用微生物纯化粗萘二甲酸的方法和用该方法得到的结晶形式的2,6-萘二甲酸的制作方法

专利名称：：用微生物纯化粗萘二甲酸的方法和用该方法得到的结晶形式的2,6-萘二甲酸的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用微生物纯化粗萘二曱酸的方法，以及通过此方法产生的结晶形式的2,6-萘二曱酸。更具体地，本发明涉及一种纯化粗萘二曱酸的方法，通过使具有将2-甲酰基-6-萘曱酸转化为2,6-萘二曱酸的能力的微生物与粗萘二曱酸反应以去除作为杂质含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘曱酸，在特殊条件下向反应液中添加酸性溶液，搅拌混合溶液使粗萘二曱酸结晶，洗涤结晶的粗萘二曱酸以去除其他包含在结晶的粗萘二曱酸中的杂质，并且干燥洗涤过的产物从而得到纯结晶形式的2,6-萘二曱酸。
背景技术：
：2,6-萘二曱酸(NDA)及其二酯(如2，6-萘二曱酸酯(NDC))是制备多种聚合材料(如聚酯和聚酰胺)的有用的单体。例如，NDA和NDC能与乙二醇缩合形成高性能聚酯材料聚2,6-萘二曱酸乙二酯(PEN)。由PEN制成的纤维和薄膜与由聚对苯二甲酸乙二酯(PET)制成的那些相比显示出高强度和优越的热性能。基于这些优势，PEN非常适用于商业制品(如能够用于制造磁性录音带和电子元件的薄膜)的生产。另外，由于PEN的高抗气体(特别是二氧化碳、氧气和水蒸气)扩散性，由PEN制成的薄膜能用于制造食品容器，特别是热装食品容器。PEN还能用于生产可用于轮胎帘布的制造的增强纤维。NDC通常通过氧化^6-二甲基萘。^-DMN)以得到粗萘二甲酸(cNDA)并且使cNDA酯化来生成。目前，NDC用作合成PEN的主要原料。然而，当NDC用作合成PEN的原料时，相比于应用2,6-萘二曱酸(NDA)时，存在一些问题。首先，在NDA的缩合期间，形成副产物水，而在NDC的情况下形成副产物曱醇，因而有爆炸的风险。其次，由于纯NDC通过NDA的酯化和酯化产物的纯化生成，相比于应用NDA,包括一个额外的工序。第三，考虑到现有的PET生产设备的应用，NDC的应用是不适合的。尽管有这些与NDC的应用相关的问题，NDC还是优选用于生产PEN，因为生产具有合成PEN所需的纯度的纯化的NDA更加困难。氧化2,6-二曱基萘(2,6-DMN)形成含有多种杂质(如2-曱酰基一6-萘曱酸(FNA)、2-萘曱酸(NA)和偏苯三酸)的cNDA。特别地，在cNDA中FNA的存在会使用于产生PEN的聚合终止，导致低聚合度。此低聚合度不利地影响最终聚合物(即PEN)的物理性质，并且导致聚酯的着色。因而去除存在于cNDA中的FNA是必要的，但是去除FNA存在困难。在这些情况下，已经进行了有关用于去除存在于cNDA中的FNA或纯化NDA的各种化学方法的研究。例如，通过以下步骤来产生NDA:i)重结晶cNDA,ii)多次氧化cNDA,或iii)用曱醇处理cNDA以产生NDC并水解NDC。另夕卜，通过cNDA的氬化产生纯化的NDA。除了这些化学方法外，如溶剂处理、熔融/结晶、高压结晶和超临界萃取等的许多方法已被用于纯化NDA。例如，美国专利No.5,859,294公开了一种方法，用于萘二曱酸的生成，其包含将粗萘二曱酸溶于含有脂肪族胺或脂环族胺的水溶液中，去除作为杂质的重金属成分直到重金属成分的含量基于粗萘二甲酸为100ppm或更低，和加热含有萘二曱酸胺盐的水溶液以通过蒸馏掉胺提供高纯度的萘二曱酸。美国专利No.6,255,525公开了一种方法，用于制备具有改善的纯度的芳香性羧酸，包括以下步骤在77~121kg/cm2的压力和277~316。C的温度下，在氢气存在下，将包含不纯的芳香性羧酸和水的混合物与不含氢化金属成分的碳催化剂接触；冷却混合物形成结晶的芳香性羧酸；和从冷却的混合物中去除结晶的芳香性羧酸。