专利名称：一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质表达基因工程领域，尤其是利用毕赤酵母作为细胞工厂表达牛促卵泡激素的产业化研究领域。
背景技术：
促卵泡激素(促卵泡激素，follicle stimulating hormone，FSH)是由动物垂体前叶嗜碱性细胞合成和分泌的一种糖蛋白类促性腺激素。FSH的分子量在动物间存在种属差异，大致为30KD左右。FSH是由两个非共价结合的亚基所组成，α亚基由92～96个氨基酸组成，β亚基由109～115个氨基酸组成。α亚基和β亚基单独都不具有生活活性，二者结合形成二聚体，才具有生物活性。一般认为α亚基负责信号传导作用，β亚基是功能亚基，参予受体结合。后经研究发现，α和β亚基均参加受体结合与信号传导作用。
FSH的生物学功能为1、刺激卵巢生长，增加卵巢重量，促进卵泡颗粒细胞的增生和卵泡液的分泌，促进排卵，可刺激多个卵泡同时发育；2、促使卵泡内膜细胞分泌雌激素；3、促进雄性动物生精上皮的发育与精子的形成。
目前使用的促卵泡激素都是动物脑组织提取物，具有潜在的感染朊病毒的危险，很不安全，且杂含有促黄体素(Luteinizing hormone，LH)活性，超数排卵效果很不稳定。因此，使用纯化的基因重组牛促卵泡激素(bovineFSH，bFSH)应用于牛的超数排卵具有更多的优点和更加广阔的前景。为此，研究者在不同的表达系统中进行了重组FSH的表达研究。目前已报道的生产重组牛促卵泡激素的真核表达系统主要有五种哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统、转基因植物表达系统和转基因动物表达系统。Greenberg等(Greenberg NM，Anderson JW，Hsueh AJ，Nishimori K，Reeves JJ，deAvila DM，Ward DN，Rosen JM.Expression of biologically activeheterodimeric bovine follicle-stimulating hormone in milk of transgenic mice.Proc Natl Acad Sci USA.1991，88(19)8327-31.)利用转基因小鼠表达了具有生物学活性的二聚体重组牛促卵泡激素，小鼠乳汁中的分泌量达到了15mg/L。余荭等(余荭.牛促卵泡激素β亚基基因在哺乳动物细胞中的导入和表达.农业生物技术学报.1997，5(2)157-161.)利用CHO细胞表达了具有与自然FSHβ亚基相同免疫活性的牛FSHβ亚基。bFSHβ的产率24h可达700ng.L-1×106细胞，并能稳定分泌。Samaddar等(Samaddar M，Catterall JF，Dighe RR.Expression of biologically active beta subunit of bovinefollicle-stimulating hormone in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.ProteinExpr Purif.1997，10(3)345-355.)利用毕赤酵母表达了牛FSH的β亚基，由该酵母分泌到培养基中的FSHβ亚基具有与脑垂体提取的牛FSHβ亚基极其相同的免疫学特性，分泌的FSHβ亚基与oLHα亚基装配成的FSH二聚体同样具有受体结合能力，具有体外生物学活性，以酵母α配合因子信号肽替换同源信号肽后，表达量由230ng/L提高到4mg/L。
van de Wiel等(van de Wiel DF，van Rijn PA，Meloen RH，Moormann RJ.High-level expression of biologically active recombinant bovine folliclestimulating hormone in a baculovirus system.J Mol Endocrinol.1998，20(1)83-98.)利用两个分别含有牛FSHα和β亚基的重组杆状病毒转染Sf21昆虫细胞成功表达具有活性的牛重组FSH，最大表达量为1-5μg/L(免疫法测定)。
