一种检测非体液性稀有有核细胞的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种对非体液性稀有有核细胞进行检测的新方法，对于多种手段得到生物体液中的非体液性稀有有核细胞，通过联合使用体液性细胞表面标志物的抗体以及非体液性稀有有核细胞的特异性探针，达到鉴别富集后的该稀有有核细胞的目的。相对于目前市场上已有的商品化鉴别方法而言，本方法将处理非体液性稀有有核细胞的荧光原位杂交（FISH）方法与处理体液性有核细胞的免疫荧光染色进行了良好的结合，针对同一张标本片进行系统的结合性处理，能同时并清晰地观察到这两种处理的结果。
【专利说明】一种检测非体液性稀有有核细胞的方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种非体液性稀有有核细胞的检测方法，其包括在对样品进行重固定之后，结合使用体液性细胞表面标志物的抗体和非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理待检测样品。本发明还涉及包含1.)体液性细胞表面标志物的抗体；i1.)非体液性稀有有核细胞的特异性探针；和ii1.)重固定剂的试剂盒，该试剂盒用于本发明的方法的用途，以及实现本发明的方法的检测系统。
【背景技术】
[0002]近年来，越来越多的报道热衷于循环肿瘤细胞(CTC)、循环内皮细胞(CEC)、肿瘤干细胞等的研究，成果多覆盖于乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等实体瘤(Joost，CytometryPart A, 75A, 2009; Shaffer DR, Clin Cancer Research, 2007，13 (I))。其中美国国家食品药品管理局已审批通过Immunicon/Veridex公司的CellSearch?循环肿瘤细胞试剂盒,通过对CTC的捕获后计数，可用于转移性乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等肿瘤预后情况的临床预测。目前该试剂盒也已通过我国国家食品药品监督管理局的审批，可在国内临床上使用。
[0003]很多报道显示，CTC计数不但可为肿瘤的预测、治疗、预后等提供很好的判断依据，同时也可为下一步研究提供良好的平台，例如在该细胞基础上进一步研究患者肿瘤细胞的遗传信息。因此准确分离CTC，并可长时间保存尤为重要。已有报道的分离CTC的方法主要以免疫磁珠分离法以及基于细胞形态学的富集法等为主，后期再辅以相应的方法鉴别所得细胞，主要为上皮源标志物，也有特异性探针的荧光原位杂交(FISH)方法检测。
[0004]多数免疫磁珠分离法的报道依赖于上皮源标志物对CTC的免疫阳性捕获及检测，例如CellSearch?的CTC检测试剂盒，即是利用上皮源标志物EpCAM的免疫磁珠捕获CTC，后期采用上皮源标志物CK8，18和/或19的免疫荧光染色方法来进一步鉴别。
[0005]目前血液中出现上皮源标志的细胞即被认为是CTCjBEpCAM,细胞角蛋白(CK)等，但缺乏有力的证据证明这些细胞就是CTC，而不是上皮细胞本身进入体液带来的假阳性细胞。除此之外，EpCAM和CK等上皮源标志物在入血的过程中，经过上皮间皮转化过程，其阳性会有所减弱甚至消失，因此弱阳性及假阴性给CTC的判定带来了很大的干扰。另外，因缺乏高特异性的肿瘤相关抗原，免疫阳性捕获在分离CTC的过程中容易丢失真正的肿瘤细胞，如后期检测继续使用上皮标志物，则增加了假阴性结果的风险。
[0006]另有一种免疫磁珠分离法叫做阴性免疫磁珠CTC富集法，其利用包被了血源性表面标志物CD45的免疫磁珠去除血液样本中98-99%的白细胞，将剩余细胞涂片，再对这些剩余的细胞进行检测。该富集方法避开了依赖于上皮标志物的免疫阳性捕获途径，能高效地拿到CTC。但该方法的局限性在于后期检测灵敏度及特异性较低。经阴性去除白细胞富集所得的CTC及白细胞混合物，背景较高，如利用上皮源标志物进行鉴定，则更容易受到弱阳性及假阴性的困扰。
[0007]利用形态学的CTC富集法是目前常用的另一种富集肿瘤细胞的方法，该方法对设备要求不高，方法较为简单。例如OncoQuick分离法，用一种专用的50ml试管，内置多孔屏障，其下为密度梯度分离液，使用时，将标本置于屏障之上，从而避免在离心时直接与分离液混合而污染。该法比常用的Ficoll法对肿瘤细胞的回收率更高(Rosenber R，Cytometry, 2002，49(4))。但过多依赖于肿瘤细胞的形态学特性，如相对密度、细胞大小等，缺乏特异性。近几年兴起的ISET分离法，根据肿瘤细胞与正常细胞的大小不同来分离肿瘤细胞，目前还没有报道证实所有的肿瘤细胞都大于8um，使其分离的灵敏性受到质疑。因此对该法分离的CTC，如不能辅以很好的后期检测，则由判定引起的细胞丢失的可能性也较大。