关于NDA的结晶反应，美国专利No.6,087,531教示了一种用于回收萘二甲酸(NDA)晶体的方法，该方法包含以下步骤在125~40(TC下，在碱性水溶液(如碱金属碱的水溶液、氬氧化物水溶液或碱金属碳酸盐的水溶液)中溶解聚萘二曱酸亚烷基二酯；在170-240。C下用酸中和水溶液；并回收NDA。例如，通过以下步骤回收NDA晶体在125~400。C下，将聚酯材料溶解于NaOH或KOH溶液中，用醋酸中和水溶液，并且回收NDA。美国专利No.6,426,431教示了一种将2，6-NDA纯化产率提高了高达45%的方法，该方法包含在0~200psi的C02压力和0~50°C的温度下处理KrNDA水溶液形成KH-NDA,以高于1:8(KH-NDA:水)的重量比将KH-NDA悬浮在水中，并且进而在高于100°C(140~160。C)的温度和高于100psi(175~250psi)的〇02压力下处理悬浮液。然而，由于这些方法需要高温和高压条件、耗时处理和大量昂贵材料的应用以生成高纯度NDA晶体，其在经济上是不利的。这些方法的其他劣势在于非常低的纯化产率和NDA纯度，以及个体NDA晶体颗粒间发生凝聚，其使得方法难于在工业上实施。
发明内容因此，考虑到现有技术的问题而产生了本发明，并且本发明的一个目的是提供一种通过在常温常压条件下用能够将FNA转化为NDA的微生物纯化和结晶萘二曱酸，从而以高产率有效地生成高纯度NDA的方法。本发明的另一个目的是提供一种通过本方法生成的均一尺寸的高纯度NDA晶体。为了达到上述目的，依照本发明的一个方面，提供了一种用微生物纯化粗萘二曱酸的方法，此方法包含以下步骤(a)使具有将2-曱酰基-6-萘甲酸转化成2,6-萘二曱酸的能力的微生物与粗萘二曱酸反应以去除包含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘曱酸，(b)向步骤(a)中制备的反应液中加入酸性溶液以调节反应液的pH,并且通过搅拌使混合液反应以使粗萘二甲酸结晶，(c)洗涤结晶的粗萘二曱酸以去除含在结晶的粗萘二曱酸中的杂质，和(d)干燥洗涤后的产物以得到纯的结晶形式的2,6-萘二甲酸。依据本发明的另一个方面，提供了通过纯化方法生成的纯的结晶形式的2，6-萘二曱酸。依据本发明的纯化方法，由于粗萘二曱酸分别在适合的条件下用能够将FNA转化成NDA的微生物纯化和结晶，所以能够有利地在工业规模上以有利于环境的方式生产高纯度的结晶2,6-萘二曱酸。通过以下的详细说明连同随附的附图，将更清晰地理解本发明的上述以及其他目的、特征和其他优势，其中图1表示用于本发明方法的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌林HN-72的16SrDNA的部分序列；图2是依据本发明实施例1第三步得到的结晶cNDA的显微照片；图3a、3b和3c是在本发明的实验实施例1中，通过向纯化的cNDA的反应液中添加碌o酸溶液并分别以50rpm、200rpm和800rpm的不同速率搅拌混合液得到的cNDA晶体的显微照片；图4a、4b和4c是在本发明的实验实施例2中，通过向纯化的cNDA的反应液中添加A充酸溶液并分别在15°C、40。C和80。C的不同温度下搅拌混合液得到的cNDA晶体的显微照片；和图5表示依据本发明的一个实施方式用于实施纯化粗萘二曱酸的方法的纯化体系。具体实施例方式以下提供了依据本发明的方法的各个步骤的更详细的解释。(i)第一歩用微生物纯化在此步骤中，使具有将2-曱酰基-6-萘甲酸转化成2,6-萘二曱酸的能力的微生物与粗萘二曱酸反应以将含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘曱酸转化成2，6-萘二曱酸。第一步包括以下子步骤l)将微生物接种在液体培养基上，振摇培养接种体，通过离心收集培养的细菌，并在生理盐水或蒸馏水中悬浮收集的细菌以使细菌活化，2)将作为基质的粗萘二甲酸(cNDA)与緩冲液混合，通过添加碱性溶液调节混合液的pH以制备用于随后纯化的反应液，和3)将在l)中制备的活性细菌与在2)中制备的反应液反应以将含在粗萘二曱酸中的2-甲酰基-6-萘曱酸转化成2,6-萘二曱酸，从而2,6-萘二曱酸的纯度提高。