Dirnberger(Dirnberger D，Steinkellner H，Abdennebi L，Remy JJ，van deWiel D.Secretion of biologically active glycoforms of bovine follicle stimulatinghormone in plants.Eur J Biochem.2001，268(16)4570-4579.)等利用烟草花叶病毒瞬时表达系统把融合的单链牛FSH基因片断插入至烟草烟花叶病毒RNA基因组中，再用重组FSH病毒感染烟草，在烟草中表达。其表达分泌的重组FSH蛋白占胞质中可溶蛋白的3％左右。经分析，这种由植物表达的重组FSH同样具有糖基化结构，但含有能引起免疫和过敏反应的α(1，3)-海藻糖糖链。体外、体内活性测定表明该重组FSH具有体、内外生物学活性，但是比孕马血清促性腺激素活性降低很多。
Coulibaly等(Coulibaly S，Besenfelder U，Miller I，Zinovieva N，Lassnig C，Kotler T，Jameson JL，Gemeiner M，Muller M，Brem G.Expression andcharacterization of functional recombinant bovine follicle-stimulating hormone(boFSHalpha/beta)produced in the milk of transgenic rabbits.Mol Reprod Dev.2002，63(3)300-8.)在转基因家兔的乳汁中成功分泌具有生物活性的牛促卵泡激素，表达量达到了50-100mg/L。
虽然重组FSH的表达研究已取得了长足进展，但过低的表达量限制了重组FSH的大规模生产和应用，而且在毕赤酵母中只进行了牛促卵泡激素β亚基的表达，目前还没有牛促卵泡激素α和β双亚基共表达的研究。
发明内容
针对目前还没有牛促卵泡激素α和β双亚基共表达研究的现状。本发明提供一种基因工程的方法，利用生物反应器毕赤酵母(Pichia pastoris)高效表达重组牛促卵泡激素，解决重组牛促卵泡激素α和β双亚基在毕赤酵母中的共表达问题。
本发明具体提供了一种依据毕赤酵母密码子用法的偏爱性设计并采用PCR搭桥方法人工合成了牛促卵泡激素的α亚基和带6×his-tag的β亚基的cDNA序列。
现有技术表明，在不同的表达系统中密码子的优化能够显著提高外源蛋白的表达量，通过密码子的偏爱性特点分析得知，基因的表达水平和密码子的偏爱性之间存在着正相关性。
基因的设计以毕赤酵母密码子的偏爱性为依据。在设计合成基因的各引物序列时必需考虑以下各因素，(1)降低总体A+T的含量，避免高GC含量的序列后面紧跟AT高含量序列及终止序列；(2)避免形成稳定发卡结构的回文序列；(3)避免降低引物特异性的简单重复序列和反向重复序列；(4)优化引物搭桥区域的序列，控制各引物之间的退火温度在一定范围内；(5)在基因内消除进行克隆所需要的限制性内切酶位点等。因此，我们参照密码子偏爱性设计合成了α亚基和带6×his-tag的β亚基基因。合成方法采用PCR搭桥方法进行。设计引物时前后两条引物搭桥长度为20个碱基左右，但搭桥部分必须符合引物的条件(不能形成二聚体和发荚结构，不能和序列的其他部分配对)，整条引物的长度为60个碱基左右，允许引物之间形成空格。
本发明具体提供了重组牛促卵泡激素(recombinant bFSH)获得步骤(1)、酶切质粒pHIL-S后用连接酶分别与牛促卵泡激素的α亚基和含有6×his-tag标签的β亚基的基因连接，得到重组质粒pHIL-S-α和pHIL-S-β。
(2)、酶切质粒pHIL-S-α，用Klenow补平后再酶切，回收含有α基因的片断用连接酶与酶切的pHIL-S-β连接，得到重组质粒pHIL-S-bFSH。
(3)、酶切质粒pHIL-S-bFSH，用连接酶与酶切的含有Zeocin基因的片断连接，得到重组质粒pHIL-S-bFSH-Zeocin。
(4)、将质粒pHIL-S-bFSH-Zeocin电击转化入毕赤酵母宿主菌中，构建成表达牛促卵泡激素的毕赤酵母重组菌株。
(5)、将质粒pPIC3G-PDI电击转化入表达牛促卵泡激素的毕赤酵母重组菌中，构建成高表达的毕赤酵母重组菌株。将线化的载体电击转化毕赤酵母受体菌涂布于含有Zeocin的YPD平板上，30℃培养，4-5天后挑取转化子PCR鉴定同时含有α亚基和β亚基的重组菌株。