[0008]对于检测来说，有多种检测方法，其中一种为利用免疫细胞化学(ICC)来检测CTC的方法，即利用肿瘤标志物来对获得的细胞进行定位、定性及定量，如上皮源细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)，上皮细胞膜特异性抗原(EMA、HMFG, HEA-125等)，肿瘤相关糖蛋白(TAG)等。其优点为可观察到细胞形态，缺陷在于敏感性较低。
[0009]另一个用的较多的检测方法为流式细胞术，但其易受标本保存、研究人员差异等因素干扰，造成结果误差。
[0010]此外，新近出现的CTCs-ChiP也是一项集富集与检测为一体的先进技术，检测灵敏度非常高，即使只有极少量的肿瘤细胞。也只需一个步骤即可从全血中富集CTC，检验可随时进行，结果不会受肿瘤细胞间断释放的影响，便于对患者进行实时监测，且不影响细胞活性，有利于进一步进行分子生物学和遗传学分析(Nagrath S，Nature2007, 450 (7131)) ?但其价格昂贵。
[0011]后期鉴定的方法中，也有少数报道采用了 FISH技术来鉴别(Joost，CytometryPart A, 2009 ;75A; Katz R L, Clin Cancer Res; 2008，16 (15))。FISH 方法依赖于遗传学的改变，相比于上皮标志物来说有很大的稳定性，能很大程度地避免上述的上皮细胞污染，以及弱阳性和假阴性的产生。而对于阴性去除白细胞的方法，用FISH检测，更容易受到残留的杂质等因素的影响，带来了另外一种假阳性细胞干扰，给结果的判断及更进一步的研究带来很大困难。因此，无论是利用上皮标志物，还是采用传统的FISH检测，均不可避免地干扰了结果的最终判断。且单独使用FISH同样缺乏证据证明其是CTC，而不是血源性的异常细胞，例如已有报道显示在肺癌初期淋巴细胞也有遗传性的改变(B J Dave, CancerEpidemiol Biomarkers Prev, 1995,4(7))。
[0012]已有的以FISH、CK阳性、⑶45阴性鉴定CTC的报道中，多为免疫荧光染色和FISH分开处理标本，即先用免疫荧光方法将标本染色，经读片鉴定后，揭去盖玻片，洗掉免疫突光信号，再用FISH处理(任传利,2008,中国肿瘤，17(6) ；Margaret A, Clin CancerRes; 2009, 15 (6) ;Elizebeth A, Plos ONE, 2010,5(9) )? 如将两种方法分开处理待检测样品，则先进行免疫荧光后FISH处理，不能先进行FISH处理，因为随着离体时间的延长，细胞上的抗原降解愈发严重，如在标本观察结果后再进行免疫荧光，则很可能已无法观察到CK或⑶45。但无论哪种处理顺序，需将标本盖上盖玻片，待显微镜下鉴别完毕后，再洗去盖玻片进行下一步处理。这样处理，虽然可以利用FISH鉴别信号，但在揭掉盖玻片的过程中，极易丢失及损坏细胞。如第一次镜下鉴别到阳性细胞，在此定位基础上再定位寻找目标细胞，容易发生偏差，如无精密的定位装置，而依靠人工定位或不精密的定位装置，则会使找寻工作需耗费较长的时间，降低了检测效率。
【发明内容】
[0013]针对以上提出的单独使用上皮细胞标志物检测非体液性稀有有核细胞易产生假阳性、弱阳性或假阴性结果，而单独使用FISH不能确定是否为淋巴细胞突变或杂质干扰，以及分开使用FISH及免疫荧光处理容易丢失及损伤细胞，重复定位操作困难，且先进行FISH处理及FISH结果的观察，容易弓I起免疫标志物的降解等技术问题，本发明提出一种稀有细胞的检测方法，其结合使用白细胞标志物作为体液性细胞表面标志，以肿瘤特异性的核酸突变作为FISH检测探针的方法，既能够同时观察两种信号，又能避免细胞丢失及损伤，且因省略了一次结果的观察，能够最大程度避免细胞表面抗原标志物的降解，提高了非体液性稀有有核细胞细胞检测的灵敏度和特异性，另一方面又可以提高读片速度，避免重复定位。用体液性细胞表面标志物抗体去除血源性细胞及杂质的干扰；用FISH特异性探针鉴定稀有细胞。
[0014]本发明在传统的FISH技术基础上进行了改进，将其与生物的体液性细胞表面标志物结合起来，即对于同一个标本，先以重固定剂例如多聚甲醛进行重固定，再用体液性细胞表面标志物的抗体及非体液性稀有有核细胞的FISH特异性探针两个试剂来处理所得细胞(可视体液有核细胞表面标志物表达强弱及实验需求，设置调换两种方法的处理顺序)。最终同时用两个标准来判定所得细胞区分体液性有核细胞和非体液性稀有有核细胞，排除了体液性有核细胞的假阳性干扰。
[0015]具体地，本发明包括以下内容:
[0016]实施方式1.一种对非体液性稀有有核细胞进行检测的方法，其包括:
[0017]a.用重固定剂重固定待检测样品，
[0018]b.在步骤a之后，使用体液性细胞表面标志物的抗体和非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理待检测样品，
[0019]c.在显微镜下读取处理结果。
[0020]实施方式2.实施方式I的检测方法，其中所述待检测样品是从生物体液富集非体液性稀有有核细胞获得的样品。
[0021]实施方式3.实施方式I的方法，其中所述非体液性稀有有核细胞是体液中非体液性质的稀有有核细胞。
[0022]实施方式4.实施方式I的方法，其中所述体液性细胞表面标志物是用于免疫荧光技术的标志物，包括:CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84，或 CD 102。
[0023]实施方式5.实施方式I的方法，其中所述非体液性稀有有核细胞的特异性探针是用于荧光原位杂交(FISH)的探针。
[0024]实施方式6.实施方式I的方法，步骤b为以下的任一种:
[0025](i):先用体液性细胞表面标志物的抗体处理，再用非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理；
[0026](ii):先用非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理，再用体液性细胞表面标志物的抗体处理；
[0027](iii):同时使用体液性细胞表面标志物的抗体和非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理；
[0028](iv):交替使用体液性细胞表面标志物的抗体和非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理，或包含(i)至(iii)中两种、三种或四种的组合。
[0029]实施方式7.实施方式I的方法，其中所述重固定剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸，或其组合，优选为多聚甲醛为0.2-8%(W/V)，更优选0.8-5%多聚甲醛，最优选1.2-4%多聚甲醛。
[0030]实施方式8.实施方式I的方法，其中所述方法用于非治疗用途。
[0031]实施方式9.实施方式8的方法，其中所述非治疗用途包括:用于科研目的的非体液性稀有有核细胞计数，用于非体液性稀有有核细胞遗传信息的研究平台。
[0032]实施方式10.—种用于检测稀有细胞的试剂盒，其包括:1.)体液性细胞表面标志物的抗体)非体液性稀有有核细胞的特异性探针；和ii1.)重固定剂。
[0033]实施方式11.实施方式10的试剂盒，其中所述体液性细胞表面标志物是用于免疫荧光技术的标志物。
[0034]实施方式12.实施方式10的试剂盒，其中所述非体液性稀有有核细胞的特异性探针是用于荧光原位杂交技术的探针。
[0035]实施方式13.实施方式11的试剂盒，其中所述用于免疫荧光技术的标志物为血源性细胞表面标志物。
[0036]实施方式14.实施方式12的试剂盒，其中所述用于荧光原位杂交技术的探针为所述非体液性稀有有核细胞特异性的核酸探针。
[0037]实施方式15.实施方式10的试剂盒，其还包括说明书，其中所述说明书中记载前述实施方式I至9中任一项的方法。
[0038]实施方式16.实施方式10的试剂盒，其中所述重固定剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸，或其组合，优选为多聚甲醛为0.2-8% (ff/V),更优选0.8-5%多聚甲醛，最优选1.2-4%多聚甲醛。
[0039]实施方式17.—种稀有细胞的检测系统，其能够进行实施方式I至9中任一项的方法，和/或能够使用实施方式10至16中任一项的试剂盒处理待检测样品。
[0040]实施方式18.实施方式17的系统，其中所述系统是自动化系统。
[0041]实施方式19.实施方式10至16中任一项的试剂盒用于实施方式I至9中任一项的方法中的用途。
