使用与b细胞表面标志结合的拮抗剂治疗自身免疫病的制作方法

专利名称：：使用与b细胞表面标志结合的拮抗剂治疗自身免疫病的制作方法使用与B细胞表面标志结合的拮抗剂治疗自身免疫病本申请是中国申请00809834.4的分案申请，该母案于2000年5月4日以国际申请号PCT/US00/40018提交，于2001年12月30日进入中国国家阶段，本分案采用了与该母案一致的发明名称。发明领域本发明涉及使用与B细胞表面标志，如CD19或CD20结合的拮抗剂治疗自身免疫病。发明背景淋巴细胞是骨髓造血过程中产生的多种白细胞的一种。存在两种重要的淋巴细胞群B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。这里对淋巴细胞中的B细胞尤其有兴趣。B细胞在骨髓中成熟，离开骨髓时在其细胞表面表达与抗原结合的抗体。当天然B细胞首次与其膜结合抗体特异的抗原相遇时，细胞开始迅速分裂，其子代分化成记忆B细胞和称为"浆细胞，，的效应细胞。记忆B细细胞不产生膜结合抗体，:代i产生可S泌型二抗体，可分泌的抗体是体液免疫的重要效应分子。CD20抗原(也称为人B淋巴细胞限制性分化抗原Bp35)是前B细胞和成熟B淋巴细胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大约35kD(Valentine等生物学化学杂志264(19):11282-11287(1989);和Einfeld等,欧洲分子生物学组织杂志7(3):711-717(1988))。该抗原也在大于90%的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表达(Anderson等，血液63(6):1424-1433(1984)),但在造血干细胞，原B细胞，正常浆细胞或其它正常组织中未发现(Tedder等，免疫学杂志135(2):973-979,1985)。CD20在细胞周期启动和分化的活化过程早期阶段起调节作用(Tedder等，同上)，并可能发挥钙离子通道的功能。(Tedder等，细胞生物学杂志14D:195(1990))由于CD20在B细胞淋巴瘤中表达，这一抗原可作为用于"靶向"这类淋巴瘤的候选者。实质上，这种靶向可如下归纳给予患者B细胞表面5抗原CD20的特异性抗体。这些抗CD20抗体与正常和恶性B细胞(表面的)CD20抗原特异结合；与表面抗原CD20结合的抗体可引起肿瘤性B细胞的破坏和耗竭。此外，具有破坏肺瘤潜力的化学制剂或放射活性标记能与抗CD20抗体偶联，从而将所述制剂特异性"运送"至肿瘤性B细胞。不管用什么方法，一个主要目的是破坏肿瘤；可根据所使用的具体抗CD20抗体确定具体方法，因此，靶向CD20抗原的现有方法很多。CD19是B细胞系细胞表面表达的另一种抗原。象CD20—样，发现CD19在从干细胞阶段到快要最终分化为浆细胞之前的整个分化过程中均位于细胞上(Nadler,L.淋巴细胞分型112:3-37和Appendix,Renling等，编(1986)SpringVerlag出版)。然而与CD20不同，与CD19结合的抗体引起CD19抗原的内在化。在多种抗体中使用HD237-CD19抗体(也称为B4抗体)可鉴定CD19抗原(Kiesel等，白血病研究II,12:1119(1987》。CD19抗原存在于4-8%的外周血单个核细胞及大于90%的分离自外周血，脾脏，淋巴结或扁桃体的B细胞。在外周血T细胞，单核细胞或粒细胞中未检出CD19。实际上，所有的非T细胞急性淋巴母细胞白血病(ALL),B细胞慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞'淋巴瘤均表达可纟皮B4抗体检测的CD19(Nadler等,免疫学杂志131:244(1983);和Nadler等，血液学进展，Vol.XIIpp.187-206.Brown,E.编(1981)Grune&Stratton公司出版)。由B细胞系的细胞所表达的能识别分化阶段特异性抗原的其它抗体已得到鉴定。其中有抗CD21抗原的B2抗体；抗CD22抗原的B3抗体；抗CD10抗原的J5抗体(也称为CALLA)。见1997年1月21日授4又的美国专利5,595,721号(Kaminski等)。rituximab(RITUXAN)抗体是一种遗传工程化鼠/人嵌合单克隆抗CD20抗体。Rituximab在1998年4月7日授权的美国专利5,736,137号(Anderson等)中称为"C2B8"的抗体。RITUXAN⑧被指示用于治疗复发或难治的低级或滤泡性CD20阳性B细胞非霍奇金淋巴瘤。在体外对作用机制的研究显示RITUXAN⑧与人补体结合，并通过补体依赖性细胞毒作用(CDC)裂解淋巴样B细胞系(Reff等，血液83(2):435-445(1994))。此外，在抗体依赖的细胞性细胞毒作用(ADCC)试验中有显著活性。最近，RITUXAN⑧在氚标胸腺嘧啶掺入实验中显示抗增殖效应并直接诱导凋亡，而其它抗CD19和抗CD20的抗体则不能(Maloney等，血液88(10):637a(1996))。在实验中观察到RITUXAN⑧与化疗和毒素有协同作用。尤其是RITUXAN⑧使耐药性人B细胞淋巴瘤细胞系对阿霉素，CDDP,VP-16,白喉毒素和蓖麻毒蛋白的细胞毒效应敏感(Demidem等，癌症化疗及放射性药物(0&1^^1*0^1110&6^口乂&Radiopharmaceuticals)12(3):177-186(1997))。体内临床前研究显示RITUXIMAB耗竭来源于弥猴(cynomolgus)外周血，淋巴结和骨髓的B细胞，推测是通过补体和细胞介导的过程(Reff等，血液83(2):435-445(1994))。发明简述本发明第一方面提供了一种治疗哺乳动物自身免疫病的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的与B细胞表面标志结合的拮抗剂。另一方面，本发明涉及一种制品，其包括一个容器及其中所含的组合物，还包括一种包装插页，所述组合物包含一种与B细胞表面标志结合的拮抗剂，所述插页可指导用户用所述组合物治疗患有或易感自身免疫病的患者。优选实施方案详述I.定义本文中"B细胞表面标志"是一种表达于B细胞表面，可作为与之结合的拮抗剂的耙的抗原。B细胞表面标志有CDIO，CD19,CD20，CD21,CD22,CD23，CD24,CD37,CD53,CD72,CD73,CD74,CDw75,CDw76,CD77,CDw78,CD79a,CD79b,CD80，CD81，CD82,CD83,CDw84,CD85和CD86白细胞表面标志。有特别兴趣的B细胞表面标志是优先表达在B细胞表面而不是其它非B细胞组织表面，并且在前B细胞和成熟B细胞上都可表达的一种标志。在一个具体实施方案中，所述标志，如CD19或CD20,是在B细胞系由干细胞阶段到最终分化至浆细胞之前的整个阶段在B细胞上发现的一种标志。这里优先的B细胞表面标志是CD19和CD20。"CD20"抗原是在90％以上来自外周血或淋巴器官的B细胞表面发现的一种35kDa的非糖基化磷蛋白。CD20在早期前B细胞发育阶段表达，并保持到浆细胞分化。CD20在正常B细胞和恶性B细胞上均可发现。文献中CD20亦称为"B淋巴细胞限制性抗原"或"Bp35"。例如CD20抗原在Clark等，PNAS(USA)82:1766(1985)中被描述。"CD19"抗原是指由诸如HD237-CD19或B4抗体鉴定的90kDa抗原(Kiesd等,白细胞研究II,12:1119(1987))。与CD20—样，CD19是在细胞系由干细胞阶段到最终分化至浆细胞之前的整个阶IS:在细胞上发现的一种标志。拮抗剂与CD19的结合可能引起CD19的内在化。本文中"自身免疫病"是一种源自个体自身组织或直接针对个体自身组织的非恶性疾病。本文中自身免疫病特别排除了恶性疾病或肿瘤性疾病，尤其排除了B细胞淋巴瘤，急性淋巴细胞性白血病(ALL),慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，毛细胞(Hairycell)白血病和慢性成髓细胞性白血病。自身免疫病实例包括，但不限于，炎性应答如炎性皮肤疾病包括牛皮痺和皮炎(如过敏性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠疾病有关的应答(如克罗恩氏(Crohn's)病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征(包括成人呼吸窘破综合征；ARDS);皮炎；脑脊膜炎；脑炎；色素膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性疾病如湿渗和哮喘，以及涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的其它疾病；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼瘙(SLE);糖尿病(如I型糖尿病或胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症；雷诺氏(Reynaud，s)综合征；自身免疫性曱状腺炎；过敏性脑脊髓炎；斯耶格伦氏(Sjorgen，s)综合征；幼年型糖尿病；常见结核、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎中的，涉及细胞因子和T淋巴细胞所介导的急性和迟发型超敏反应的免疫应答；恶性贫血(阿狄森氏(Addison，s)病)；与白细胞渗出有关的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病变；多器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症；或库姆斯氏(Combs)阳性贫血)；重症肌肌无力；抗原抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格雷夫斯氏(Graves's)综合征；兰-伊氏(Lambert-Eaton)肌无力综合征；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺疾病；赖特尔氏(Reiter，s)病；全身肌强直(stiff-man)综合征；贝切特氏(Behcet)病；巨细胞性动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经炎；免疫性血小板减少性紫癜或自身免疫性血小板减少症等。"拮抗剂"是通过与B细胞表面标志结合能破坏或耗竭哺乳动物中的B细胞和/或例如通过减少或阻止B细胞所激发的体液应答而干扰B细胞的一或多种功能的分子。拮抗剂优选能耗竭所治疗的哺乳动物中的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种耗竭可通过多种机制获得，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC),对B细胞增殖的抑制和/或对B细胞死亡的诱导(即通过凋亡)。本发明的拮抗剂包括与B细胞标志结合的抗体、合成序列肽或天然序列肽以及小分子拮抗剂，可任选偶联或融合于一种细胞毒制剂。优选拮抗剂包含一种抗体。"抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用"和"ADCC"指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(如自然杀伤(NK)细胞，中性粒细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达FcyRin,而单核细胞表达FcyRI,FcyRII和FcyRIII。Raveth和Kinet在免疫学年鉴9:457-92(1991)，464页的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。为评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，如美国专利5,500,362号或5,821,337号中所述。这类试验中有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。选择性地，或附加地，目的分子的ADCC活性可在体内评估，例如采用Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)中公开的动物模型。"人效应细胞"是表达一种或多种FcR并执4亍效应物的功能的白细胞。