任何微生物(如果其具有分解2-曱酰基-6-萘曱酸的能力)都可以应用而无需任何特别的限制。属于芽孢杆菌属或假单胞菌属的微生物优选应用于本发明的方法。9最优选的是芽孢杆菌(Bacillussp.)F-1(KCTC-10342BP)、芽孢杆菌(Bacillussp.)F陽3(KCTC陽10335BP)，或假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(KCTC-10819BP)。芽孢杆菌F-l和芽孢杆菌F-3描述于韩国专利申请No.2002-0087819中，而假单胞菌菌林HN-72于2005年6月21日寸呆藏在4乍为国际寸呆藏才几构的KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB)的基因库中，保藏编号为KCTC-10819BP。在25~45"C的宽的温度范围内，优选28~35°C,这些微生物能够容易地在液体培养基(如LB或M9培养基)中培养。缓冲液的种类不特别限制。作为緩冲液，可以用例如，水、碳酸钠緩冲液(Na203/NaHC03)、甘氨酸緩冲液(甘氨酸/NaOH)、磷酸钾緩冲液(KH2P04/KOH)、磷酸钠緩冲液(Na2HP04/NaH2P04)、丁二酸缓沖液(丁二酸/NaOH)、醋酸钠緩沖液(醋酸钠/醋酸)、柠檬酸緩沖液(柠檬酸/拧檬酸钠)、焦磷酸钠緩冲液(Na4P207/HCl)、硼酸緩冲液(硼酸/NaOH)、或硼酸钠緩冲液(硼酸钠/HCl)。优选磷酸钾緩沖液(KH2P04/K0H)和硼酸钠缓冲液(硼酸钠/HC1),其pH范围为6.0-9.0。优选緩冲液的浓度为0.01~100mM。碱性溶液优选NaOH或KOH溶液，但是不限制于此。混合溶液的pH优选调节到6~10。在第二子步骤中，为了溶解cNDA,可以向混合液中另外添加有机溶剂。优选的有机溶剂的实例包括二曱基亚砜(DMSO)、N，N-二曱基曱酰胺(DMF)、N，N-二曱基乙酰胺(DMA)和四氢呋喃(THF)。在这些里，考虑到酶的活性，二甲基亚砜是最优选的。有机溶剂优选以0.01~10%的浓度添加。更优选地，不添加有才几溶剂。超过10%浓度的有机溶剂的添加导致微生物的细胞膜被溶解破坏，从而阻碍反应。在第三子步骤中，反应优选在25~50。C下进行1分钟到2小时，更优选在35~40。C进行25~40分钟。当反应温度低于25。C或高于50。C时，会导致不期望的细菌活性的显著降低。另一方面，在cNDA中的FNA含量、反应液中的cNDA浓度和完全去除FNA所需要的细菌的量之间有密切的关系。即，随着cNDA中的FNA含量和反应液中的cNDA浓度的增加，需要更大量的细菌以去除FNA。(ii)第二歩结晶在此步骤中，酸性溶液被添加到在第一步中制备的反应液中以调节反应液的pH,而后在搅拌下与反应液反应以使粗萘二曱酸结曰曰曰c更具体地，在一个配有搅拌器的反应器中，适量的酸性溶液被添加到在第一步中制备的反应液中以调节反应液的pH至期望的范围，而后保持混合液的温度在恒定水平下，混合液在持续搅拌下反应，从而将存在于无FNA的反应液中的无定形形式的cNDA在常温常压条件下结晶出来。由于此结晶过程能够在常温常压条件下生成具有100pm或更大的均一尺寸的cNDA晶体，本发明的纯化方法在生产成本和工艺过程方面在经济上是有优势的。另外，由于在各个cNDA晶体颗粒之间没有凝聚发生，本发明的纯化方法是适于实际应用的并且在最终产物的高回收率方面是有优势的。作为酸性溶液，可以应用例如，碌b酸、盐酸、冰醋酸或硝酸。硫酸或硝酸的应用是优选的，因为其导致cNDA晶体的大尺寸和高产率。也就是，硫酸或硝酸的添加能够以高产率生成具有100nm或更大的均一尺寸的cNDA晶体。反应液的pH优选调节到1~4以增加最终产物的回收率。