专利名称：虾青素的保存稳定性高的绿藻提取物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有具有高保存稳定性的虾青素的绿藻提取物。
背景技术：
已知虾青素是红色的类胡萝卜素的一种，具有很强的抗氧化作用。为此，作为鱼类等的色染饲料、食用色素、化妆品、健康食品等使用。
虾青素除了由化学合成，也来自天然产物。来自天然产物的虾青素，例如可以从磷虾、甜虾等的虾类、红发夫酵母、藻类等提取。但是，由于磷虾、甜虾、蟹等的甲壳类、红发夫酵母等的虾青素含量低，从这些中提取虾青素的收率非常低。为此，一般从虾青素含量高的藻类、例如雨生红球藻属的绿藻中提取。
虾青素对热、氧、光等不稳定，不适合直接保存藻体的培养液。为此，通常将含有虾青素的藻体以干燥形态保存(例如，参考特开平7-8212号公报和特开2004-129504号公报)。但是，这些例如特开平7-8212号公报和特开2004-129504号公报中，没有研究在干燥时虾青素本身对热、氧、光的稳定性。例如，根据本发明人的研究，在使用特开2004-129504号公报中所记载的干燥方法，仅使藻体干燥的情况下，藻体中的虾青素分解，虾青素含量降低。
或者，虾青素作为从藻体的提取物保存。由于虾青素的不稳定性，其提取在藻体培养后马上进行的情况居多(例如，参照特开平9-111139号公报和特开昭53-38653号公报)。从绿藻提取虾青素，利用有机溶剂萃取法、超临界萃取法等进行。
使用有机溶剂从雨生红球藻类提取虾青素时，提出使用乙醇、丙酮、或者己烷作为溶剂。将得到的提取物用作食品添加剂时，必须考虑提取物中残留溶剂的浓度。另外，有在雨生红球藻类培养液中混入营养源、化学药品类、叶绿素类、磷脂类、固醇类等的问题(参照特开2004-41147号公报)。
特开2004-41147号公报中，以避免通过有机溶剂萃取法提取虾青素的缺点为目的，研究了用超临界萃取法提取虾青素的方法。通过适当的选择辅助溶剂，用超临界萃取法提取的虾青素中，几乎没有混入在使用有机溶剂萃取法时不可避免的上述磷脂、蛋白质、叶绿素、固醇等。但是，与有机溶剂萃取法相比，成本提高，不适用于工业生产。
而且，不论利用哪一种方法进行提取，由于虾青素对热、氧、光等不稳定，因此在以往的方法中，优选提取物在氮环境下、避光、低温操作。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高绿藻提取物中的虾青素的保存稳定性的方法，以及含有具有高保存稳定性的虾青素的绿藻提取物。
本发明是基于发现通过在含有虾青素的绿藻提取物中，调整以往认为是杂质的磷脂使之以适当的水平含有，可使虾青素更加稳定化。
本发明提供一种绿藻提取物，含有换算成游离态(非酯化物)时浓度为0.5～20质量％的虾青素和至少一种磷脂，该磷脂的浓度为0.1～15质量％。
在某实施方式中，上述磷脂的浓度为1质量％以上、2质量％以上或2.5质量％以上，或者上述磷脂的浓度为10质量％以下、7质量％以下、或5质量％以下。
在一个实施方式中，所述绿藻提取物为属于雨生红球藻属的单细胞绿藻类的提取物。
在进一步的实施方式中，所述绿藻提取物为绿藻雨生红球藻的提取物。
在其他的实施方式中，所述磷脂为磷脂酰胆碱。
本发明还提供提高绿藻提取物中虾青素的保存稳定性的方法，该方法包括绿藻提取物至少含有一种磷脂的测定工序；本来不含至少一种磷脂时，向该绿藻提取物中添加至少一种磷脂的工序；以及将绿藻提取物的磷脂浓度调整到0.1～15质量％的工序，其中，该绿藻提取物，含有换算成游离态时浓度为0.5～20质量％的虾青素。