优选所述细胞表达至少FcYRIII并执行ADCC效应物的功能。例如可介导ADCC的人白细胞包括人外周血单个核细胞(PBMC),自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒T细胞和中性粒细胞；其中优选PBMC和NK细胞。术语"Fc受体"或"FcR"用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是人FcR的天然序列。而且，优选的FcR是与IgG抗体结合的受体(y受体)，其包括FcyRI,FcYRII和FcYRin亚型，以及这些受体的等位基因变体以及可替换的剪接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA("活化型受体")和FcyRIIB("抑制型受体")，二者的氨基酸序列相似，主要区别在其胞浆结构域。活化型受体FcYRIIA在其胞浆结构域包含一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制型受体FcYRIIB在其胞浆结构域包含一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(见Daeron，免疫学年鉴15:203-234(1997))。在Ravetch和Kinet，免疫学年鉴9:457-92(1991);Capel等，免疫方法(免疫学方法)4:25-34(1994);和deHaas等，实验室及临床医学杂志(J丄ab.Clin.Med.)126:330-41(1995)中对FcR进行了综述。其它FcR,包括将来被确定的，均被包含在术语"FcR"中。该术语也包括新生受体，FcRn,其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117:587(1976)和Kim等，免疫学杂志24:249(1994))。"补体依赖性细胞毒作用"或"CDC"是指在补体存在时分子裂解靶细胞的能力。补体活化途径由补体系统第一个成分(Clq)结合至一个与同源抗原形成复合物的分子(如抗体)来启动。为评价补体活化，可如Gazzano-Santoro等，免疫学方法杂志202:163(1996)所述进行CDC试验。"生长抑制，，拮抗剂是指那些阻止或减少可与拮抗剂结合之抗原的表达细胞增殖的拮抗剂。例如拮抗剂可在体内或体外阻止或减少B细胞的增殖。"诱导凋亡"的拮抗剂是指那些可诱导例如，B细胞程序性细胞死亡的拮抗剂，所述凋亡可通过标准凋亡试z验，如annexinV的结合，DNA片段化，细胞皱缩，内织网膨胀，细胞碎裂，和/或膜泡(称为凋亡小体)形成确定。这里的术语"抗体"用其最广泛的意义，尤其包含完整的单克隆抗体，多克隆抗体，由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，以及能显示所需生物学活性的任何抗体片段。"抗体片段"包括完整抗体的一部分，优选包括抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab，，F(ab，)2，和Fv片段；二价抗体；线性化抗体；单链抗体分子；和由抗体片段构成的多特异性抗体。"天然抗体"通常是约150,000道尔顿的异源四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)构成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，免疫球蛋白不同种型的重链中二硫键数目不同。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每个重链在其一个端有可变区(VH)，紧接着多个恒定区。每个轻链端有变区(VO，而另一端有恒定区；轻链恒定结构域与重链第一恒定结构域并列，轻链的可变区与重链的可变区并列。认为轻链和重链的可变区有特定氨基酸形成一个界面。术语"可变的"是指不同抗体的可变区特定部分序列差异很大，且这些部分在每种抗体与其特定抗原的结合和特异性中有用。然而在抗体整个可变区中可变性的分布并不均等。它集中在轻链和重链可变区的三个被称为高变区的节段中。可变区的更高度保守部分被称为框架区(FR)。天然轻链和重链的可变区分别包含四个FR，它们大多采用P片层构象，通过三个高变区相连，这些高变区与P片层结构形成环状，有时形成部分环状。每条链的高变区通过FR连接至十分接近，并与其他链的高变区共同形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.(1991))。恒定区不直接参与抗体对抗原的结合，但显示多种效应功能，如使抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为"Fab"的抗原结合片段和一个残余"Fc"片段，每个Fab片段具有单个抗原结合位点，Fc的名称反映了其容易形成结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab，)2片段，它有两个抗原结合位点并仍能与抗原交叉结合。"Fv"是最小抗体片段，包含一个完整的抗原识别和抗原结合位点。这个区域是由一条重链和一个轻链可变区紧密、非共价结合成的二聚体。在Vh-Vl二聚体表面，每个可变区的三个高变区在构型上相互作用，从而限定一个抗原结合位点。六个高变区共同赋予抗体以抗原结合特性。但即使单个可变区(或Fv中仅包含三个抗原特异性高变区的那一半)也能识别并结合抗原，只是比完整结合位点的亲和力低。Fab片段还包含轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。Fab，不同于Fab片段之处在于，其重链CHI结构域的羧基端添加了数个残基，其中包括来自抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。本文中Fab，-SH指一种Fab，，其中恒定区的半胱氨酸残基有至少一个游离巯基。F(ab，)2抗体片段最初是作为Fab，片段对且它们之间有铰链区半胱氨酸的形式产生的。抗体片段的其它化学连接也是已知的。脊推动物任何物种的抗体(免疫球蛋白)的"轻链"可以是两种完全不同的型(k和入)之一，型别区分的依据是其恒定区氨基酸序列。抗体依据其重链恒定区氨基酸序列分为不同的类。完整抗体有五大类IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,其中几种能进一步分为亚型(同种型)，例如IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定区结构域分别被称为a,S,s,y和卜免疫球蛋白不同类的亚单位和三维构型是已知的。"单链Fv"或"scFv"抗体片段包括抗体的Vh和V]l结构域，这些结构域存在于单个多肽链上。优选Fv多肽在Vh和Vl结构域之间还包含一个多肽接头，它能使scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述见Pluckthun在《单克隆抗体的药理学》，第113巻，Rosenburg和Moore编，Springer画Verlag,NewYork,第269-315页(1994)。术语"二价抗体(diabodies)"是指具有两个抗原结合位点的小分子抗体片段，这些片段在一条多肽链(vh-VO上含有相连的一个重链可变区(vh)和一个轻链可变区(VO。利用一种非常短的接头，其使得同一条链上的两个结构域无法配对，不得不与另一条链上的互补结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。在EP404,097;W093/11161;和Hollinger等，美国国家科学院学报，卯6444-6448(1993)中有对二价抗体的更详细描述。本文中术语"单克隆抗体，，指从实质上均一的抗体群获得的抗体，即包含该群体的单个抗体除了可能自然发生的很少量突变以外都相同。单克隆抗体均以高度特异性直接针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体直接针对抗原上的单个决定簇。单克隆抗体除了具有特异性，其优势还在于，它们是通过杂交瘤培养而合成的，无其它免疫球蛋白的污染。修饰语"单克隆的"指抗体获自实质上均一的抗体群的特征，不应理解为限定由任何具体方法产生抗体。例如根据本发明使用的单克隆抗体可以用由Kohler等，自然，256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法来制备，或用重组DNA法(如美国专利4，816,567)来制备。"单克隆抗体"还可以是用Clackson等，自然，352:624-628(1991)和Marks等,分子生物学杂志，222:581-597(腦)所述技术从噬菌体抗体库中分离得到。本文中单克隆抗体具体包括"嵌合"抗体(免疫球蛋白)，只要它们展示所需生物学活性，其中所迷嵌合抗体中重链和/或轻链的一部分等同于或同源于来自特定物种的抗体或属于特定抗体类或亚类的抗体的相应序列，链的其余部分等同于或同源于来自其它物种的抗体或属于另一抗体类或亚类的抗体的相应序列(见美国专利4,816,567;Morrison等，美国国家科学院学报，81'.6851-6855(1984))。本文的目标嵌合抗体包括"灵长类化(primatized)"抗体，其包含源于非人灵长类可变区的抗原结合序列(如OldWorldMonkey,如狒狒，猕浙吳(rhesus)或恒河《吳(cynomolgusmonkey))禾口人的恒定区序列(美国专利5,693,780)。"人源化'，形式的非人(如鼠)抗体是包含源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在多数情况下，人源化抗体是下述人免疫球蛋白(接收(recipient)抗体)，其中受者的高变区残基被非人物种如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类(供者(donor)抗体)的具有所需特异性、亲和力和能力(capacity)的高变区的残基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。而且人源化抗体可包含未在受者抗体或供者抗体中发现的残基。这些修饰旨在进一步细化抗体的功能。一般情况下，人源化抗体基本上包含至少一个、通常两个可变区的全部，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，所有或基本上所有FR是人的免疫球蛋白序列中的那些。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常为人免疫球蛋白的至少一部分。祥见Jones等，自然321:522-525(1986);Riechmann等，自然332:323-329(1988);和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。本文中术语"高变区，，是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区含有"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如轻链可变区的残基24-34(Ll),50-56(L2)和89-97(L3),重链可变区的残基31-35(H1),50-65(H2)和95-102(H3);Kabat等，具有免疫学意义的蛋白的序列，第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD，(1991))，和/或"高变环"的残基(例如轻链可变区的残基26-32(U),50-52(L2)和91-96(L3),重链可变区的残基26-32(Hl),53-55(H2)和96-101(H3);ChotMa和Lesk,分子生物学杂志196:901-917(1987))。"框架区"或"FR"残基是除本文所定义的高变区残基以外的可变区残基。"结合"目的抗原如B细胞表面标志的拮抗剂是下述拮抗剂，其能以足够的亲和力结合该抗原因而其可作为靶向表达该抗原的细胞的治疗剂。