随着反应液的pH降低，最终产物的回收率趋于从约92%增加到约99.9%。结晶过程在约4"C至约80。C下进行，优选25°C~60°C。结晶进行约l分钟到约12小时，考虑到连续处理，更优选230分钟。太短的结晶时间会导致cNDA的低结晶度，引起各个cNDA晶体颗粒之间通过聚合而发生的凝聚。同时，太长的结晶时间导致不必要的能量损失。进行cNDA结晶所需要的搅拌通常在0~1000rpm的速率下进行，优选0~400rpm。nm第三歩洗涤在此步骤中，洗涤在第二步中得到的结晶的粗萘二曱酸以去除含在其中的杂质。尽管通过使用微生物的纯化反应和结晶反应，将FNA转化成NDA并将其完全去除，但包括2-萘曱酸(NA)、曱基萘曱酸(MNA)和偏苯三酸(TLMA)在内的其他杂质还未去除。当结晶的cNDA分散在水中，在给定条件下洗涤若干次，可完全去除残留的杂质。杂质的完全去除基于在水中cNDA和杂质的溶解度的差别。此时，用于纯化cNDA的孩i生物也通过洗涤;故去除。在此步骤中，期望在反应副产物溶解于溶剂中和NDA沉淀尽可能多的状况下实现分离。分离的温度范围是100~250°C,优选150~230°C。在高于250°C下溶剂的分离导致纯化的NDA的损失增加，引起产率相当大的下降。同时，在低于IOO"C下溶剂的分离不利地导致杂质(包括NA、MNA和TLMA)的低溶解度。更特别地，结晶的cNDA分散在水中，在1~28kg/cm2的压力和100~250。C的温度下搅拌IO分钟到1小时，过滤除去水。此工序可以重复若干次以去除杂质。此时，溶剂优选用量为结晶的cNDA的重量的5~204咅。(iv)第四歩干燥在此步骤中，在特定温度下将NDA晶体(其中通过洗涤将杂质从结晶的cNDA中去除)干燥以得到纯的结晶形式的NDA。此时，干燥优选在30~200。C下进行。通过本领域内已知的传统-技术进行干燥而无需限制。本发明的方法还可以包含在第一步后和第二步前去除在第一步中使用的微生物的步骤。在cNDA纯化后和cNDA结晶前先去除孩i生物能够对改善NDA晶体的纯度和回收率有贡献。通过本领域内已知的传统技术完成微生物的去除而无需限制。例如，微量过滤器系统、连续型离心分离器或滗析器可以用于去除微生物。微量过滤器系统使用具有0.1-0.5nm孔径的过滤器，由选自陶瓷、不锈钢、聚丙烯和聚对苯二曱酸乙二酯(PET)的材料制成。另一方面，本发明提供通过纯化方法生成的纯的结晶形式的2,6-萘二曱酸。本发明的纯化方法能够以99.8%或更高的高产率生成高纯度的2,6-萘二甲酸。依据期望的应用和需要，可以改变处理条件以生成规则的或无规的结晶形式的2,6-萘二甲酸。规则结晶形式的2,6-萘二曱酸可以具有晶格结构。本发明的2,6-萘二曱酸晶体具有不小于100pm的平均粒径和均一的颗粒外形。因此，本发明的2,6-萘二曱酸晶体与乙二醇聚合生成PEN时非常适于与乙二醇形成低粘度浆液。平均粒径小于100pm的2,6-萘二曱酸晶体很难处理，当其与乙二醇混合制备PEN时，显示出弱的与乙二醇形成浆液的能力，导致增加了能量消耗。本发明的2,6-萘二曱酸晶体优选的平均粒径为100~150pm。图5表示依据本发明的一个实施方式用于实施纯化粗萘二曱酸的方法的纯化体系。参考图5,依据本发明的这个实施方案的纯化方法将更详细地解释如下。首先，将特定量的緩冲液引入反应器A，在其中粗萘二曱酸用微生物纯化。将cNDA加入到反应器中，随后，搅拌下将碱性溶液加入反应器中以调节反应液的pH。将特定量的水加入反应器以制备反应液用于随后的纯化。将活性菌加入反应液以-使其与反应液反应，同时保持反应液温度在恒定水平。通过此工序，在反应器A中，含在cNDA中的FNA转化为NDA,并能够被最终去除。当反应完成后，反应液通过单元B,在此除去用于去除FNA的微生物。如果需要，可以省略应用单元B的微生物的去除，因为微生物的去除能在下游的过滤/清洗单元F完成。将去除了微生物的反应液转移到结晶反应器C。