本发明还提供含有上述任意的绿藻提取物的食品。
发明效果根据本发明，通过调整含有一定浓度的虾青素的绿藻提取物中的磷脂的量使之为一定的比例，就可以提高绿藻提取物中的虾青素的保存稳定性。因此，可以将虾青素作为提取物长期保存，由于没有必要在低温下保存，因此提取物的操作也变得容易。
图1是表示在60℃保存一周后本发明的绿藻提取物中的虾青素的残存率和磷脂(卵磷脂)浓度的关系的图。
图2是表示在60℃保存一周后稀释的本发明的绿藻提取物中的虾青素的残存率和磷脂(卵磷脂)浓度的关系的图。
具体实施例方式
(绿藻)本发明使用的绿藻只要是有能力生产虾青素的绿藻即可，没有特别限制。例如，优选使用属于雨生红球藻(Haematococcus)属的单细胞藻类。作为优选的绿藻，可以列举雨生红球藻(H.pluvialis)、湖泊红球藻(H.lacustris)、兔球藻(H.capensis)、ヘマトコツカス·ドロエバケンシ(H.droebakensi)、ヘマトコツカス·ジンバブエンシス(H.zimbabwiensis)等。
作为雨生红球藻(H.pluvialis)，可以列举保藏在独立行政法人国立环境研究所中的NIES144株、保藏于美国德克萨斯大学藻类保存设施中的UTEX 2505株，在丹麦的哥本哈根大学的Scandinavian CultureCenter for Algae and Protozoa，botanical Institute中保存的K0084株等。
作为湖泊红球藻(H.lacustris)可以列举保藏于ATCC的ATCC30402株和ATCC30453株，保藏于东京大学分子细胞生物学研究所的IAM C-392株、IAM C-393株、IAM C-394株和IAM C-339株或者UTEX 16株以及UTEX 294株等。
作为兔球藻(H.capensis)可以列举UTEX LB 1023株等。
作为ヘマトコツカス·ドロエバケンシ(H.droebakensi)可以列举UTEX 55株。
作为ヘマトコツカス·ジンバブエンシス(H.zimbabwiensis)，可以列举UTEX LB 1758株等。
在本发明中优选使用雨生红球藻。
(绿藻的培养)
含有虾青素的绿藻，通过在能够生产虾青素的条件下培养上述绿藻而得到。虾青素的生产条件没有特别限制。例如，可以列举在光照射下，不断通入二氧化碳，在含有氮源和微量金属类的培养基中使藻体的营养细胞增殖后，通过对增殖后的藻体单独或组合施以由光照引起的物理应激、由营养饥饿引起的生物学应激、由于过氧化氢和/或铁化合物的添加引起的化学物质应激等的应激，将营养细胞进行包囊化的方法。另外，也可以添加醋酸等作为碳源进行暗培养使之营养增殖，接着进行包囊化。培养的绿藻经离心分离而回收，根据需要水洗后提供给以下详述的提取工序。
(绿藻提取物)本发明中的“绿藻提取物”是指上述绿藻中含有的油分，是没有进行虾青素的浓缩、提纯的油分。这里的浓缩、提纯是指利用色谱法等本领域人员通常用于进行分离、提纯的方法，从提取的油分中进一步选择性地得到虾青素。
提取含有虾青素的油分的方法没有特别的限制，可以使用本领域人员通常使用的方法。例如，对如上述培养的绿藻，(1)在通过机械破碎(例如，珠磨式等)进行破碎的同时或破碎后，经溶剂萃取，(2)在机械破碎后通过压榨提取，以及(3)组合上述(1)和(2)来进行提取。或者，虾青素也可以使用超临界萃取法进行提取。作为在提取中使用的溶剂，可以列举氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇等的有机溶剂。在提取中利用溶剂时，提取后，用本领域人员通常使用的方法除去溶剂。