与CD20抗原结合的抗体有"C2B8"现在#1称为"rituximab，，("RITUXAN")(美国专利5,736,137,引入作为参考)；钇-[卯]-标记的2B8鼠抗体"Y2B8"(美国专利5,736,137,引入作为参考)；任选用1311标记鼠IgG2a"B1"产生"mI-Bl"抗体(BEXXARTM)(美国专利5,595,721,引入作为参考)；鼠单克隆抗体"IF5"(Press等Blood69(2)):584-591(1987));"嵌合2H7"抗体(美国专利5,677,180,引入作为参考)；和可从国际白细胞分型小组(InternationalLeukocyteTypingWorkshop)获得的单克隆抗体L27,G28-2,93-1B3,B-C1或NU-B2(Valentine等，在《白细胞分型III》(McMichael编，第440页，OxfordUniversityPress(1987))。与CD19抗原结合的抗体包括Hekman等，癌症免疫学和免疫方法(CancerI賺unol.I讓unother.)32:364-372(1991)和Vlasveld等，癌症免疫学和免疫方法40:37-47(1995)中所述抗CD19抗体；和在Kiesel等，白血病研究II,12:1119(1987)中所述B4抗体。本文中术语"rituximab"或"RITUXAN"指经遗传工程改造的、针对CD20抗原的嵌合鼠/人单克隆抗体，在美国专利5,736，137(引入作为参考)中命名为"C2B8"。该抗体是含小鼠轻链和重链可变区序列及人的恒定区序列的IgGlk型免疫球蛋白。Rituximab结合CD20的亲和力为约8.0nM。"分离，，的拮抗剂是已经从其自然环境组分中鉴定并分离和/或回收的拮抗剂。其自然环境中的污染成分有，可干扰该拮抗剂的诊断和治疗应用的矿物质，可能还包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶质。在优选实施方案中，，该拮抗剂的纯度应达到(1)经Lowery法确定的拮抗剂重量的95%以上，最优选所述重量的99%以上，(2)足以获得用旋转杯状(spinningcup)序列分析仪所测至少15个残基的N端或内部氨基酸序列，(3)通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE以及考马斯亮蓝染色、优选^l艮染所证实的均质性。分离的拮抗剂包括重组细胞内的原位拮抗剂，因为该拮抗剂的自然环境中的至少一种组分已不存在。一般情况下分离的拮抗剂可通过至少一个纯化步骤来制备。需要治疗的"哺乳动物"是指归为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜和农场动物，以及动物园里的动物、参与运动项目的动物或宠物如狗、马、猫、牛等。优选所述哺乳动物为人类。"治疗，，是指治疗方法和预防措施。需要治疗者包括已经患病者，以及需要对疾病进行预防者。因此，哺乳动物可能被诊断为已患病或对所述疾病易感。"治疗有效量"是指能有效阻止，改善或治疗目标自身免疫病的拮抗剂的量。本文用于辅助治疗的术语"免疫抑制剂"是指能抑制或掩盖所治哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括能抑制细胞因子的产生，下调或抑制自身抗原的表达，或掩盖MHC抗原的物质。这些制剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077,其全文引入本文作参考)；硫唑嘌呤；环磷酰胺；溴麦角环肽；达那唑；氨苯^风；戊二醛(它们掩盖MHC抗原，如美国专利4,120,649所述)；抗MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A;类固醇如糖皮质激素，例如强的松，曱基强的松龙和地塞米*>;细胞因子或细胞因子受体拮抗剂包括抗ifn-y，-(3或-oc抗体，抗TNF-a抗体，抗TNF-P抗体，抗IL-2抗体和抗IL陽2受体抗体；抗LFA画1抗体，包括抗CDlla和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；pan-T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶性肽(公开于7/26/90的W090/08187);链激酶；TGF-P;链道酶；源于宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(Cohen等，美国专利5,114,721);T细胞受体片段(Offner等，科学，251:430-432(1991));WO90/11294;Ianeway,自然，341:482(1989);和WO91/01133);和T细胞受体抗体(EP340,109)例如T10B9。本文中术语"细胞毒制剂，，是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性核素(例如At211，I131,I125，Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212，P"和镥的放射性同位素),化疗制剂，毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或它们的片段。"化疗制剂"是在肿瘤治疗中使用的化学化合物。化疗制剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa);环膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙。定3口benaodopa，卡;皮酉昆(carboquone)，美妥替派(meturedopa)禾口尿烷亚胺(uredopa);氮丙。定和methylamelamine包括六曱蜜胺(altretamine),三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine),三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟曱基蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥,萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide),雌氮芥(estramustine),异环石粦酰胺(ifosfamide),氮芥(mechlorethamine),盐酸氧氮芥；左3走苯丙氨酸氮芥(melphalan),新氮齐(novembichin),胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯齐(prednimustine),曲磷胺(trofosfamide),尿嘧咬氮芥；亚硝'基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine)，雷莫司、汀(ranimustine);抗生素如阿克拉霉素，》文线菌素，authramycin,重氮丝氨酸，十粵来零素,》欠线菌素C(cactinomycin),力口利车零素(calicheamicin)，carabicin，洋红霉素(chromomycin),嗜癌素(carzinophilin),色霉素，放线菌素D,道诺红菌素(daunorubicin),地托比星(detombicin),6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin),表阿霉素(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊达比星(idarubicin),发波霉素(marcellomycin),丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin),椒榄霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，噤呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin),链黑菌素；链脲霉素(streptozocin),杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex),净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin);抗代谢药如氨曱蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物如二曱叶酸(denopterin),氨曱蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin),三曱曲沙(trimetrexate);噤呤类似物氟达拉滨(fludarabine),6-巯基噪呤，碌u咪噤呤，硫鸟噤呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine)，阿扎胞芬(azacitidine),6-氮尿苷，卡莫氟(carmofUr),阿糖胞苷，双脱氧尿苷，doxifluridine,依诺他滨(enocitabine),氟尿苷，5-FU;雄激素类如二甲睾酮，丙酸曱雄烷酮(dromostanolongpropionate)，环石充左,醇(epitiostanol),美雄氛(mepitiostane),睾内酯(testolactone);抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide),邻氯笨对氯苯二氯乙烷(mitotane),曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂如frolinicacid;醋葡内酯；醛磷酰胺糖芬(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖咬(amsacrine);bestrabucil;比生群(biasntrene);依达曲沙(edatraxate);defofamine;秋？K仙胺；地吖酉昆(diaziquone);elfornithine;elliptiniumacetate;依4乇格鲁(etoglucid);石肖酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan);氯尼达明(kmidamine);米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫派达醇(mopidamol);nitmcrine;喷司J也丁(pintostatin);phenamet;p比柔比星(pirarubicin);鬼臼初十酸(podophyllinicadd);2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);西索菲兰(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);乌拉坦(urethan);长春碱酰胺；达卡巴秦(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇；溴丙艰，秦(pipobroman);gacytosine;阿^立伯糖苷("Ara-C，，)；环石粦酰胺；三胺石克磷(thiotepa);紫杉烷(taxoid),如紫杉醇(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)禾口doxetaxel(TAXOTERE,Rhone隱PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine);6-石克代鸟噪呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春花碱；4白；鬼臼乙叉戒(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾(vinorelbine);navelbine;novantrone;替尼泊戒(teniposide);柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda;伊拜膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);维曱酸；esperamicins;capecitabine;以及上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene),芳香酵抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬,曲沃昔芬(trioxifene),keoxifene，LY117018,onapristone,和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide),尼鲁米特(nilutamide),bicalutamide,亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。