在搅拌下将酸性溶液添加到结晶反应器C中，以进行结晶反应。在结晶反应后得到含有结晶的cNDA的浆液。该浆液用预热器D加热至约100至约250°C,而后加入到过滤/清洗单元F(在此提供一个加热器以保持浆液的温度在100-250。C)中。过滤/清洗单元F的压力保持在l~25kg/cm2。过滤/清洗单元F配有过滤器(孔径10~100,)。过滤/清洗单元F与高压过滤收集单元G连4妄。滤液从过滤/清洗单元F进入高压滤液收集单元G,固体成分用包括在过滤/清洗单元F中的过滤器过滤。将在溶剂加热/供应单元E中预热的水(IOO~250。C)提供至过滤/清洗单元F。当在过滤/清洗单元F中持续搅拌给定的时间后，将二级滤液加进高压滤液收集单元G中。如果需要，清洗步骤重复一次或两次。清洗后保留的纯的NDA与预热的水(IOO~250。C)混合以形成浆液。将所述浆液经过浆液流出线路送至高压浆液收集单元H。当高压浆液收集单元H的压力降至常压后，含有纯的NDA的浆液被转移至粉末分离单元I，在此将溶剂从浆液中去除，随后在干燥单元J中干燥从而只收集纯的NDA。在下文中，参考下述实施例将对本发明的构成和效果进行详细解释。然而，这些实施例的目的是举例说明，不解释为对本发明的范围的限制。实施例实施例1第一步微生物筛选(l)菌株的分离土壤采样自位于韩国京畿道的废水处理厂、储油库和加油站。将每个土壤样品5g添加至50ml的0.85%生理盐水溶液中，振摇并过滤得到滤液。滤液稀释到适当的水平，涂在含有cNDA的LB固体培养基上，在3(TC的培养箱中培养。培养结果，分离出200种微生物。依据如下工序，首先仅筛选出能分解与FNA在相同位置上有曱酰基的2-萘曱醛的微生物。首先，将200种微生物各自接种到lml的LB液体培养基上，在200rpm和30。C下振摇培养16小时。离心分离培养物收集相应的细菌。将收集到的细菌悬浮在lml的0.85%生理盐水中。分别地，将0.2ml的2-萘曱醛溶液(50pg/ml于DMSO中)加入到含有3ml的(3-NAD溶液(0.25mg/ml于100mMKH2P04-KOH(pH8.0)溶液中)的样品试管中，并且将0.2ml的DMSO添力口到含有3ml的(3-NAD溶液(0.25mg/ml于100mMKH2P04-KOH(pH8.0)溶液中)的空白试管中。将试管分别置于分光光度计中，稳定3分钟。当分别添加0.05ml微生物悬浮液于样品试管中后5分钟，在340nm处测定混合物的吸收度。比较样品试管中的混合物的吸收度值与空白试管的吸收度值以确定2-萘曱醛的曱酰基到羧基的氧化。结果，分离出四种具有最小吸收度差异为0.1的微生物。将四种首先筛选出的微生物各自接种在LB液体培养基上，在200rpm和3(TC下振摇培养16小时。离心分离培养物收集相应的细菌，用0.85%生理盐水洗涤，并与具有表1中所示组成的溶液在30°C的反应浴中反应3小时。反应产物用高效液相色i普(HPLC)分析以最终筛选具有高的去除FNA能力的菌抹。HPLC分析在表2所示的条件下进行。HPLC分析显示被称为HN-72的菌抹具有高的分解FNA妙+B匕刀o表1:用于最终篩选的反应液<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(2)微生物的鋈别对在(l)中分离的菌;f朱的16SrDNA进行部分测序用以鉴别菌林。结果显示于图l(SEQIDNO:1)依据此结果，鉴别出菌抹为属于假单胞菌属的细菌。菌抹被称为假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72并于2005年6月21日保藏在4乍为国际1呆藏才几才勾的KoreaResearchInstituteofBioscienceandBiotechnology(KRIBB)的基因库中，保藏编号为KCTC-10819BP。确定出菌抹(假单胞菌HN-72)的形态学和生物化学特征，其结果概述于表3和表4。