在虾青素的提取中一般使用的有机溶剂萃取中，虾青素和藻体中存在的其他成分，例如中性脂质一起被萃取出来。得到的绿藻提取物中的虾青素的浓度根据萃取溶剂的种类、萃取操作等而不同，通常换算成游离态时约为0.5～20质量％，更常见的为约0.5～18质量％。需要说明的是，绿藻提取物中的虾青素根据培养条件，以虾青素脂肪酸单酯为主要成分。在全部虾青素中，虾青素脂肪酸二酯的浓度为约15～约30质量％，游离的虾青素浓度为1质量％以下的情况居多。虾青素能以酯化物和游离态存在，如本发明所述，虾青素质量的比例通过换算成游离态来表示。
(磷脂)在本发明中，磷脂是指选自磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和鞘磷脂中的一种以上的磷脂。这些的来源没有特别的限定，既可以是来自天然产物，也可以是化学合成的。本发明中在添加以下说明的磷脂时，适合采用磷脂酰胆碱(卵磷脂)。磷脂可以存在于藻体中，并与虾青素一起被提取出来，或者也可以通过其他途径向绿藻提取物中添加。
(提高绿藻提取物中的虾青素的保存稳定性)本发明中提高绿藻提取物中的虾青素的保存稳定性的方法，包括绿藻提取物至少含有一种磷脂的测定工序；本来不含至少一种磷脂时，向该绿藻提取物中添加至少一种磷脂的工序；以及将该绿藻提取物中的磷脂浓度调整到0.1～15质量％的工序。
本发明的绿藻提取物中调整的磷脂的浓度为0.1质量％以上、通常为0.2质量％以上、优选为0.3质量％以上、进一步优选为0.45质量％以上、更优选为1质量％以上、更加优选为2质量％以上、进一步更优选为2.5质量％以上、或者调整的磷脂的浓度为15质量％以下、优选为10质量％以下、更优选为7质量％以下、更加优选为5质量％以下。绿藻提取物中的磷脂的比例(或者是浓度)过高时，在低温下提取物中有产生沉淀的情况，因此不优选。
磷脂的浓度调整好的绿藻提取物中的虾青素的浓度换算成游离态时为0.5质量％以上、优选为2质量％以上、更优选为3质量％以上、进一步优选为5质量％以上、更加进一步优选为7质量％以上，或者为约18质量％以下、优选为15质量％以下、更优选为12质量％以下。
绿藻提取物中的虾青素(换算成游离态)和磷脂的比例以质量比计为1∶30～1∶0.005，优选为1∶5～1∶0.05、更优选为1∶3～1∶0.1。
经超临界萃取法得到的绿藻提取物中，几乎不含有磷脂。为此，通过向绿藻提取物中添加适量的磷脂，调整磷脂的比例。另一方面，经溶剂萃取得到的绿藻提取物，由于在绿藻中存在的磷脂可以与虾青素一起被萃取出来，含有磷脂的情况居多。因此，根据向绿藻提取物中预先含有磷脂的量(或者浓度)，适当决定应当添加的磷脂的量。在任何一种情况中，调整最终的磷脂的比例使之在上述范围内。本发明中确认的绿藻提取物中的磷脂的浓度为适宜的情况也包含在磷脂比例的调整中。因此，也可以通过适宜选择萃取溶剂，得到分别以本发明所期望的浓度含有虾青素和磷脂的绿藻提取物。
为了增加经溶剂萃取得到的绿藻提取物中含有的磷脂的浓度，优选在溶剂中将藻体破碎成更小。通过在溶剂中将藻体破碎得更细小，构成细胞膜的磷脂变得更容易萃取。藻体的破碎可以使用珠磨机、均质机等装置。萃取使用的溶剂优选单独使用乙醇，或者组合使用乙醇和其以外的有机溶剂。