术语"细胞因子，，是由一个细胞群释放的、作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白的总称。这类细胞因子有淋巴因子，单核因子，和传统的多肽激素。包括生长激素，如人生长激素，N-甲二磺酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺素；曱状腺素；胰岛素；前胰岛素；松驰素；前松驰素；糖蛋白激素如卵泡刺激素(FSH)，甲状腺剌激素(TSH),促黄体(生成)激素(LH);肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳激素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-cx和(3;mullerian-抑制物；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；苯丙酸诺龙；血管内皮细胞生长因子；整合素；血小板生成素(TPO);神经生长因子如NGF-P;血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-a和TGF-P;胰岛素样生长因子-I和-II;促红细胞生成素(EPO);骨诱导因子(osteoinductivefactors);干扰素如干扰素-a，-P,-y;集落剌激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF);粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF);粒细胞-CSF(G-CSF);白细胞介素(IL)如IL國l,IL-1a,IL-2,IL-3,IL-4，IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-11,IL-12，IL-15;肿瘤坏死因子如TNF-a或TNF-(3;和其它多肽因子包括LIF和kit配体(KL)。本文中术语细胞因子包括天然蛋白或来自重组细胞培养物的蛋白以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。本发明使用的术语"前体药物，，是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其相对于亲本药物对肿瘤细胞的细胞毒作用丰克小且可酶促活化或被转换成更具活性的亲本形式。例见Wilman,"癌症化疗中的前体药物"BiochemicalSocietyTransaction,14，pp.375-382,615thMeetingBelfast(1986)和Stella等，"前体药物一种药物定向运送的化学方法"定向药物运送，Borchardt等(编)，pp.247-267,Humanapress(1985)。本发明的前体药物包括，但不限于含有磷酸盐的前体药物，含有硫代磷酸盐的前体药物，含有硫酸盐的前体药物，含有肽的前体药物，D-氨基酸修饰的前体药物，糖基化的前体药物，含有|3-内酰胺的前体药物，任选含有取代的苯氧乙酰胺的前体药物或任选含有取代的苯基乙酰胺的前体药物，可转化为更具细胞毒活性的游离药物的5-氟胞嘧，定和其它5-氟尿嘧啶前体药物。可衍生为本发明所用前体药物形式细胞毒药物包括，但不限于上述化疗试剂。"脂质体"是由能向哺乳动物有效运送药物(如本文所公开的拮抗剂，和，任选地，一种化疗试剂)的各类脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小分子载体。通常将脂质体成分安排为一种双层形式，其类似于生物膜的脂质排列。所用的术语"包装插页"是指通常包括在治疗产品的商业包装中，含有与这些治疗产品的使用有关的说明，用法，剂量，给药，禁忌和/或警示等的说明书。ii.拮抗剂的制备本发明的方法和制品使用，或掺入了一种能结合B细胞表面标志的拮抗剂。相应地，本文还描述了产生这类拮抗剂的方法。用于产生或篩选拮抗剂的B细胞表面标志可以是，如抗原的可溶形式或其一部分，包括所需表位。或者，或任选，在表面表达所述B细胞表面标志的细胞可用于产生或筛选拮抗剂。可用于产生拮抗剂的其它形式的B细胞表面标志为本领域所显而易见，优选为CD19或CD20抗原。虽然优选的拮抗剂是抗体，但除抗体以外的其它拮抗剂也包括在此。例如，拮抗剂可含有任选融合至或偶联于细胞毒试剂(如本文所公开的那些)的小分子。可在小分子文库中筛选本文的目标B细胞表面标志，以便鉴定能与该抗原结合的小分子。还可进一步筛选小分子的拮抗特性和/或^^其与细胞毒试剂偶联。拮抗剂也可以是经合理设计或噬菌体展示(例见WO98/35036,1998年8月13日公开)。在一个具体实施方案中，所选的分子可以是"CDR类似物"或基于抗体CDR而设计的抗体类似物。尽管所述肽本身可能就有拮抗性，但任选将此肽与细胞毒制剂融合，以便添加或增强此肽的拮抗性。以下为本发明所用抗体拮抗剂的产生技术举例。(i)多克隆抗体多克隆抗体优选通过多次给动物皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂而产生。将所述相关抗原与针对所免疫的物种具有免疫原性的蛋白(如匙孔血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin)、血清白蛋白、牛曱状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)用双功能试剂或衍生试剂，如马来酰亚氨苯曱酰基硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0Cl2或WNONR(R和R'是不同烷基)，进行偶联是有效的。用所迷抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物，方法是，将100jig或5)ag蛋白或偶联物(分别针对兔或鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混合，在多位点皮内注射该溶液。1个月后，多位点皮内注射起始量的1/5-1/10的肽或与弗氏完全佐剂的偶联物来加强免疫。7-14天后，对动物采血，测定血清中的抗体效价。对动物的加强免疫直到效价达到平台期为止。优选给动物加强注射相同抗原的偶联物，但也可以是偶联至不同蛋白和/或通过不同的交l关剂偶联的偶l关物。偶K物还可以是重组细胞培养物产生的融合蛋白。此外，可用明矾等聚集剂增强免疫应答。(ii)单克隆抗体单克隆抗体来自基本均一的抗体群，即该群体中的每个抗体除了可能的很小量天然突变外都相同。因此，修饰词"单克隆"指所述抗体的并非不同抗体混合物的特性。例如，单克隆抗体可用由Kohler等，自然(1975)首次描述的杂交瘤4支术制备，或用重组DNA方法制备(美国专利4,816,567)。在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它适合的宿主动物如仓鼠，以激发那些产生或能产生与用于免疫之蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。另外，可体外免疫淋巴细胞。然后用适当融合剂，如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(Goding,单克隆抗体原理及应用，pp.59-103(AcademicPress,1986))。将如此制备的杂交瘤细胞接种至适当培养基中并培养，优选该培养基含有一或多种能抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄噤呤鸟噪呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT),杂交瘤培养基通常将包含次黄噪呤、氨基蝶呤和胸腺嘧咬核苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷型细胞的生长。优选骨髓瘤细胞是那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体，并对诸如HAT培养基等类似培养基4丈感的细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如由SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego，CaliforniaUSA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤细胞和由美国典型培养物保藏中心，Rockville,MarylandUSA提供的SP-2或X63-Ag8-653细胞。也有报道称人骨髓瘤以及小鼠-人异质性骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体(Kozbor,免疫学杂志133:3001(1984);Brodeur等，单克隆抗体制备技术及应用，pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987))可在含有生长的杂交瘤细胞培养基中分析直接针对所述抗原的单克隆抗体的产生。杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。单克隆抗体的结合亲和力可通过如Muson等，Anal.Biochem.,107:220(1980)所述Scatchard分析来测定。一旦鉴定出能产生具有所需特异性、亲和力、和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，将这些克隆通过有限稀释法进一步克隆并用标准方法进行培养(Goding,单克隆抗体原理及应用，pp.59-103(AcademicPress,1986))。适于此目的的培养基包括如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可作为腹水中肿瘤的形式在动物体内生长。由亚克隆分泌的单克隆抗体可用常规免疫球蛋白纯化方法如蛋白-A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基、腹水或血清中分离。编码单克隆抗体的DNA可用常规方法^[艮容易的分离和测序(如利用能与编码小鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是这类DNA的优选来源。DNA分离后，可将其插入表达载体中，然后用此表达载体转染宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述见Skerra等，Curr.OpinioninImmunol,，5:256-262(1993)禾口Pluckthun,Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。在另一实施方案中，可从用McCafferty等，自然，348:552-554(1990)所述技术产生的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，自然，352:624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志222:581-597(1991)分别描述了用噬菌体文库分离鼠和人的抗体。后来的文献描述了通过链改组制备高亲和力(nM范围)的人型抗体(Marks等，生物/技术10:779-783(1992)),以及用于构建大规模噬菌体文库的组合感染和体内重组方法(Waterhouse等，核酸研究2k2265-2266(1993))。因此，这些技术都可取代传统单克隆抗体杂交瘤技术来分离克隆抗体。DNA也可通过用人类重链和轻链的恒定区编码序列取代小鼠同源序列来修饰(美国专利4,816,567;Morrison等，美国国家科学院学报81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价结合来修饰。