表3:脅I单月包菌(Pseudomonassp.)HN-72的净争4正试验特征革兰氏染色阴性细胞形态学杆状最佳生长温度25~30。C氧化酶阳性脱硝作用阴性明胶降解阴性淀粉降解阴性儿茶酚降解阴性表4:l艮单月包菌(Pseudomonassp.)HN-72对石友源的应用<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>第二步用樣t生物纯化cNDA将在第一步中筛选的假单胞菌(Pseudomonassp.)菌抹HN-72接种在300ml的LB液体培养基上，并在30。C下在培养箱中以200rpm振摇培养16小时。离心分离培养物以收集细菌。收集到的细菌用0.85%的生理盐水溶液洗涤，并悬浮在5ml的0.85%生理盐水溶液中以活化细菌。将50L的50mM磷酸钾緩冲液添加入反应器A中，在此cNDA用微生物纯化。将1~10kg的cNDA添加至反应器A中，而后在搅拌下向其中添加KOH或NaOH以调节反应液的pH至8.0。将水添加至混合溶液中以制备用于随后纯化的反应液(cNDA浓度1~10%,cNDA中的FNA含量0.01~4%)。将0.2-10kg/L的活性细菌添加至反应液中以4吏其与反应液在40。C下反应10分钟到2小时，其间保持反应液温度在40°C。反应结果，在反应器A中，含在cNDA中的FNA被转化为NDA。第三步纯化的cNDA的结晶将100L在第二步中制备的纯化的cNDA溶液转移到配有搅拌器的结晶反应器C中。在将硫酸溶液添加入结晶反应器中以调节纯化的cNDA的溶液的pH至3.0后，结晶反应在50rpm的速率下搅拌进行30分钟，同时保持反应温度为40°C。当结晶完成后，结晶的cNDA的分析用显微镜和粒度分析仪进行。分析结果显示cNDA令人满意地发生了结晶而没有任何个别的晶体颗粒间的凝聚。测得结晶的cNDA具有的平均粒度为约160.7pm。图2显示结晶的cNDA的显微照片。第四歩结晶的cNDA的洗涤和千燥在第三步中制备的结晶的cNDA的浆液用预热器D加热至超过220°C,加入到过滤/清洗单元F中，在24.7kg/cm2的压力和225°C的温度下搅拌30分钟，而后过滤。滤液(即水)排入高压滤液收集单元G。将来自溶剂加热/供给单元E的225。C的100L的水添加至过滤/清洗单元F中，在与上述相同条件下搅拌30分钟，而后过滤。滤液(即水)排入高压滤液收集单元G。此工序总共重复两次。将100L来自溶剂加热/供给单元E的225。C的水添加至过滤/清洗单元F中，搅拌30分钟以使纯的NDA均匀地分散。含有纯的NDA的浆液被转移到高压浆液收集单元H中。当高压浆液收集单元H的压力降到常压后，所述浆液被转移到粉末分离单元I(即滗析器)中，在此从浆液中去除水，随后在干燥单元J中在120。C干燥以收集纯的结晶形式的NDA。实施例2用与实施例1相同的方式收集纯的结晶形式的NDA,不同之处在于微生物在第二步后和第三步前先从在第二步中制备的纯化的cNDA溶液中用聚丙烯过滤器(孔径0.2pm)去除。实施例3和4用与实施例1相同的方式收集纯的NDA结晶，不同之处在于分别用芽孢杆菌(Bacillussp.)F-l(KCTC-10342BP)和芽孢杆菌(Bacillussp.)F-3(KCTC-10335BP)代替假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(KCTC-10819BP)。实施例5和6用与实施例2相同的方式收集纯的NDA结晶，不同之处在于分别用芽孢杆菌(Bacillussp.)F-l(KCTC-10342BP)和芽孢杆菌(Bacillussp.)F-3(KCTC-10335BP)代替假单胞菌(Pseudomonassp.)HN-72(KCTC國10819BP)。分析未纯化的cNDA、第二步(纯化步骤)后得到的纯化的cNDA的溶液和在实施例1中第四步(洗涤/干燥步骤)后得到的纯的结晶形式的NDA中的各组分的含量。