本发明提供了构建分泌型表达载体pHIL-bFSH-Zeocin共表达α、β亚基分泌表达重组bFSH的方法。通过将α和β亚基共构建于同一表达载体pHIL-bFSH-Zeocin并转化毕赤酵母，共表达α、β亚基，成功分泌表达了重组bFSH。
本发明所述的重组质粒pHIL-bFSH-Zeocin是以乙醇氧化酶1基因为启动子，并含有按照毕赤酵母密码子用法优化的牛促卵泡激素的α亚基和含有6×his-tag标签的β亚基的基因、组胺醇脱氢酶基因、氨苄霉素基因和Zeocin基因。
同时，该重组质粒pHIL-bFSH-Zeocin含有二硫键异构酶基因和G418基因，也含有Zeocin选择标记。
对表达的上清液进行SDS-PAGE和Western-blot结果显示表达的重组bFSH分子量约为35KD，大于未经糖基化加工的bFSH的α亚基和带有6×his-tag的β亚基结合形成的二聚体的理论分子量(24KD)，这表明表达的重组α亚基和β亚基能够自主正确结合形成二聚体，并进行了糖基化修饰。本发明通过优化合成的牛促卵泡激素在毕赤酵母中实现分泌表达，证明其进行了正确的二硫键配对、折叠和糖基化。
由于重组bFSH的C-末端含有6×his-tagβ标签，所以采用固定化金属亲和层析树脂进行纯化，阐述本发明采用Ni2+树脂亲和层析一步纯化获得高纯度的重组bFSH的方法。本发明具体提供了一种利用Ni2+柱亲和层析一步纯化获得高纯度的重组bFSH的方法。
固定化金属亲和层析(Immobilized-Metal Affinity Chromatography，IMAC)利用固定化载体上的共价结合螯合物螯和的金属离子作为亲和配基与目的蛋白质表面暴露的供电子氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基等配位结合吸附目的蛋白。与其它形式的亲和层析一样，固定化金属亲和层析主要用于快速纯化和需要高纯度目的产物的纯化过程。固定化金属亲和层析具有以下优点(1)蛋白质吸附容量大，是天然配基结合量的10～100倍；(2)具有普遍适用性，金属离子配基具有很好的稳定性，吸附容量大，成本低，且层析柱可长期连续使用，易于再生；(3)价格便宜，投资低，利于大规模使用。
多个相邻的组氨酸残基在天然蛋白中相对稀少，重组蛋白的组氨酸标签就具有较高的特异性和效率，一步纯化就能获得纯度90％以上的重组蛋白。本发明表达的重组bFSH在β亚基的C-端添加了6×his-tag标签用于后续纯化。本发明采用了Ni2+树脂亲和纯化方法。为了得到更纯的蛋白，在用150mmol imidazole洗脱之前，可以先用10mmol imidazole洗去杂蛋白，利用Ni2+树脂亲和层析一步就可获得电泳纯的重组bFSH，回收率达到了85.5％本发明还提供了一种通过bFSH与二硫键异构酶的共表达，提高重组bFSH分泌表达量的方法。
将pPIC3G-hPDI重组质粒用BspEI线化，采用电击转化法转化表达牛促卵泡激素的重组菌株。从添加G418的YPD平板上挑取菌落，转接到的YPD试管。提取酵母基因组，用PCR的方法鉴定二硫键异构酶基因的转入。
二硫键异构酶基因能够显著增加重组牛促卵泡激素的分泌表达。共表达人二硫键异构酶基因和牛促卵泡激素基因的重组菌与只表达牛促卵泡激素基因的重组菌相比，重组牛促卵泡激素的分泌表达量提高5倍，达到1.56mg/L。
通过实施本发明具体的技术方案，实现本发明内容，可以达到以下有益效果。
1、解决重组牛促卵泡激素α、β双亚基在毕赤酵母中的共表达问题，首次人工合成了牛促卵泡激素的α亚基和带6×his-tag的β亚基的cDNA序列；2、利用Ni2+树脂亲和层析一步就可获得电泳纯的重组bFSH，回收率达到了85.5％；3、证明了二硫键异构酶基因能够显著增加重组牛促卵泡激素的分泌表达。共表达人二硫键异构酶基因和牛促卵泡激素基因的重组菌与只表达牛促卵泡激素基因的重组菌相比，重组牛促卵泡激素的分泌表达量提高5倍，达到1.56mg/L。
图1为pHIL-bFSH-Zeocin的载体构建。
图2为共表达人二硫键异构酶的表达载体pPIC3G-hPDI的构建。
图3为纯化的重组bFSH经12％SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色情况，其中lane M标准蛋白分子量；lane1-4分别是50，100，150，200mmol洗脱收集浓缩样品。