通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗体恒定区，或取代抗体上一个抗原结合点的可变区，形成二价嵌合抗体，其中一个抗原结合位点特异于一种抗原而另一个抗原结合位点特异于另一种抗原。(iii)人源化抗体本领域已有关于人源化非人类抗体的制备方法的描述。优选人源化抗体中已导入一或多个源自非人类的氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常称为"引进的，，残基，它们通常来自"引进的"可变区。人源化过程基本如Winter及其同事(Jones等，自然，321:522-525(1986);Riechmann等，自然，332:323-327(1988);Verhoeyen等，科学,239:1534-1536(1988))所述，用高变区序列取代人类抗体的相应序列来进行。因此，这样的"人源化，，抗体是嵌合抗体(美国专利4，816，567),其中完整人类可变区的很少一部分被非人类物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中高变区残基且可能有部分FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代。对用于制备人源化抗体的人类可变区包括重链和轻链的选择，对降低抗原性非常重要。根据所谓"最适应，，方法，针对已知人类可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体可变区序列。将与啮齿类的序列最相似的人类序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等，免疫学杂志，151:2296(1993);Chothia等，分子生物学杂志，196:901(1987))。另一种方法是用人类轻链或重链特定亚型的所有抗体的共有序列作为特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院学报，89:4285(1992);Presta等，免疫学杂志，151:2623(1993))。更重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选免疫球蛋白序列可能的三维构象的计算机程序。通过观察这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基，通过这种方法，可从受者和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，高变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。(iv)人类抗体除了进行人源化以外还可制备人类抗体。例如现在已能产生如下转基因动物(如小鼠)，它们通过免疫能产生人类抗体的所有成分而不产生内源免疫球蛋白。例如，有报道称，嵌合及种系(germ-line)突变小鼠中抗体重链连接区(Jh)基因的纯合缺失导致内源抗体的产生被完全抑制。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到这类种系突变小鼠中将导致因抗原攻击而诱导人类的抗体产生。见Jakobovits等，美国国家科学院学报，90:2551(1993);Jakobovits等，自然，362:255-258(1993);Bruggermann等，Yearinl醒uno.7:33(1993);和美国专利5591669,5589369和5545807。或者，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，自然348:552-553(1990))从未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)区基因的所有组成而体外产生人类抗体和抗体片段。依据此技术，将抗体V区基因克隆在与丝状噬菌体(如M13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因相同的框架内，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根行选择。因此，噬菌体模仿了B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；这些综述见Johnson,KevinS.和Chiswell，DavidJ.，结构生物学的最新观点(CurrentOpinioninStructuralBiology)3:564-571(1993)。可使用V基因片段的多个来源进行噬菌体展示。Clackson等，自然，352:624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因的随机组合小文库中分离了抗-恶唑酮抗体的一个多样性阵列。可基本如Marks等，分子生物学杂志222:581-597(1991),或Griffith等，EMBOJ.12:725-734(1993)所述构建未免疫人类供者的V基因所有组成，并分离针对抗原多样性阵列(包括自身抗原)的抗体。亦参见美国专利5565332和5573905。人类抗体也可通过体外激活的B细胞而产生(见美国专利5,567,610和5,229,275)。(v)抗体片段已开发了生成抗体片段的多种技术。传统上，这些片段通过对完整抗体的蛋白水解性消化获得(见Morimoto等，生物化学和生物物理学方法杂志(JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods)24:107-117(1992))和Brennan等，科学，229:81(1985))。但现在可直接通过重组宿主细胞产生这些片段。例如，可从上述抗体噬菌体库分离抗体片段。另外，可从大肠杆菌直接回收Fab'-SH片段，并经化学连接形成F(ab，)2片段(Carter等，生物/」技术10:163-167(1992))。依据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab，)2片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。见W093/16185;美国专利5,571,894;和美国专利5,587,458。抗体片段也可以是"线性化抗体，，，如美国专利5,641,870所述。这类线性化抗体片段可以是单特异性或双特异性的。(vi)双特异性抗体双特异性抗体是具有针对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。如双特异性抗体可以与B细胞表面标志物的两种不同表位结合。其它这类抗体可以结合第一个B细胞表面标志并再结合第二个B细胞表面标志。或者，可将抗B细胞标志物的结合臂与结合白细胞上引发分子的臂结合，从而集中针对B细胞的细胞防御机制，所述引发分子如T细胞受体分子(CD2或CD3),或lgGFc受体(FcYR)如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRffl(CD16)。双特异性抗体还可用于将细胞毒制剂定位至B细胞。这些抗体具有B细胞标志物结合臂和结合细胞毒制剂(例如皂草素，抗INF-a,长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，氨曱蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab，)2双特异性抗体)。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。完整双特异性抗体的传统制备方法是基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等，自然，305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤(q加droma)可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法见WO93/08829和Traunecker等，EMBOJ,10:3655-3659(1991)。依据另一种方法，可将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区的至少一部分、CH2及CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主生物。这使得在使用非等比的三种多肽链进行构建的实施方案中，能够较灵活地调整三种多肽片段的相互比例，以获得最佳产量。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的带有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从非必要免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半上存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节，见Suresh等，酶学方法，121:210(1986)。才艮据美国专利5，731,168所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异源二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小側链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补"沟"可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这使得异二聚体的产量比不想要的终产物如同型二聚体的高。双特异性抗体包括交联抗体或"异源偶联的"抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫细胞导向不想要的细胞(美国专利4676980),也可用于洽疗HIV感染(W091/00360,WO92/200373,EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，可在美国专利4676980号中获得。从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学229:81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备F(ab')2片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二辟u键的形成。生成的Fab'片段被转化为硫硝基苯曱酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab'-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab'-硫醇，再与等分子量的其它Fab'-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。近期的进展促进了Fab'-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，实验医学杂志，175:217-225(1992)中描述了完全人源化双特异性抗体F(ab')2分子的产生。每一Fab'片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能？I发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤细胞的裂解活性。直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志，148(5):1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab'部分通过基因融合而连接。使抗体的同型二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同型二聚体。由Hollinger等，美国国家科学院学报，90:6444-6448(1993))描述的"二价抗体"技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(VH),其通过接头与轻链可变区(vo相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的Vh和ViJ吉构域被迫与另一片段上的互补Vl和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，免疫学杂志，152:5368(1994)。