专利名称：绒白乳菇素的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种生物提取，尤其是涉及一种利用绒白乳菇菌丝体发 酵液中的抑菌活性成分一一绒白乳菇素防治林木病害。
技术背景目前，绒白乳菇Uw"r/M ^//ere"s ( Fr. ) Fr.)是隶属担子菌 亚门 (Basidiomycotina )、 层菌纲 (Hymenomycetes )、 伞菌目 (Agaricales )、红蔬科(Russulaceae )、乳蒜属(hc"r/zw)的真菌， 具微毒且具有一定的药用价值，对小白鼠肉瘤S-180及艾氏癌的抑制率 均为60%。目前尚未有利用绒白乳菇菌丝体发酵液中的抑菌活性成分一一 绒白乳菇素防治林木病害的报道。 发明内容本发明的目的在于提供一种绒白乳菇素的分离纯化方法。 为了达到上述目的，本发明釆用的技术方案是分离纯化工艺绒 白乳菇子实体鉴别一一菌种分离、纯化一一菌株鉴定一一菌丝体液体培 养一一绒白乳菇素萃取一一绒白乳菇素分离一一绒白乳菇素纯化。a、 绒白乳菇子实体鉴别子实体群生，菌盖直径6—10cm,初期白 色，扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛, 边缘内卷至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不变色，味苦，菌褶 直生至稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3—5cm，直径1. 5 — 2. 5cm, 内实，白色，有绒毛，b、 菌种分离、纯化采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌 盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出 菌丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，马铃薯葡萄糖琼 脂培养基配方，马铃薯150—250g,葡萄糖15 — 25g，琼脂15—25g,水 1000ml,"菌株鉴定采用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌丝体分别进行rDNAITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所 分离的子实体，d、液体发酵培养采用培养基配方为0. 05% 0. 5%(g/ mL)葡萄糖、 P/o 10。"g/mL)麸皮、0. 01% 0. 25% (g/mL)硫酸铵、0, 01% 0. 25% (g/mL) g 黄豆粉，1% 3%无机盐及0. 008%~0. 016%(g/ mL)烟酸，e、 发酵生产绒白乳菇素的培养条件接种量5 / 15 / 、装液量 100 300raL/5O0mL、 pH值5 7、摇床转速100~140r/min、温度20 28。C、 发酵时间10 20d。f、 绒白乳菇素萃取将上述培养液超声破碎l~4h,过滤除菌后与正 丁醇以1: 2 5比例萃取l 5h,g、 绒白乳菇素分离釆用硅胶柱层析法分离，h、 绒白乳菇素纯化采用薄层层析(TLC)。本发明的优点是抑制杨树叶枯病菌a/"r朋")菌丝生长及孢子萌发。 同时对杨树叶锈病菌(yi/e7a/z/;ww^ /ar/c/1/^/7"//朋)和杨树烂皮病菌 (0^o"。,a c力r"c^/^r鹏)、金黄色葡萄球菌 (iYa/^/yococciAS1 awrews0、枯草杆菌(j9ac/"ws 5^6〃//s)、大肠杆菌(■foc/zer/cA/a co//)也有显著的抑制作用。高效、低毒、无公害。
具体实施方式
下面结合对本发明的实施例作进一步详细描述。 实施例1、a、 绒白乳菇子实体鉴别子实体群生，菌盖直径6—10cm,初期白 色，扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛， 边缘内卷至伸展，菌肉白色，厚。乳汁少，白色，不变色，味苦。菌褶 直生至稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3—5cm，直径1. 5 — 2. 5cm, 内实，白色，有绒毛，b、 菌种分离、纯化釆用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌 盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出 菌丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，马铃薯葡萄糖琼 脂，马铃薯200g，葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml，C、菌株鉴定采用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌 丝体分别进行rDNA ITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所分离的子实体，d液体发酵培养釆用培养基配方为2g葡萄糖、50g麸皮、1.25g 硫酸铵、1.25g黄豆粉，20mL无机盐溶液、120mg烟酸，e、 发酵生产绒白乳菇素的培养条件接种量12.5%、装液量 300mL/500mL、 pH6、摇床转速120r/min、温度26。C、发酵天数12d。f、 绒白乳菇素萃取将培养液超声破碎2h，过滤除菌后与正丁醇以1: 3比例萃取3h,g、 绒白乳菇素分离采用硅胶柱层析法分离，h、 绒白乳菇素纯化釆用薄层层析(TLC)。实施例2、a、 绒白乳菇子实体鉴别子实体群生，菌盖直径6—10cm，初期白 色，扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛， 边缘内巻至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不变色，味苦，菌褶 直生至稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3—5cm,直径1. 5—2. 5cm， 内实，白色，有绒毛，b、 菌种分离、纯化采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌 盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出 菌丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上。