图4为重组bFSH的western-blot检测。lane1为共表达二硫键异构酶基因和牛促卵泡激素基因的重组菌表达的重组bFSH，lane2为只表达牛促卵泡激素基因的重组菌表达的重组bFSH。
具体实施例方式
下面，举实施例说明本发明，以下的实施例可以使本专业技术领域的技术人员更全面的了解本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。另外，在下述的说明中，如无特别说明，则％皆指重量百分比。
菌株毕赤酵母菌株GS115(购自invitrogen)，E.coli DH5α(本实验室保存)，pHIL-S1，pGAPZαA(购自invitrogen)，pHFMDHG-A中国科学院微生物所提供，pMD18-T(购自大连宝生物工程公司)生化试剂YNB(yeast nitrogen base w/o amino acids)购自Difco公司；TaqDNA聚合酶、pfu Taq购自TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.，LTD公司；限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自大连宝生物工程公司；胰蛋白胨，酵母提取物为Oxoid公司产品；Zeocin购自invitrogen公司；G418购自Amersco公司；DNA回收试剂盒为新长江公司产品；其它试剂均为国产分析纯。
培养基低盐LB(Luria-Bertani Broth)培养基，RDB(RegenerationDextrose Base)培养基，BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium)培养基，BMMY(Buffered Methanol-complex Medium)培养基，培养基配方参见Invitrogen manual。以上培养基为通用培养基。
实施例1设计bFSH的α亚基、β亚基基因根据Genbank上报道的天然牛促卵泡激素的氨基酸序列，参见序列SEQUENCE LISTING 1和序列SEQUENCE LISTING 2，即该序列为天然牛促卵泡激素的氨基酸序列(α亚基P01217)和天然牛促卵泡激素的氨基酸序列(β亚基P04837)。通过本领域普通技术人员熟知的DNAStar程序按照毕赤酵母高表达基因的密码子用法将牛促卵泡激素氨基酸序列转变成核苷酸序列，即得到按照毕赤酵母高表达基因的密码子用法设计的牛促卵泡激素编码基因，参见序列SEQUENCE LISTING 3和SEQUENCE LISTING 4。即该序列为按照毕赤酵母基因密码子用法设计的bFSH的α亚基核苷酸序列和按照毕赤酵母基因密码子用法设计的bFSH的β亚基核苷酸序列。
为了构建表达载体，在合成的α亚基序列，两头设有EcoRI酶切位点；β亚基序列，在其C末端添加6×his-tag纯化标记，两头设有XhoI和EcoRI酶切位点。对合成序列进行测序确证与所设计的DNA序列完全相同。
实施例2重组表达载体的构建构建的重组表达载体过程参见附图1。该重组表达载体可在毕赤酵母中表达。重组表达载体的构建由以下部分完成(1)酶切质粒pHIL-S后用连接酶分别与牛促卵泡激素的α亚基和含有6×his-tag标签的β亚基的基因连接，得到重组质粒pHIL-S-α和pHIL-S-β。
(2)酶切质粒pHIL-S-α，用Klenow补平后再酶切，回收含有α基因的片断用连接酶与酶切的pHIL-S-β连接，得到重组质粒pHIL-S-bFSH。
(3)酶切质粒pHIL-S-bFSH，用连接酶与酶切的含有Zeocin基因的片断连接，得到重组质粒pHIL-S-bFSH-Zeocin。
实施例3重组表达载体的转化和筛选发明人构建的重组表达载体经线化，采用电击转化法(1.5kv，200Ω)转化P.pastoris GS115(购自invitrogen公司)。从RDB(Wu S，Letchworth GJ.Highefficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated withlithium acetate and dithiothreitol.Biotechniques.2004，36(1)152-154.)平板上挑取单菌落，转接添加Zeocin(1mg/ml)的YPD培养并传代，以基因组为模板，用α亚基和β亚基特异引物鉴定基因组中是否有α亚基和β亚基的基因插入；对于有插入的克隆，能PCR扩增出对应α亚基和β亚基基因大小的片段。