id)保持pH值在一定的期望范围内。继续温育9分钟 后，加入包被了链霉亲和素(SA) (30|ul)的可磁化聚苯乙烯颗粒，
15再经过9分钟温育后，结合的钌化抗体的量按照常规测定。 包含钌化《5-OH-维生素D〉抗体缀合物的溶液中含有
20 mM 磷酸緩冲液，pH6.5
0.1% oxypyrion
0.1% MIT(N-甲基异瘗唑酮-HCl)
2010% DMSO ( 二曱基亚砜)
1% EtOH (乙醇)
0.1% 表面麻醉剂
1% 兔子免疫球蛋白G ( DET )
2.0 pg/ml PAB-Ru (见实例3.2 ) 25释》文试剂包含
220 mM醋酸盐緩冲剂，pH4.0
0.1% oxypyrion
0.1% MIT10% DMSO
1% EtOH
0.1% 表面麻醉剂
0.2% 兔子免疫球蛋白G
5 含有生物素酰化的胞壁抗原的溶液包含:
20 mM 磷酸緩冲剂，pH6.5
0.1% oxypyrion
10% DMSO
1% E認
io 0.1% 表面麻醉剂
0.2% 兔子免疫球蛋白G
0.18|ug/mlAg-Bi (见实施例3.1 )
含有包被了 SA的乳胶颗粒的悬浮液包含 0.72 mg/ml 具有470 ng/ml结合能力的包被了链霉亲和素(SA)
15 的可^t化聚苯乙烯颗粒
实施例4 实验结果与讨论
4.1利用被作为免疫原和免疫吸附剂的25-羟基维生素D3所获得的抗 体
20 在许多(失败的)实验中所使用的抗体是利用在先技术方法制造
出来的，如用25-轻基维生素D3进行免疫及对其免疫吸附。图4中显 示了 一个不适合用来作为25-羟基维生素D的可靠性检测的抗体的实 例。图4中清楚的表明了用这些抗体的免疫测定所测得的25-羟基维 生素D数值与参考方法(HPLC)之间没有相关性。
254.2比较HPLC和LC-MS-MS
如在Vogeser, M.等，Clin, Chem. 50 (2004) 1415-1417中所描述， 利用LC-MS-MS法检测维生素D的代j射物被越来越多的作为测定维 生素D代谢物的参考方法。因此，研究了是否早先HPLC参考方法的结果可与较新的LC-MS-MS参考方法的结果相比较。可以从图5 看出，两种参考方法均有可比性。利用线性回归确定了相关系数为 0.94。4.3利用才艮据本发明生产的抗25-羟基维生素D的抗体作免疫测定 5 应用新免疫学测试和LC-MS-MS法总共比较了 66个样品中关于25-羟基维生素D的含量。由图6可以看出，由两种测定所得的结果非常相关。由线性回归获得相关系数为0.85。结果令人惊讶，因为这两种分析方法是基于完全不同的原理。因此^^测25-羟基维生素D的测试，可以用根据本发明生产的抗 io 体来建立起一种可靠的25-羟基维生素D的测定方法。
权利要求
1.一种生产抗25-羟基维生素D的抗体的方法，包含以下步骤a)用含25-羟基维生素D3或25-羟基维生素D2作为半抗原的缀合物，免疫接种到实验用动物体内，b)分离上述实验用动物的血清或血浆，以及c)通过免疫吸附到分别包含25-羟基维生素D2或25-羟基维生素D3的互补的基质上，从而将血清或血浆中的抗体提纯出来。
2. 权利要求1中的方法，其特征在于25-羟基维生素D3缀合物 io的^t通过25-羟基维生素D3的3位。
3. 权利要求1中的方法，其特征在于25-羟基维生素D2缀合物 的键通过25-羟基维生素D2的3位。
4. 权利要求2中的方法，其特征在于25-羟基维生素D2通过25-羟基维生素D2的3位与免疫吸附中所用的基质连接。
5.权利要求3中的方法，其特征在于25-羟基维生素03通过25-羟基维生素D3的3位与免疫吸附中所用的基质连接。
6. —种抗25-羟基维生素D3的抗体，所述抗体与25-羟基维生素 02有10%至1000%的交叉反应。
7. —种抗25-羟基维生素D3的抗体，所述抗体与25-羟基维生素 20 D2有20%至500%的交叉反应。
8. 权利要求6或7的抗体在测定25-羟基维生素D3的测试中的 用途。
9. 一种测定25-羟基维生素D3的测试盒，其特征在于所述测试 盒包含权利要求6或7的抗体。
全文摘要
本发明涉及抗25-羟基维生素D抗体的生产方法，根据本发明生产出的抗体以及用这些抗体检测25-羟基维生素D的方法。
文档编号C07K16/26GK101273062SQ200680035451
公开日2008年9月24日 申请日期2006年9月27日 优先权日2005年9月29日
发明者A·基里亚特索利斯, E·休伯, J·贝克, N·霍恩, R·沃格尔, W·克劳斯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司