根据本发明如上所述的方法，可以得到含有具有高保存稳定性的虾青素的绿藻提取物。该绿藻提取物在60℃、避光下保存一周时，该绿藻提取物中的虾青素至少可以残存为初期浓度的50％、优选为75％、更优选至少为80％，更加优选至少为85％，进一步优选至少为90％。这样，适当调整了磷脂的浓度的绿藻提取物，抑制了对热不稳定的虾青素的分解，提高绿藻提取物的保存稳定性。
磷脂不仅是生物体的成分，而且是作为食品添加剂、乳化剂以及食品使用的物质。为此，即使绿藻提取物中存在一种以上的磷脂，也没有特别的问题，保存后也可以不除去磷脂。
(含有绿藻提取物的食品，该绿藻提取物含有具有高保存稳定性的虾青素)本发明的食品，含有将磷脂的浓度调整至一定范围的绿藻提取物。这样的绿藻提取物，可以直接作为食品而摄取，或者例如可以用适当的植物油等稀释成为含有一定的浓度的虾青素的食品，以使作为食品的摄取量容易调节。这时，也可以进一步添加磷脂，提高虾青素的保存稳定性。可以适宜地将保存稳定性提高的绿藻提取物直接或稀释后加工成胶囊剂的形态。或者，使绿藻提取物与乳化剂或增溶剂一起分散或溶解于水溶液中，可以作为饮料提供。
实施例以下列举使用雨生红球藻K0084株的实施例说明本发明，但本发明不被本实施例所限制。需要说明的是，在本实施例中，虾青素量、磷脂量、和水分量用以下的方法测定。
(虾青素量的测定)绿藻提取物中的虾青素量，用以下的方法测定。首先，将规定量的绿藻提取物用DMSO进行适当稀释之后，在492nm下测定吸光度，用以下的式子求出稀释液中的虾青素浓度(换算成游离态)，从该值求出稀释前的提取物中的虾青素浓度。
虾青素浓度(质量％)＝(A*100*F)/(W*2085)这里，A为稀释液在492nm下的吸光度(光路长1cm)、F为稀释液的稀释倍数、以及W为稀释液的质量(g)。
(磷脂(卵磷脂)量的测定)利用对磷定量时一般所使用的钼蓝法(例如，《卫生试验法·注解2005》(日本药学会编，金原出版)中记载的用磷钼酸的磷定量法)得到的测定值(磷量)，乘以26.03后得到值作为卵磷脂量。
(水分量的测定)水分量利用常压干燥法(例如，《食品卫生检查指南理化学编》(厚生劳动省主编，社团法人日本食品卫生协会，2005年)中记载)测定。亦即，将称量容器和盖子一起放入调节至一定温度的恒温干燥机中，加热1小时后移入干燥器中。放冷，当称量容器的温度达到室温后，直接称重至0.1mg单位。反复进行加热、放冷、和称重的操作，直到达到恒重(W0g)。接着，迅速取试样1～2g，铺平于称量容器上，盖上盖子，准确称重(W1g)。错开盖子将称量容器放入恒温干燥机中。恒温干燥机达到105℃之后，干燥3小时，在干燥机中迅速将称量容器盖上盖子，移入干燥器中放冷。达到室温之后，直接称重(W2g)。试样中的含水量用以下的式子求出。
试样中的水分(％)＝(W1-W2)/(W1-W0)×100实施例1绿藻提取物的制备-1使用生产虾青素的雨生红球藻K0084株(以下，仅称为K0084株)。在1.5L容积的光径为25mm的密闭式扁平培养瓶中，如下表1所示加入具有成分的MBG-11培养基1L，接种K0084株到培养基中使初始浓度达到0.6g/L。
表1
以600ml/分钟的速度(即，以0.6vvm)通入含有3体积％CO2的气体，培养温度为25℃，pH调整为6～8之间，在以下所示的光照条件下培养K0084株5天。光照使用白色荧光灯(松下电器产业株式会社制，FL40SSW/37)作为光源。调整光照强度，使之用LICOR-190SA平面光量子感测器测定培养槽的受光方向的光合成有效光量子流密度(PPFD)为100μmol-p/m2s。培养后的K0084株，由绿色变为茶色～茶褐色，确认K0084株已经包囊化。