马铃薯葡萄糖琼 脂，马铃薯180g、葡萄糖20g、琼脂18g、水1000ml，C、菌株鉴定釆用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌 丝体分别进行rDNA ITS序列鉴定、比对，以证明分离得封的菌株来自于所分离的子实体，d、 液体发酵培养采用培养基配方为1.5g葡萄糖、55g麸皮、1.20g 硫酸铵、1. 35g黄豆粉，18mL无机盐溶液、118mg烟酸，e、 发酵生产绒白乳菇素的培养条件接种量10y。、装液量250mL/500mL、 pH6、摇床转速125r/min、温度23。C、发酵天数15d，f、 绒白乳蒜素萃取将培养液超声破碎3h,过滤除菌后与正丁醇以 1: 4比例萃取2h，.g、绒白乳菇素分离采用硅胶柱层析法分离， h、绒白乳菇素纯化采用薄层层析(TLC)。 实施例3、a、 绒白乳菇子实体鉴别子实体群生，菌盖直径6—10cm，初期白色， 扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛，边缘内卷至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不变色，味苦，菌褶直生至 稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3—5cm，直径1.5 — 2. 5cm,内实，白色，有绒毛，b、 菌种分离、纯化采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌 盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出菌 丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，马铃薯葡萄糖琼脂，马铃薯210g，葡萄糖17g，琼脂17g,水1000ml，c、 菌株鉴定采用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌 丝体分别进行rDNA ITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所分离的子实体，d、 液体发酵培养采用培养基配方为2. lg葡萄糖、48g麸皮、L23g 硫酸铵、1.20g黄豆粉、22mL无机盐溶液、125mg烟酸，e、 发酵生产绒白乳菇素的培养条件:接种量15y。、装液量240mL/500mL、 pH7、摇床转速110r/min、温度28。C、发酵天数20d,f、 绒白乳菇素萃取将培养液超声破碎l.化，过滤除菌后与正丁醇 以1: 2比例萃取5h，g、 绒白乳菇素分离釆用硅胶柱层析法分离，h、 绒白乳菇素纯化'采用薄层层析(TLC)。本发明的抑菌机理为，绒白乳菇素能够抑制菌体4种保护酶的活性， 破坏了保护酶系统原有的平衡状态，导致氧自由基清除系统出现障碍，MDA 含量升高，膜脂过氧化严重，绒白乳菇素能够引起ATP酶阶段性的增强， 这个阶段也致使HK、 PK、 LDH、 SDH、 MDH活力与辅酶I含量下降，更加剧 了对ATP的水解，ATP合成受阻，使菌体内许多需能的合成代谢与物质运 输受阻，干扰了糖酵解与TCA循环的顺利进行，严重破坏了糖类、脂类、 蛋白质代谢相互间的动态平衡，直接以菌体电导率、呼吸强度、蛋白质含 量的下降及菌体与孢子形态发生非正常的变化表现出来，最终使菌体膜系 统完整性丧失，大量的内含物被释放到胞外，菌体变得十分粘稠，濒临死 亡。
权利要求
1.一种绒白乳菇素的分离纯化方法，包括id="icf0001" file="A2007100716910002C1.gif" wi="76" he="45" top= "36" left = "52" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>，其特征在于分离纯化工艺绒白乳菇子实体鉴别——菌种分离、纯化——菌株鉴定——菌丝体液体培养——绒白乳菇素萃取——绒白乳菇素分离——绒白乳菇素纯化。
2.根据权利要求l所述的绒白乳菇素的分离纯化方法，其特征在于a、 绒白乳菇子实体鉴别子实体群生，菌盖直径6 —10cm,初期白色, 扁半球形，中央下陷呈漏斗状，老后米黄色，表面干燥密被细绒毛，边缘 内巻至伸展，菌肉白色，厚，乳汁少，白色，不变色，味苦，菌褶直生至 稍下延，不等长，菌柄短粗，圆柱形，长3—5cm，直径1.5 — 2:5cm，内 实，白色，有绒毛，b、 菌种分离、纯化采用组织分离法，无菌条件下，挑取菌柄与菌 盖之间的组织接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，待组织块上长出菌 丝，将菌丝转接到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，马铃薯葡萄糖琼脂培 养基配方，马铃薯150—250g,葡萄糖15 — 25g，琼脂15—25g,水1000ml,c、 菌株鉴定釆用分子生物学鉴定方法，将子实体与分离得到的菌丝体分别进行rDNAITS序列鉴定、比对，以证明分离得到的菌株来自于所 分离的子实体，d、 液体发酵培养采用培养基配方为0. 05%~0. 5%(g/ mL)葡萄糖、 l°/ 10%(g/ mL)麸皮、0. 01% 0.25% (g/ mL)硫酸铵、0. 01%~0. 25°Mg/mL) g 黄豆粉，1%~3%无机盐及0. 008% 0. 016%(g/ mL)烟酸，e、 发酵生产绒白乳菇素的培养条件接种量5%~15%、装液量 100 300mL/500mL、 pH值5 7、摇床转速100 140r/min、温度20 28。C、 发酵时间10 20d。f、 绒白乳寐素萃取将上述培养液超声破碎l~4h，过滤除菌后与正 丁醇以1: 2~5比例萃取l~5h，g、 绒白乳菇素分离采用硅胶柱层析法分离，h、 绒白乳菇素纯化采用薄层层析(TLC)。
全文摘要
一种绒白乳菇素的分离纯化方法。本发明涉及一种生物提取，分离纯化工艺绒白乳菇子实体鉴别——菌种分离、纯化——菌株鉴定——菌丝体液体培养——绒白乳菇素萃取——绒白乳菇素分离——绒白乳菇素纯化。本发明具有抑制杨树叶枯病菌，菌丝生长及孢子萌发。同时对杨树叶锈病菌和杨树烂皮病菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌也有显著的抑制作用。高效、低毒、无公害。
文档编号C07D213/50GK101230368SQ20071007169
公开日2008年7月30日 申请日期2007年1月26日 优先权日2007年1月26日
发明者宋瑞清, 计红芳 申请人:东北林业大学;宋瑞清;计红芳