挑取经PCR鉴定正确的克隆进行pPIC3G-PDI表达载体(参见附图2)的转化，挑取经PCR鉴定有外源二硫键异构酶基因整合的重组菌株与未转二硫键异构酶的原始菌同时进行诱导表达，将鉴定的单克隆挑入2mLBMGY试管中，28℃培养24h，离心收集菌体转入2mL BMMY试管中，每12h添加0.5％甲醇诱导120h，离心收集上清进行检测，共表达二硫键异构酶基因和牛促卵泡激素基因的重组菌与只表达牛促卵泡激素基因的重组菌相比，重组牛促卵泡激素的分泌表达量提高5倍，达到1.56mg/L(图4)。
实施例4含有α亚基和β亚基重组菌株的发酵和纯化25mlBMGY(参见Invitrogen manual)中生长24h的种子接种装有500mlBMGY的3L摇瓶，28℃培养24h，OD600约为2-5左右，离心收集菌体重悬于500mlBMMY中，每12h添加0.5％的甲醇进行诱导表达，诱导时间120h。诱导结束后，5000rpm离心10min，分别收集上清，用5M NaOH将上清液pH调到7.2，备用。由于重组bFSH含有6×his-tag标签，所以采用固定化Ni2+树脂(购自BD Biosciences Clontech)进行亲和纯化，步骤如下(1)取6毫升树脂于层析柱中(直径1.0×20cm，或者1.0×10cm，可以沉降3毫升柱床)，液体靠自然重力流出；也可采用蠕动泵Amershampump-P1，控制流速1-2ml/min，下同。
(2)加10×柱床体积的双蒸水洗柱，然后用10×柱体积的提取/洗脱缓冲液(50mM Na2HPO4.12H2O；300mM NaCl；pH7.0)(配制方法称Na2HPO4.12H2O 17.9g；NaCl 17.55g，大约加HCl 300μl，加dd H2O至1000ml)平衡柱床；(3)向柱床中加入澄清的样品，样品的pH必须大于7.0。对于超声破碎细胞后离心的上清，如果仍然混浊，可以用0.22μm滤器过滤；
(4)用10×柱体积的提取/洗脱缓冲液洗柱。如果纯化超声后菌体离心的上清，用10×柱体积的提取/洗脱缓冲液洗柱后，再用10×柱体积的提取/洗脱缓冲液(含10mM咪唑，0.6809g咪唑/L提取/洗脱缓冲液)洗柱；(5)用10×柱体积的洗脱液(50mM Na2HPO4.12H2O；300mM NaCl；150mM咪唑；pH7.0)(配制方法称Na2HPO4.12H2O 17.9g；NaCl 17.55g，咪唑10.214g；大约加HCl 4.5ml，加dd H2O至1000ml)洗柱，收集洗脱产物。用10.0kDa超滤管(Millipore)浓缩纯化的样品，然后用生理盐水4℃透析。
(6)加5×柱体积的dd H2O洗柱；再加5×柱体积的20mM MES(称MES 0.426g，NaCl 0.585g，加dd H2O至100ml，pH5.0)洗柱；再加10×柱体积的20％乙醇洗柱；4℃保存。再使用时重复步骤1-6；反复使用3次后，柱床需要再生。
在用150mmol imidazole洗脱之前，先用10mmol imidazole洗去杂蛋白，利用Ni2+树脂亲和层析一步就可获得电泳纯的重组bFSH，回收率达到了85.5％。
纯化的重组bFSH经SDS-PAGE电泳和western-blot检测，参见附图3、4，确证重组bFSH分子量约为35KD，为α亚基和β亚基自主正确结合形成二聚体bFSH形式，并进行了糖基化修饰。
通过本发明实现了重组牛促卵泡激素的双亚基在毕赤酵母中的共表达，通过与二硫键异构酶的共表达，将重组牛促卵泡激素的分泌表达量提高了5倍，达到了1.56mg/L。
序列1.ST25SEQUENCE LISTING 1<110>新疆农业科学院微生物应用研究所<120>一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达<130>一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>96<212>PRT<213>bovine<400>1Phe Pro Asp Gly Glu Phe Thr Met Gln Gly Cys Pro Glu Cys Lys Leu1 5 10 15Lys Glu Asn Lys Tyr Phe Ser Lys Pro