还考虑了二价以上的抗体。如可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志，147:60(1991)。m.偶联以及对拮抗剂的其它修饰本文方法或制品中提到的拮抗剂可任选与细胞毒制剂偶联。可用于制备这些拮抗剂-细胞毒制剂偶联物的化疗试剂如上述。本文还涉及拮抗剂与一或多种小分子毒素，如加利车霉素，美登素(美国专利5,208,020),单端孢霉烯(trichothene),CC1065的偶联物。在本发明的一个实施方案中，使拮抗剂与一或多个美登素分子偶耳关(如每个拮抗剂分子与约l-10个美登素分子偶联)。美登素可转化成May-SS-Me,然后还原成May-SH3，并与修饰过的拮抗剂反应(Chari等，癌症研究52:127-131(1992))产生美登木素生物碱-拮抗剂偶联物。另外，拮抗剂可以与一或多个加利车霉素分子结合。加利车霉素家族的抗生素能在亚pM浓度水平产生双链DNA断裂。可使用的加利车霉素结构类似物包括，但不限于y/、a、oc31、N-乙酰基画Yi1、PSAG以及3/(Hinmam等，癌症研究53:3336-3342(1993)和Lode等，癌症研究58:2925-2928(1998))。可以应用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单孢菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、a-帚曲毒素、油桐04/ew份es/o^/z7)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆CP/^/o/aca爿men'ca"a)蛋白(PAPI，PAPII,PAP-S)、苦瓜(momoW/cac/wra""a)抑制因子、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草Oapaowan'aq^"'"a/zX)抑制剂，白树毒素，米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素(tricothecenes)。例见1993年10月28日公开的W093/21232。本发明还涉及与具有核裂解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶如脱氧核糖核酸酶；DNase)偶联的拮抗剂。多种放射性同位素可用于制备放射性偶联的拮抗剂，实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素。拮抗剂与细胞毒制剂的偶联物可通过多种双功能蛋白偶联剂来连接，所述双功能蛋白偶联剂如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚氨基-4-CN-马来酰亚氨甲基)环己烷-l-羧酸酯，iminothiolane(IT),亚氨酸酯的双功能衍生物(如亚氨基己二酸二曱酯盐酸盐)，活性酯类(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)，醛类(如戊二醛(glutareldehyde》，双-叠氮化合物(如双(对-叠氮基苯曱酰基)己二胺)，双-重氮衍生物(如双-(对-重氮苯曱酰基)-乙二胺)，二异氰酸酯(如亚甲代苯基2,6-二异氰酸酯)，和双-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科学238:1098(1987)所述制备。C"标记的l-异硫氰酸苯曱基-3-曱基二亚乙基三氨五乙酸酯(MX-DTPA)是将放射性核苷酸偶联至拮抗剂的偶联剂之一。见W094/11026。这种接头可能是有利于细胞毒药物在细胞内释放的"可断开的接头"。例如，可使用酸不稳定型接头，肽酶敏感型接头，二曱基接头或含二硫键的接头(Chari等，癌症研究52:127-131(1992))。或者，可通过重组技术或肽合成来获得拮抗剂与细胞毒制剂的融合蛋白。在另一实施方案中，拮抗剂可与肺瘤预靶向中应用的"受体"(如链霉抗生物素蛋白)偶联，将该拮抗剂-受体偶联物给予患者，之后用清除剂除去循环中未结合的偶联物，再给予已偶联了细胞毒制剂(如放射性核苦酸)的"配体"(如抗生物素蛋白)。本发明的拮抗剂还可与前体药物活化酶相结合，该酶可以将前体药物(如肽基化疗剂，见WO81/01145)转化为活性抗癌药物。见WO88/07378和美国专利4,975,278。这些偶联物中的酶组分包括能作用于前体药物使其转化为活性更强的细胞毒形式的任何酶。本发明的方法中用到的酶包括，但不限于，能将含磷酸基的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；可将含硫酸基的前体药物转化为游离药物的芳香基硫酸酯酶；将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物，如5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；能将含肽的前体药物转化为游离药物的蛋白酶，如沙雷氏菌属蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)等；可转化含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；能将糖基化前体药物转化为游离药物的碳水化合物裂解酶类如P-半乳糖香酶和神经氨酸酶；能将P-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的P-内酰胺酶；能在药物中的氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基转化而使药物游离的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可用本领域称为"抗体酶"的具有酶活性的抗体，将本发明的前体药物转化为游离的活性药物(见Massey，自然328:457-458(1987))。可如本文所述制备拮抗剂-抗体酶偶联物以便将抗体酶运送至肿瘤细胞群。本发明的酶可通过本领域已知的技术，如上述异源双功能交联试剂的使用而与拮抗剂共价结合。或者，可以通过本领域已知的DNA重组技术(如Neuberger等，自然，312:604_608(1984))构建含至少本发明拮抗剂的抗原结合区的融合蛋白，所述拮抗剂与本发明酶的至少一个功能活性部分连接。本文还涉及对拮抗剂的其它修饰。例如，拮抗剂可与一种非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物交联。本文公开的拮抗剂还可配成脂质体。含拮抗剂的脂质体可通过本领域已知方法制备，如Epstein等，美国国家科学院学报82:3688(1985);Hwang等，美国国家科学院学报77:4030(1980);美国专利4,485,045和4,544,545及1997年10月23日公开的W097/38731。在美国专利5，013，566中公开了循环寿命增加了的脂质体。特别有效的脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物经反相蒸发法产生。脂质体通过一定孔径大小的滤膜而挤出后获得具有所需直径的脂质体。本发明抗体的Fab，片段可如Martin等，生物学化学杂志，257:286-288(1982)所述，经二硫化物交换反应与脂质体偶联。可任选在所述脂质体中包含一幹化疗制剂。见Gabizon等,J.NationalCancerInst,81(19)1484(1989)。本发明还涉及对本文所述蛋白质或肽类拮抗剂的氨基酸序列修饰。例如，可预期改进拮抗剂的结合亲和力和/或其它生物学特性。拮抗剂的氨基酸序列变体可通过在拮抗剂核酸中导入适当的核苷酸改变，或通过肽合成法来制备。所述修饰包括，如该拮抗剂的氨基酸序列中的残基缺失，和/或插入和/或取代。可对缺失、插入、和取代进行任意组合以获得最终构建体，只要该最终构建体具有所需特性。氨基酸的变化还可改变拮抗剂的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。一种鉴别拮抗剂中处于诱变优选位置的特定残基或区域的有效方法是Cunningham和Wells,科学244:1081-1085(1989)所述的"丙氨酸扫描诱变"。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电的氨基酸取代(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与抗原的相互作用。那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置通过在取代点引入进一步的或其他的变体而改进。故，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的作用，在所述靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的具有预期活性的拮抗剂变体。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其长度从一个残基至包括100个或更多残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括带有N-末端曱硫氨酰残基的拮抗剂或与细胞毒性多肽融合的拮抗剂。拮抗剂分子的其它插入变体包括在酶或多肽的拮抗剂的N-或C-末端进行融合，以增加拮抗剂在血清中的半衰期。另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体使拮抗剂分子中至少一个氨基酸残基被不同残基取代。抗体拮抗剂分子中最有兴趣进行取代诱变的位点包括高变区，也可以改变FR。保守取代见表l的"优先取代"栏。如果这些取代引起生物学活性的改变，则可引入表l中"取代举例"栏的更实质性改变，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>,，所述取代的效应在维持(a)取代区多肽骨架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子靶位点的电荷或疏水性，(C)側链的大小这几方面有显著差异。天然残基根据共有的侧链特性可分为(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸异亮氨酸(2)中性亲水半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)碱性天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸(5)影响侧链定向的残基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。与维持拮抗剂正确构象有关的任何半胱氨酸残基也可被取代，如被丝氨酸取代，以提高该分子的氧化稳定性，并阻止异常交联。相反，可在拮抗剂中添加半胱氨酸连接以提高其稳定性(特别当拮抗剂为抗体片段如FV片段时)。取代变体的特别优选类型包括取代亲本抗体高变区的一或多个残基。通常，所选用于进一步开发的变体相对于其亲本抗体应具有改进的生物学活性。产生这种取代变体的一个方便方法是利用了噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，使高变区的几个位点(如6-7个位点)突变以便在每一位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价形式展示在丝状喧菌体颗粒上，其为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体是否具有本文所述生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定备选的高变区修饰位点，可通过丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出主要贡献的高变区残基。此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以确定抗原与抗体之间的接触点也较有利。