分析结果见表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>从表5的结果看，能够确定用微生物的纯化方法能够基本上完全去除含在cNDA中的杂质。特别地，以100%的产率把FNA转化为NDA。因此，生成了高纯度的2,6-萘二曱酸，其纯度为99.9%或更高。为了确定用微生物纯化cNDA的最佳反应条件，特别是纯化的cNDA的溶液的结晶条件，在表6-8所示的不同反应条件下进行了一系列实验，比较和分析在依据不同反应条件的各自的结晶反应后得到的cNDA晶体的平均粒径和回收率。实验实施例1:不同种类的酸和搅拌速率下的结晶反应将100ml在实施例1的第二步中制备的纯化的cNDA的溶液添加到反应器中，每个反应器都配有搅拌器，而后将硫酸、盐酸、冰醋酸和硝酸溶液添加至反应器中以调节纯化的cNDA的溶液的pH至3.0。以0、50、100、200、400、800和1000rpm的不同速率搅拌混合溶液。此时，混合溶液的温度保持在25°C。在这些反应条件下，结晶反应进行30分钟以得到cNDA晶体。当结晶完成后，用显微镜和粒度分析仪进行cNDA晶体的分析。分析结果显示cNDA令人满意地产生结晶而未有任何个别晶体颗粒间的凝聚。图3a、3b和3c显示通过添加硫酸溶液至纯化的cNDA的反应液并且分别以50rpm、200rpm和800rpm的不同速率搅拌下得到的cNDA晶体的显微照片。在各自条件下测定得到的cNDA晶体的平均粒径，结果见表6。由表6所示的数据可见，当添加硫酸或盐酸溶液并在0~400rpm的速率下搅拌后得到的cNDA晶体显示更好的结果。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实验实施例2:不同种类的酸和温度下的结晶反应重复实验实施例1的工序，不同之处在于混合溶液以50rpm的速率在4、15、25、40、60和80。C的不同反应温度下搅拌。当结晶完成后，用显微镜和粒度分析仪进行cNDA晶体的分析。分析结果显示cNDA令人满意地结晶而未有任何个别晶体颗粒间的凝聚。图4a、4b和4c显示通过添加石克酸溶液至纯化的cNDA的反应液并分别在15°C、40。C和80。C的不同反应温度搅拌下得到的cNDA晶体的显微照片。测定在各自条件下得到的cNDA晶体的平均粒径，结果见表7。由表7所示的数据可见，当添加硫酸或盐酸溶液并在40。C的反应温度下搅拌后得到的cNDA晶体显示更好的结果。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>值下的回收率重复实验实施例l的工序，不同之处在于混合溶液在50rmp、40。C的反应温度和1、2、3、4、5和6的不同pH值下搅拌。当结晶反应进行30分钟后，等量的反应液分别从各个反应器中取出。测定cNDA晶体的回收率，结果见表8。表8显示cNDA晶体的回收率在pH不高于3时高于99%。cNDA晶体的回收率显示了随着pH降低而升高的趋势。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>工业应用由于在各个适合的条件下用能将FNA转化为NDA的微生物纯化粗萘二曱酸，因此能在工业规模上以有利于环境的方式有利地生成高纯度的结晶2,6-萘二曱酸。权利要求1.一种用微生物纯化粗萘二甲酸的方法，该方法包含以下步骤(a)使具有将2-甲酰基-6-萘甲酸转化成2，6-萘二甲酸的能力的微生物与粗萘二甲酸反应以去除包含在粗萘二甲酸中的2-甲酰基-6-萘甲酸；(b)向步骤(a)中制备的反应液中加入酸性溶液以调节反应液的pH，并且通过搅拌使混合液反应以使粗萘二甲酸结晶；(c)洗涤结晶的粗萘二甲酸以去除含在结晶的粗萘二甲酸中的杂质；和(d)干燥洗涤后的产物以得到纯的结晶形式的2，6-萘二甲酸。2.