Asp Ala Pro Ile Tyr Gln Cys20 25 30Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Ala Arg Ser Lys35 40 45Lys Thr Met Leu Val Pro Lys Asn Ile Thr Ser Glu Ala Thr Cys Cys50 55 60Val Ala Lys Ala Phe Thr Lys Ala Thr Val Met Gly Asn Val Arg Val65 70 75 80Glu Asn His Thr Glu Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 90 95
序列2.ST25SEQUENCE LISTING 2<110>新疆农业科学院微生物应用研究所<120>一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达<130>一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>109<212>PRT<213>bovine<400>1Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Thr Val Glu Lys Glu Glu Cys Gly1 5 10 15Phe Cys Ile Ser Ile Ash Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys Tyr Thr20 25 30Arg Asp Leu Val Tyr Arg Asp Pro Ala Arg Pro Asn Ile Gln Lys Thr35 40 45Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Lys Val Pro Gly Cys50 55 60Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Glu Cys65 70 75 80His Cys Ser Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly85 90 95Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Arg Glu Ile Lys Glu100 105
序列3.ST25SEQUENCE LISTING 3<110>新疆农业科学院微生物应用研究所<120>一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达<130>一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>301<212>DNA<213>人工序列<400>1gaattcccag acggtgagtt caccatgcaa ggttgtccag agtgtaagtt gaaggagaac 60aagtacttct ccaagccaga cgctccaatc taccaatgta tgggttgttg tttctccaga120gcttacccaa ccccagctag atccaagaag accatgttgg tcccaaagaa catcacctcc180gaggctacct gttgtgtcgc taaggctttc accaaggcta ccgtcatggg taacgtcaga240gtcgagaacc acaccgagtg tcactgttcc acctgttact accacaagtc ctgagaattc300c301