接着，向和上述同样的扁平培养瓶中加入相同培养基(MBG-11培养基)，初始浓度为0.6g/L，接种包囊化后的K0084株，在和上述相同的培养条件下培养200小时。
将得到的绿藻经离心回收，水洗，放入珠磨机。加入己烷，用珠磨机破碎5分钟。这样，通过在溶剂中将绿藻破碎变小，作为细胞膜成分的卵磷脂被更多的提取出来。将得到的混合物用离心机分为上清和沉淀，回收上清。向沉淀中再次加入己烷，反复和上述同样的操作，直至沉淀的颜色几乎完全变为白色。将回收后的己烷相合并，蒸馏除去己烷，得到绿藻提取物。得到的绿藻提取物中的虾青素的浓度换算成游离态为9质量％，磷脂浓度为0.9质量％，水分量为0.2质量％。
实施例2磷脂含有量的研究-1向上述实施例1中得到的绿藻提取物(磷脂0.9质量％，虾青素9质量％)中，分别添加磷脂(来自大豆卵磷脂、和光纯药工业株式会社制)至浓度为2.7质量％、4.5质量％、10质量％、和15质量％，制备试样。将各试样各约500mg分别装入2个10ml容积的管形瓶，如上述测定虾青素的初期浓度。接着，将上述放入设定为60℃的恒温器中。保存一周后，再次测定虾青素的浓度，算出残存率。结果如图1所示。
由图1可知，当绿藻提取物以2.7质量％的比例含有磷脂时，即使在60℃的严酷条件下保存1周，仍有90％的虾青素残存，当绿藻提取物以0.9质量％的比例含有磷脂时，至少有75％的虾青素残存。特别地，可知向绿藻提取物中追加磷脂的情况下，虾青素的残存率非常高。
实施例3磷脂含有量的研究-2将上述实施例1得到的绿藻提取物的一部分用大豆油(日清奥利友株式会社制)稀释至2倍，得到换算成游离态以4.5质量％的浓度含有虾青素的稀释提取物。向稀释后的绿藻提取物(磷脂0.45质量％)中分别添加磷脂(来自大豆卵磷脂，和光纯药工业株式会社制)至浓度为0.9质量％、2.7质量％、4.5质量％、10质量％、和15质量％，制备试样。另外，将上述实施例1得到的绿藻提取物的一部分用大豆油稀释至3倍和9倍，得到各自的磷脂浓度为0.3质量％(虾青素3质量％)、和0.1质量％(虾青素1质量％)的稀释提取物。将各试样各约500mg分别装入2个10ml容积的管形瓶，如上述测定虾青素的初期浓度。接着，将上述放入设定为60℃的恒温器中。保存一周后，再次测定虾青素的浓度，算出残存率。结果如图2所示。
由图2可知，当绿藻提取物以0.45质量％的比例含有磷脂时，即使在60℃的严酷的条件下保存1周，仍有约80％以上的虾青素残存。另一方面，磷脂浓度越低，虾青素的残存率越低。需要说明的是，对换算成游离态以12质量％的比例含有虾青素的绿藻提取物进行同样的试验时，得到同样的结果。
比较例1对不含磷脂的试样中的虾青素稳定性的研究将经过和上述实施例1同样的操作培养得到的包囊化的K0084株，经离心回收。将5g干燥藻体和等量的硅藻土混合，用乳钵破碎，用超临界CO2萃取装置Spe-ed SFE(朝日ライフサイエンス株式会社)进行超临界萃取。萃取在压力为400bar，萃取温度为50℃，二氧化碳流量为1L/分钟下供给CO2。得到的超临界萃取物中的虾青素的浓度换算成游离态为30质量％，磷脂浓度在检测限(0.01质量％)以下。
将得到的超临界萃取物各约500mg分别装入2个10ml容积的管形瓶，如上述测定虾青素的初期浓度。接着，将上述放入设定为60℃的恒温器中。保存一周后，再次测定虾青素的浓度。其结果可知，虾青素的残存率为0.2％，该提取物中虾青素的稳定性非常差。