这些接触残基及其邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对它们全部进行筛选，选出在一或多个相关实验中具有优势特性的抗体以便进一步开发。拮抗剂的另一种氨基酸变体改变了拮抗剂原来的糖基化模式。所谓改变就是去掉拮抗剂中的一或多个-友水化合物部分，和/或添加一或多个原本不存在于该拮抗剂中的糖基化位点。多肽的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指将碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分与天冬酰胺侧链酶促相连的识别序列。因此，多肽中存在上述任一种三肽序列都可产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附着于羟基氨基酸，主要是丝氨酸、苏氨酸，但也可用5-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。在拮抗剂分子中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列，使其包含一或多个上述三肽序列(在添加N-连接糖基化位点的情况下)而实现。这种改变也可通过在原始的拮抗剂序列中添加或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(在添加O-连接的情况下)。编码拮抗剂的氨基酸序列变体的核酸分子由本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)，或通过对早期制备的拮抗剂变体或未变异的拮抗剂进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变和盒式诱变来制备。也可预期修饰拮抗剂的效应物功能，如以此增强拮抗剂的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒作用(CDC)。这可以通过在抗体拮抗剂Fc区引入一或多个氨基酸取代而获得。此外，可在Fc区引入半胱氨酸残基，使得在此区形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可提高内在化能力和/或增强补体介导的细胞杀伤作用和ADCC。见Caron等,实验医学杂志176:1191-1195(1992)和Shopes,B.免疫学杂志148:2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体也可用Wolffe等，癌症研究53:2560-2565(1993)所述异源双功能交联剂制备。或者，可通过工程改造产生具有双Fc区并因此具有增强的补体裂解效应及ADCC能力的抗体。见Stevenson等，抗癌药物的设计(Anti-Cancerdrugdesign)3:219-230(1989)。为了提高拮抗剂的血清半衰期，一种方法是在拮抗剂(尤其抗体片段)上掺入一个补救受体结合表位，如美国专利5,739,277所述。本文中术语"补救受体结合表位，，是指IgG(例如IgGi,IgG2、IgG3、或lgG4)Fc区中负责延长该IgG分子的体内血清半衰期的表位。IV.药用制剂根据本发明使用的拮抗剂的药用制剂通过将具有所需纯度的拮抗剂与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(雷氏药学(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.编(1980))混合而制备，然后以冻干剂或含水剂的形式保存。可药用载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括緩冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二曱基千基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化千烷铵(benzalkoniumchloride),苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯曱酸酯如曱基或丙基对羟基苯曱酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间曱酚)；低分子量多肽(少于10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA;糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂如吐温TM,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。抗CD20抗体制剂的实例如W098/56418所述，其已引入本文作为参考。其描述了一种液体多剂量制剂，该制剂包含40mg/mlrituximab,25mM乙酸，150mM海藻糖，0.9%苯曱醇，0.02。/。聚山梨酸酯(polysorbate)20,pH5.0,在2-8。C至少可保存2年。另一种抗CD20目标制剂在9.0mg/ml氯化钠，7.35mg/ml二水柠檬酸钠，0.7mg/ml聚山梨酸酯80,注射用无菌水，pH6.5中包含10mg/mlrituximab。适于皮下给药的冻干剂见WO97/04801所述。这种冻干剂可用适当稀释剂重新恢复至高蛋白浓度，所重建的制剂可皮下给药至这里所治疗的哺乳动物。所述制剂还可根据所治疗的具体情况而包含一种以上活性成分，优选具有互补活性但相互无负面影响的那些。例如，优选还提供细胞毒试剂，化疗试剂，细胞因子或免疫抑制剂(如作用于T细胞的那些，如环孢菌素或结合T细胞的抗体，如结合LFA-1的抗体)。所述其它试剂的有效量取决于该制剂中拮抗剂的量，疾病或病症或治疗的类型，及上述其它因素。通常应用上文所述剂量和给药方式，或迄今所用剂量的约1-99%。活性成分也可容纳在通过凝聚技术或界面聚合作用制备的微胶嚢中，如分别在胶体性质的药物运送系统(如脂质体，白蛋白小球体，微乳剂，纳米颗粒及纳米胶嚢)或大乳剂(macroemulsions)的羟甲基纤维素或明胶微胶嚢和聚(异丁烯酸曱酉旨)微胶嚢。这些技术见雷氏药学，第16版Oso1,A.编(膽)。也可制备控释制剂。控释制剂的适当实例包括含有拮抗剂的固态疏水聚合物的半通透性基质，所述基质为具有一定形状的制品，如膜或微胶嚢。控释制剂实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酉旨)或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3,773,919),L-谷氨酸与Y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物，不可降解的乙烯乙酸乙酯，可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和leuprolide乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可以通过除菌滤膜过滤而轻易实现。V.用拮抗剂进行治疗含一种与B细胞表面抗原结合的拮抗剂的组合物可根据常规医疗实践进行配制、分剂量、并给药。其中应考虑的因素包括所治疗的具体疾病或紊乱，所治疗的具体哺乳动物，具体患者的临床状况，疾病或紊乱的病因，药物的给药部位，给药方法，给药时间表，和医务人员已知的其它因素。拮抗剂的治疗有效量将参考上述因素而给予。作为常规建议，胃肠道外途径每次给予拮抗剂的治疗有效量的范围是每天约0.1-20mg/kg患者体重，拮抗剂通常的起始剂量为约2-10mg/kg。优选的拮抗剂是抗体，如不与细胞毒制剂偶联的RITUXAN⑧。例如，非偶联型抗体的适当剂量可以是约20mg/m、约1000mg/m2。在一个具体实施方案中，抗体剂量不同于目前推荐的RITUXAN。例如，可给予患者一或多剂抗体，每剂基本上少于375mg/m2,例如为约20mg/m、约250mg/m2,如约50mg/m2-约200mg/m2。此外，可给药一或多剂起始剂量的抗体，然后给药一或多剂后续剂量的抗体，其中所述后续剂量中mg/n^抗体剂量高于起始剂量中mg/n^抗体剂量。例如，起始剂量为约20mg/m2-约250mg/m2(如约50mg/m2-约200mg/m2),而后续剂量了为约250mg/m、约1000mg/m2。但如上所述，应在多种治疗中谨慎考虑拮抗剂的这些建议剂量。其结果是选择适当剂量和给药时间表的关键因素，如上所示。例如治疗进行性疾病和急性疾病可能需要相对较高的起始剂量。为针对疾病或紊乱获得最有效的结果，应尽可能在接近于疾病或紊乱的首次症状、诊断、表现、或发生时或在疾病或紊乱緩解期间给予拮抗剂。拮抗剂可通过任何适当方式给药，包括胃肠道外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内途径，如需进行局部免疫抑制治疗，可在病损内给药。胃肠道外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下给药。此外，拮抗剂适于经脉沖输注给药，如，使用剂量递减的拮抗剂输注。优选经注射给药，最优选静脉注射或皮下注射，其取决于给药是短期的还是长期的。可与本文拮抗剂一起给予其它化合物，如细胞毒试剂、化疗试剂、免疫抑制剂和/或细胞因子。组合给药包括同时给药各自的制剂或单一可药用制剂，还包括以任何顺序连续给药，其中优选有一段时间使两种(或所有)活性试剂同时发挥它们的生物学活性。除了向患者给药蛋白拮抗剂，本申请还考虑通过基因治疗给药拮抗剂。这类编码拮抗剂的核酸的给药以"给予有效治疗剂量的拮抗剂"的表达形式包括在内。例见1996年3月14日公开的WO96/07321,其涉及利用基因治疗产生细胞内抗体。有两种主要方法可将核酸(任选包含在载体中)引入患者细胞；体内和离体(exWvo)。体内运送核酸指直接给病人注射，通常注射至需要拮抗剂的位点。离体治疗是将患者细胞取出，将核酸引入这些分离的细胞，然后将这些已改变的细胞直接给予患者或装入多孔膜中再植入患者体内(见美国专利4,892,538和5,283,187)。有多种技术可用于将核酸引入活细胞。可根据是将核酸转移至体外培养的细胞，还是转移至目标宿主的体内细胞而使用不同方法。适于将核酸转移至体外哺乳动物细胞的技术有脂质体的应用、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。常用于离体运送基因的载体是逆转录病毒。目前优选的体内核酸转移技术包括用病毒载体(如腺病毒，单纯疱渗病毒I型或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于基因的脂质介导型转移的有效脂质有DOTMA,DOPE和DC-Chol)。某些情况下，希望提供一种带有能靶向靶细胞的试剂(如特异于细胞表面膜蛋白或靶细胞的抗体，针对靼细胞表面受体的配体，等)的核酸来源。当使用脂质体时，可使用能结合胞吞作用相关性细胞表面膜蛋白的蛋白来耙向和/或促进对下述蛋白的吸收，所述蛋白如对特定细胞类型具有向性的衣壳蛋白或其片段，在循环中进行内在化的蛋白的抗体，靶向细胞内定位和提高细胞内半衰期的蛋白。受体介导型胞吞作用的技术见Wu等，生物学化学杂志262:4429-4432(1987);和Wagner等,美国国家科学院学报，87:3410-3414(1990)。有关目前已知的基因制备和基因治疗方案的综述见Anderson等，科学256:808-813(1992)。亦参见W093/25673。VI.制备相关的制品本发明另一实施方案是一种制品，其包含可用于上述疾病或紊乱的治疗的材料。所述制品包括一个容器和位于该容器表面的或与该容器相关的标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器可内含一种能有效治疗目标疾病或紊乱的组合物，并具有无菌存耳又口(例如该容器可以是点滴袋(intravenoussolutionbag)或带有能通过皮下注射针穿刺的塞子的小瓶)。所述组合物中至少一种活性试剂是与B细胞表面标志结合的拮抗剂。标签或包装插页将指明，所述组合物是用于治疗自身免疫病(如本文所列)患者或易感者。所述制品还可包含第二个容器，该容器中含有可药用稀释液，如细菌抑制性注射用水(BWFI),磷酸盐緩冲液，Ringer，s溶液和葡萄糖溶液。还可包括具有商业需要以及符合用户需要的材料，包括其它緩冲液，稀释剂，滤器，针头，和注射器。