序列4.ST25SEQUENCE LISTING 4<110>新疆农业科学院微生物应用研究所<120>一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达<130>一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>344<212>DNA<213>人工序列<400>1ctcgagaatg tgagttgacc aacatcacca tcaccgtcga gaaggaggag tgtggtttct 60gtatctccat caacaccacc tggtgtgctg gttactgtta caccagagac ttggtctaca 120gagacccagc tagaccaaac atccaaaaga cctgtatctt caaggagttg gtctacgaga 180ccgtcaaggt cccaggttgt gctcaccacg ctgactcctt gtacacctac ccagtcgcta 240ccgagtgtca ctgttccaag tgtgactccg actccaccga ctgtaccgtc agaggtttgg 300gtccatccta ctgttccttc agagagatca aggagtgaga attc 34权利要求
1.一种重组牛促卵泡激素(recombinant bFSH)，其特征在于，重组牛促卵泡激素α、β双亚基在毕赤酵母中共表达而获得。
2.如权利要求1所述的重组牛促卵泡激素(recombinantbFSH)，其特征在于，将重组牛促卵泡激素的α亚基表达框和含有6×his-tag标签的β亚基的表达框构建于同一个表达质粒上，bFSH的cDNA序列包含α亚基和带6×his-tag的β亚基，实现α、β双亚基的共表达。
3.一种重组牛促卵泡激素(recombinant bFSH)的构建方法，其特征在于包括以下步骤，(1)、酶切质粒pHIL-S后用连接酶分别与牛促卵泡激素的α亚基和含有6×his-tag标签的β亚基的基因连接，得到重组质粒pHIL-S-α和pHIL-S-β；(2)、酶切质粒pHIL-S-α，用Klenow补平后再酶切，回收含有o基因的片断用连接酶与酶切的pHIL-S-β连接，得到重组质粒pHIL-S-bFSH；(3)、酶切质粒pHIL-S-bFSH，用连接酶与酶切的含有Zeocin基因的片断连接，得到重组质粒pHIL-S-bFSH-Zeocin；(4)、将质粒pHIL-s-bFSH-Zeocin电击转化入毕赤酵母宿主菌中，构建成表达牛促卵泡激素的毕赤酵母重组菌株转化有重组质粒pHIL-bFSH-Zeocin，获得同时含有α亚基和β亚基的重组牛促卵泡激素。
4.如权利要求3所述的重组质粒pHIL-bFSH-Zeocin，其特征在于，该重组质粒以乙醇氧化酶1基因为启动子，并含有按照毕赤酵母密码子用法优化的牛促卵泡激素的α亚基和含有6×his-tag标签的β亚基的基因、组胺醇脱氢酶基因、氨苄霉素基因和Zeocin基因。
5.如权利要求4所述的重组质粒pHIL-bFSH-Zeocin，其特征在于，该重组质粒pHIL-bFSH-Zeocin含有二硫键异构酶基因和G418基因。
6.如权利要求4所述的重组质粒pHIL-bFSH-Zeocin，其特征在于，该重组质粒pHIL-bFSH-Zeocin含有Zeocin选择标记。
7.如权利要求5所述的二硫键异构酶基因，其特征在于，人二硫键异构酶基因增加了重组牛促卵泡激素的分泌表达和胞内积累。
8.如权利要求5所述的二硫键异构酶基因，其特征在于，共表达人二硫键异构酶基因的重组牛促卵泡激素优于只表达牛促卵泡激素基因的分泌表达量。
9.共表达人二硫键异构酶的表达载体pPIC3G-hPDI的构建。
10.一种毕赤酵母表达的重组牛促卵泡激素电泳纯的的获得，其特征在于，选择用金属固定化亲和层析方法纯化并获得。
全文摘要
本发明解决了重组牛促卵泡激素α、β双亚基在毕赤酵母中的共表达问题，首次人工合成了牛促卵泡激素的α亚基和带6×his－tag的β亚基的cDNA序列。通过将α和β亚基共构建于同一表达载体pHIL－bFSH－Zeocin并转化毕赤酵母，共表达α、β亚基，成功分泌表达了重组bFSH，同时构建了pHIL－bFSH－Zeocin和pPIC3G－hPDI重组表达载体，证明了二硫键异构酶基因能够显著增加重组牛促卵泡激素的分泌表达。共表达人二硫键异构酶基因和牛促卵泡激素基因的重组菌与只表达牛促卵泡激素基因的重组菌相比，重组牛促卵泡激素的分泌表达量提高5倍。
文档编号C07K1/26GK101067118SQ20071010151
公开日2007年11月7日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者霍向东, 石玉瑚, 欧阳平凯 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所