实施例4对于UV照射稳定性的研究将上述得到的绿藻提取物的一部分用橄榄油(日清奥利友株式会社制)稀释至2倍，得到含有换算成游离态时浓度为4.5质量％的虾青素的稀释提取物。向绿藻提取物(磷脂0.9质量％，虾青素9质量％)和稀释提取物(磷脂0.45质量％，虾青素4.5质量％)中各加入磷脂至其浓度为0.9质量％、2.7质量％、4.5质量％、10质量％、和15质量％，制备试样。将各试样各约500mg分别装入2个10ml容积的管形瓶。接着，将这些管形瓶放在UV照射装置(台式照射装置DT-35LPアト一株式会社制)上，在365nm下照射一周。保存一周后，测定虾青素的浓度。其结果可知，在添加磷脂的情况下虾青素的残存率都高(残存为约80％以上)，显示出与上述实施例2和3同样的趋势。
实施例5绿藻提取物的制备-2除了使用乙醇代替己烷作为萃取溶剂，进行与和上述实施例1同样的操作，得到绿藻提取物。得到的绿藻提取物中的虾青素浓度换算成游离态为8.1质量％，磷脂浓度为1.7质量％，水分量为0.3质量％。接着，放入设定为60℃的恒温器中保存一周后，再次测定虾青素的浓度。其结果可知，虾青素的残存率高(85％)。
产业上的利用可能性根据本发明，可以提供一种通过将绿藻提取物中的磷脂的浓度调整到特定的水平而含有具有高保存稳定性的虾青素的绿藻提取物。因此，虾青素作为提取物可以长期保存，由于没有必要在低温下保存，因此操作也变得容易。
权利要求
1.一种绿藻提取物，含有换算成游离态时浓度为0.5～20质量％的虾青素和至少一种磷脂，该磷脂的浓度为0.1～15质量％。
2.如权利要求1所述的绿藻提取物，其中，所述磷脂的浓度为1质量％以上。
3.如权利要求2所述的绿藻提取物，其中，所述磷脂的浓度为2质量％以上。
4.如权利要求3所述的绿藻提取物，其中，所述磷脂的浓度为2.5质量％以上。
5.如权利要求1～4中任一项所述的绿藻提取物，其中，所述磷脂的浓度为10质量％以下。
6.如权利要求5所述的绿藻提取物，其中，所述磷脂的浓度为7质量％以下。
7.如权利要求6所述的绿藻提取物，其中，所述磷脂的浓度为5质量％以下。
8.如权利要求1～7中任一项所述的绿藻提取物，是属于雨生红球藻属的单细胞绿藻类的提取物。
9.如权利要求8所述的绿藻提取物，为绿藻雨生红球藻的提取物。
10.如权利要求1～9中任一项所述的绿藻提取物，其中，所述磷脂为磷脂酰胆碱。
11.一种提高绿藻提取物中的虾青素保存稳定性的方法，包括绿藻提取物至少含有一种磷脂的测定工序；本来不含至少一种磷脂时，向该绿藻提取物中添加至少一种磷脂的工序；以及将该绿藻提取物的磷脂浓度调整到0.1～15质量％的工序，其中，该绿藻提取物含有换算成游离态时浓度为0.5～20质量％的虾青素。
12.一种含有如权利要求1～10中任一项所述的绿藻提取物的食品。
全文摘要
本发明提供一种提高绿藻提取物中的虾青素保存稳定性的方法，以及含有具有高保存稳定性的虾青素的绿藻提取物。本发明提供一种绿藻提取物，含有换算成游离态时浓度为0.5～20质量％的虾青素和浓度为0.1～15质量％的至少一种磷脂。上述绿藻提取物，其中虾青素的保存稳定性高，即使在60℃保存一周后，仍有约80％以上的虾青素可以残存。
文档编号C07C403/00GK101023966SQ200710005810
公开日2007年8月29日 申请日期2007年2月25日 优先权日2006年2月21日
发明者村神渚, 石仓正治 申请人:雅马哈发动机株式会社