依据权利要求1的方法，其中步骤(a)包括以下子步骤1)将微生物接种在液体培养基上，振摇培养接种体，通过离心收集培养的细菌，并在生理盐水或蒸馏水中悬浮收集的细菌以使细菌活化；2)将作为基质的粗萘二甲酸(cNDA)与緩冲液混合，通过添加碱性溶液调节混合液的pH以制备用于随后纯化的反应液；和3)将在l)中制备的活性细菌与在2)中制备的反应液反应以将含在粗萘二曱酸中的2-曱酰基-6-萘曱酸转化成2,6-萘二曱酸，从而提高2,6-恭二甲酸的纯度。3.依据权利要求2的方法，其中所述微生物是属于芽孢杆菌属或假单胞菌属的细菌。4.依据权利要求3的方法，其中所述微生物是芽孢杆菌F-l(KCTC-10342BP)、芽孢杆菌F-3(KCTC-10335BP)或假单胞菌HN-72(KCTC-10819BP)。5.依据权利要求2的方法，其中所述緩冲液从由水、碳酸钠緩沖液(Na203/NaHC03)、甘氨酸緩冲液(甘氨酸/NaOH)、磷酸钾緩沖液(KH2P04/KOH)、磷酸钠緩沖液(Na2HP04/NaH2P04)、丁二酸緩冲液(丁二酸/NaOH)、醋酸钠缓沖液(醋酸钠/醋酸)、柠檬酸緩冲液(柠檬酸/杼檬酸钠)、焦磷酸钠緩沖液(Na4P207/HCl)、硼酸緩冲液(硼酸/NaOH)、硼酸钠緩冲液(硼酸钠/HC1)以及它们的混合物组成的组中选出；并且所述緩沖液的浓度为0.01~100mM。6.依据权利要求2的方法，其中所述碱性溶液为NaOH或KOH溶液。7.依据权利要求2的方法，其中所述混合液还包含有机溶剂。8.依据权利要求7的方法，其中所述有机溶剂从由二曱基亚砜、N,N-二甲基曱酰胺、N,N-二曱基乙酰胺、四氬呋喃以及它们的混合物组成的组中选出；并且所述有机溶剂以0.01~10%的浓度添力口。9.依据权利要求2的方法，其中所述反应在25~50"C下进行1分钟~2小时。10.依据权利要求1的方法，其中所述酸性溶液从由硫酸、盐酸、冰醋酸、硝酸以及它们的混合物组成的组中选出。11.依据权利要求1的方法，其中所述反应液的pH调节到1~4。12.依据权利要求1的方法，其中所述反应在4。C80。C下进行1分钟~12小时。13.依据权利要求1的方法，其中所述搅拌以0-1000rpm的速率进行。14.依据权利要求1的方法，其中步骤(c)通过将结晶的cNDA分散在水中，在1~28kg/cm2的压力和100~250。C的温度下搅拌10分钟-l小时，过滤结晶的cNDA以除去水，并重复上述工序来进行。15.依据权利要求1的方法，其中所述干燥在3020(TC下进行。16.依据权利要求1的方法，还包含在步骤(a)后和步骤(b)前除去在步骤(a)中使用的微生物的步骤。17.依据权利要求16的方法，其中微生物的去除通过微量过滤器系统、连续型离心分离器或滗析器完成。18.依据权利要求17的方法，其中微量过滤器系统使用具有0.1~0.5pm孔径的并且由选自陶瓷、不锈钢、聚丙烯和聚对苯二曱酸乙二酯(PET)的材料制成的过滤器。19.依据权利要求1的方法生成的纯的结晶形式的2,6-萘二曱酸。20.依据权利要求19的2,6-萘二甲酸，其中该2,6-萘二曱酸是规则的或无规的结晶形式。21.依据权利要求19的2,6-萘二甲酸，其中规则的结晶形式为晶格结构。22.依据权利要求19的2,6-萘二甲酸，其中该2，6-萘二曱酸晶体的平均粒径不小于100|im。全文摘要本发明公开了一种用微生物纯化粗萘二甲酸的方法和用该方法得到的结晶形式的2，6-萘二甲酸。依据此纯化方法，粗萘二甲酸通过使具有将2-甲酰基-6-萘甲酸转化为2，6-萘二甲酸的能力的微生物与粗萘二甲酸反应，在特定条件下向反应液中添加酸性溶液，搅拌此混合溶液使粗萘二甲酸结晶，洗涤结晶的粗萘二甲酸，并且干燥洗涤后的产物来纯化，从而得到纯的结晶形式的2，6-萘二甲酸。该纯化方法能有利地在工业规模上以环境友好的形式生产高纯度的结晶2，6-萘二甲酸。文档编号C07C51/42GK101321718SQ200680045659公开日2008年12月10日申请日期2006年2月14日优先权日2005年12月12日发明者崔龙福,权益铉,李钟桓,金东诚,金成均申请人:株式会社晓星