本发明的更详细内容通过以下非限制性实施例举例i兌明。本说明书中所引用的所有文献均引入作为参考。实施例1'临床诊断为类风湿性关节炎(RA)的患者用rituximab(RITUXAN⑧)抗体进行治疗。所治患者没有B细胞恶性病。此外，患者可任选进一步用任何一或多种治疗RA的试剂进行治疗，所述试剂如水杨酸盐；非类固醇抗炎药物如吲哚美辛、苯丁唑酮、苯乙酸(如布洛芬和非诺洛芬)、萘乙酸(萘普生)、吡咯链烷酸(tometin)、吲哚乙酸(苏灵大)、卣代邻氨基笨曱酸(曱氯灭酸钠)、炎痛喜康、苯酰吡酸钠、二氟苯水杨酸；抗疟疾药物如氯奎；金盐；青霉胺；或免疫抑制剂如氨曱喋呤或皮质激素，所用剂量为这些药物的已知用药剂量或减量。但优选仅用RITUXAN⑧治疗患者。可按下述任一种剂量方案给RA患者静脉注射(IV)RITUXAN:(A)第1天静脉注射50mg/m2,第8、15和22天静脉注射150mg/m2(B)第1天静脉注射150mg/m2,第8、15和22天静脉注射375mg/m2(C)第1、8、15和22天静脉注射375mg/m2第一次应答通过Paulus指数(Paulus等，AthritisRheum.33:477-484(1990))测定，所述指数为晨僵、疼痛且发炎的关节的数量、血沉(ESR)的改善，以及经患者和医生评估的疾病严重程度之5点评分中至少提高了2点。给予RITUXAN⑧将在接受上述治疗的患者体内緩解一或多种RA症状。.实施例2诊断为自身免疫性溶血性贫血(AIHA),例如冷J求蛋白血症或库姆斯氏(Coombs)阳性贫血的患者用RITUXAN⑧抗体进行治疗。AIHA是由于与患者红细胞反应的自身抗体导致的一种获得性溶血性贫血。被治疗的患者没有B细胞恶性病。可按下述任一种剂量方案给所述患者静脉注射(IV)RITUXAN:(A)第1天静脉注射50mg/m2,第8、15和22天静脉注射150mg/m2(B)第1天静脉注射150mg/m2,第8、15和22天静脉注射375mg/m2(C)第1、8、15和22天静脉注射375mg/m2其它辅助治疗(如糖皮质激素，强的松，硫唑噤呤，环磷酰胺，vinca-laden血小板或达那唑)可与RITUXAN治疗联合应用，但优选在治疗全程仅用RITUXAN⑧作为单一制剂进行治疗。总应答率的确定取决于血细胞计数的增加、对输液的需求减少、血红蛋白水平的提高和/或通过标准化学参数确定的溶血证据的减少。在上述接受治疗的患者体内，RITUXAN⑧给药将改善溶血性贫血的一或多种症状。例如，接受上述治疗的患者显示血红蛋白至少增加lg/dl，有关溶血作用的化学参数也有50%改善或恢复正常(如血清乳酸脱氢酶，胆红素所测)。实施例3成人免疫性血小板减少性紫癜(ITP)是一种非常罕见的血液病，其构成最常见的免疫介导型细胞减少症。该病通常伴有严重的血小板减少，其可能与骨髓中正常量或增加量的巨核细胞存在时的急性出血有关。大多数ITP患者具有直接针对血小板膜外表面靶抗原的IgG抗体，导致血小板在脾脏滞留并加速网状内皮对血小板的破坏(BussellJ.B.Hematol.Oncol.Clin.NorthAm.(4):179(1990))。多项干预治疗已显示在ITP治疗中有效。通常将类固醇作为第一线治疗，然后大多数患者将选择静脉注射免疫球蛋白(IVIG),脾切除，或其它治疗包括长春新碱或免疫抑制剂/细胞毒制剂的治疗。多达80%的ITP患者在最初阶段能应答类固醇，但极少数能彻底并持续緩解症状。脾切除被推荐为类固醇治疗失败后标准的二线治疗，近60%-的患者緩解期延长，但可导致对感染的免疫力下降。脾切除是与高发病率(16%)和高死亡率(2%)相关的主要外科手术。IVIG也被作为二线治疗，尽管只有一小部分成人ITP患者获得緩解。能干扰活化B细胞产生自身抗体，但不出现与皮质激素和/或脾切除术相关的发病率的治疗选择将为部分ITP患者提供一种重要的治疗方法。临床诊断为ITP(如血小板计数<50,000/nL)的患者用rituximab(RITUXAN⑧)抗体进行治疗，可任选联合类固醇治疗。所治疗的患者没有B细胞恶性病。可4姿下述任一种剂量方案给ITP患者静脉注射(IV)RJTUXAN:(A)第1天静脉注射50mg/m2,第8、15和22天静脉注射150mg/m2(B)第1天静脉注射150mg/m2，第8、15和22天静脉注射375mg/m2(C)第1、8、15和22天静脉注射375mg/m2在注射RITUXAN⑧前，患者先静脉给药苯海拉明(diphenhydramine)25-50mg和口服对乙酰氨基酚(acetaminophen)650mg各一剂。用无菌注射器和21号针头或更大号针头，从小瓶取所需数量的RITUXAMg)至无菌、无热原质但含0.9%NaCl,USP(盐溶液)的IV袋中。RITUXAN⑧终浓度约1mg/mL。起始剂量的注入率在第一个半小时期间为25mg/hr,然后每隔30分钟增加50mg/hr，直至最大注入率200mg/hr。如果对第一轮RITUXAN输注能很好耐受，则后续数轮的注入率从50mg/hr开始，然后每隔30分钟增加100mg/hr,直至最大输入率不超过300mg/hr。每15分钟监测生命指征(血压、脉搏、呼吸、体温)，共监测4次或直到稳定，然后每小时监测l次直到输注结束。连续4周每周用RITUXAN⑧治疗1次，然后才艮据间隔2周连续2次测定的血小板计数来确定总应答率。用RITUXAN⑧治疗的患者比用安慰剂治疗的患者血小板计数增加。例如，血小板计数〈20,000/jul的患者当血小板计数增加到>20，000/pl时，判为应答；血小板计数>20,000/Ml并有能指示出血的临床症状的患者，当血小板计数总体增加10,000/ul或更多且症状消退时，判为应答。见George等"先天性血小板减少性紫癜由美国血液学公开的明确方法的实用指南(APracticeGuidelineDevelopedbyExplicitMethodsforTheAmericanofHematology)"血液(Blood)88:3-40(1996),其引入本文作为参考。38权利要求1.治疗哺乳动物自身免疫病的方法，包含给予哺乳动物有效治疗量的与B细胞表面标志结合的拮抗剂。2.权利要求1的方法，其中的B细胞表面标志选自CD10,CD19,CD20，CD21，CD22,CD23,CD24，CD37,CD53,CD72，CD73,CD74,CDw75，CDw76，CD77,CDw78,CD79a，CD79b，CD80,CD81,CD82,CD83，CDw84,CD85和CD86。3.权利要求l的方法，其中的拮抗剂包含一种抗体。4.权利要求3的方法，其中的抗体与CD20结合。5.权利要求3的方法，其中的抗体与CD19结合。6.权利要求1的方法，其中所述自身免疫病选自牛皮裤；皮炎；系统性硬皮病和硬化症；相关于炎性肠疾病的应答；克罗恩氏病；溃疡性结肠炎；呼吸窘迫综合征；成人呼吸窘迫综合征(ARDS);皮炎；脑脊膜炎；脑炎；色素膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性疾病；湿疹；哞喘；涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾病；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE);糖尿病；多发性硬化症；雷诺氏综合征；自身免疫性曱状腺炎；过敏性脑脊髓炎；斯耶格伦氏综合征；幼年型糖尿病；与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性及迟发型超敏反应有关的免疫应答；结核；结节病；多肌炎；肉芽肿病；脉管炎；恶性贫血(阿狄森氏病)；与白细胞渗出有关的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病变；多器官损伤综合征；溶血性贫血；重症肌肌无力；抗原抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格雷夫斯氏病；兰-伊氏肌无力综合征；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺疾病；賴特尔氏病；全身肌强直综合征；贝切特氏病；巨细胞性动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经炎；特发性血小板减少性紫癜(ITP);和自身免疫性血小板减少症。7.权利要求1的方法，其中的哺乳动物是人。8.权利要求3的方法，其中的抗体不与细胞毒制剂偶联。9.权利要求4的方法，其中的抗体包含rituximab(RITUXAN)。10.权利要求3的方法，其中的抗体与细胞毒制剂偶联。11.权利要求10的方法，其中的细胞毒制剂是放射活性化合物。12.权利要求11的方法，其中的抗体包含Y2B8或131I-B1(BEXXAR)。13.权利要求1的方法，其包括静脉给予拮抗剂。14.权利要求l的方法，其包括皮下给予拮抗剂。15.权利要求3的方法，其包括给予哺乳动物实质上不足375mg/n^的抗体。16.权利要求15的方法，其中的剂量为约20mg/n^到约250mg/m2。17.权利要求16的方法，其中的剂量为约50mg/n^到约200mg/m2。18.权利要求3的方法，其包括先以起始剂量给予抗体，接着以后续剂量给予抗体，其中后续给药中所述抗体的mg/m2剂量超过起始给药中所述抗体的mg/n^剂量。19.权利要求6的方法，其中的自身免疫病是免疫性血小板减少性紫癜(ITP)。20.权利要求6的方法，其中的自身免疫病是类风湿性关节炎。21.权利要求6的方法，其中的自身免疫病是溶血性贫血。22.权利要求21的方法，其中的溶血性贫血是冷球蛋白血症或库姆斯氏阳性贫血。23.权利要求6的方法，其中的自身免疫病是脉管炎。24.权利要求l的方法，其主要包括将所述拮抗剂给予哺乳动物。25.—种制品，其包括一个容器及其中所含的组合物，还包括一种包装插页，所述组合物包含一种与B细胞表面标志结合的拮抗剂，所述插页可指导用户用所述组合物治疗患有或易感自身免疫病的患者。26.权利要求25的制品，其中的自身免疫病选自牛皮癣；皮炎；系统性硬皮病和硬化症；相关于炎性肠疾病的应答；克罗恩氏病；溃疡性结肠炎；呼吸窘迫综合征；成人呼吸窘破综合征(ARDS);皮炎；脑脊膜炎；脑炎；色素膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性疾病；湿疹；哮喘；涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的疾病；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE);糖尿病；多发性硬化症；雷诺氏综合征；自身免疫性曱状腺炎；过敏性脑脊髓炎；斯耶格伦氏综合征；幼年型糖尿病；与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性及迟发型超敏反应有关的免疫应答；结核；结节病；多肌炎；肉芽肿病；脉管炎；恶性贫血(阿狄森氏病)；与白细胞渗出有关的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性病变；多器官损伤综合征；溶血性贫血；重症肌肌无力；抗原抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基底膜疾病；抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格雷夫斯氏病；兰-伊氏肌无力综合征；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多内分泌腺疾病；赖特尔氏病；全身肌强直综合征；贝切特氏病；巨细胞性动脉炎；免疫复合物性肾炎；IgA肾病；IgM多发性神经炎；特发性血小板减少性紫癜(ITP);和自身免疫性血小板减少症。全文摘要本发明涉及用能与B细胞表面标志结合的拮抗剂治疗自身免疫病，所述B细胞表面标志优选选自CD10，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD37，CD53，CD72，CD73，CD74，CDw75，CDw76，CD77，CDw78，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CDw84，CD85和CD86，所述拮抗剂优选抗体。文档编号C07KGK101254302SQ20071018508公开日2008年9月3日申请日期2000年5月4日优先权日1999年5月7日发明者安东尼奥·J·格里洛-洛佩斯,洛里·A·孔克尔,约翰·G·柯德申请人:杰南技术公司;比奥根艾迪克Ma公司