[0042]本发明的主要特征之一是结合使用体液性细胞表面标志物的抗体和非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理待检测样品。在具体的实施方式中，用FISH特异性探针鉴定非体液性稀有有核细胞，使用体液性细胞表面标志物的抗体去除体液性细胞的干扰，以排除FISH的假阳性。如将两种方法分开处理待检测样品，无论是先进行FISH后免疫荧光处理，或先进行免疫荧光后FISH处理，均需将标本盖上盖玻片，待显微镜下鉴别完毕后，再洗去盖玻片进行下一步处理，此操作极易丢失及损伤细胞。且如先进行FISH处理，待观察后再进行免疫荧光处理的话，则细胞表面的免疫标志物随着时间的延长，降解程度将急剧增力口。而本方法同时观察这两种方法处理所得的信号，不需通过重复定位找到目标细胞来观察第二次处理结果。并且避免分开处理导致的细胞丢失及伤害等情况，从而提高了检测效率及灵敏度。此外，本方法可根据目的需求来调换FISH及免疫荧光的处理顺序，为不同目的的实验提供了极大的便利。
[0043]总之，本发明优势在于:[0044]1.体液性有核细胞表面标志物的抗体与非体液性稀有有核细胞特异性探针组合检测，具有很高的检测灵敏度、特异性以及效率。
[0045]2.本方法可用于多种体液中的非体液性稀有有核细胞的鉴别。
[0046]3.进一步发现，在使用重固定剂多聚甲醛后，效果更好。
[0047]4.更进一步发现，1%多聚甲醛的最佳固定时间第8-12分钟(即可控时间范围为4分钟)，相比于2%、4%多聚甲醛的可控时间范围(〈2分钟)，更利于标本较多时的操作。因此，在本发明优选的实施方式中，使用1%多聚甲醛作为重固定剂处理4-20分钟，更优选8-12分钟。
[0048]5.多个肿瘤标志物与FISH联合，可稍许提高阳性细胞的计数结果，但同时也增加了假阳性，且操作繁琐。因此本方法更利于特异性的提高。
[0049]6.本方法处理后的标本片，仍可作为下一步基因研究的平台。
【专利附图】
【附图说明】
[0050]图1是本方法的灵敏度测试结果。
[0051]图2是仅用FISH方法的灵敏度测试结果。
[0052]图3是正常人中本方法与仅用FISH方法测得的假阳性结果。
[0053]图4是血液标本中本方法检测到的阳性细胞。
[0054]图5是本方法检测到的肿瘤细胞的EGFR基因电泳图。
[0055]图6是不同浓度多聚甲醛固定效果的对比结果。
[0056]定义:
[0057]体液性有核细胞:指某种生物的体液中所含有的有核细胞，如白细胞，白细胞包括淋巴细胞(T细胞、B细胞)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等。
[0058]非体液性稀有有核细胞:循环的具有上皮来源的或不具有上皮来源的肿瘤细胞和循环的血管内皮细胞，肿瘤干细胞，干细胞，血中胎儿细胞，某些免疫细胞等稀有细胞。所述非体液性稀有有核细胞在血液中占所有有核细胞的0.1 %以下。在本申请中，在描述本发明的方法时，术语稀有细胞就是指此处的非体液性稀有有核细胞。
[0059]循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell, CTC):通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞是非体液性稀有有核细胞的一种。
[0060]循环内皮细胞(Circulating endothelial cell, CEC):把脱落入血的血管内皮细胞称为循环内皮细胞。循环内皮细胞也是非体液性稀有有核细胞的一种。
[0061]免疫突光技术(Immunofluorescence):用突光抗体示踪或检查相应抗原的方法，称为荧光抗体法；用已知的荧光抗原示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术。
[0062]突光原位杂交技术(Fluorescencein situ hybridization, FISH):用突光标记的核酸探针在染色体上进行的杂交方法，以确定与探针互补的核酸序列在染色体上的位置和分布。
[0063]间期(Interphase):细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂的分裂期之前的时期，是有丝分裂的准备阶段。一个细胞在细胞循环90%左右的时间是在间期中。
[0064]同源染色体(Homologous chromosomes):在二倍体生物细胞中，形态、结构基本相同的染色体。
[0065]等位基因(Allele):位于一对同源染色体的相同位置上控制某一性状的不同形态的基因。
【具体实施方式】
[0066]本发明中的待检测样品通常是从生物体液富集非体液性稀有有核细胞获得的样品O
[0067]对于已富集的非体液性稀有有核细胞，用固定剂固定，均匀涂在载玻片上，室温放置，直至样本全部干燥。但勿放置过久，以免体液性标志物降解。一般室温下可过夜，之后短期内，可放于4°C冰箱待处理；长期不进行检测，可放于-20°C冰箱待处理。
[0068]FISH处理，使标本的目标核酸结合上特异性的荧光探针。
[0069]免疫荧光处理，使标本的目标蛋白结合上体液性表面标志物。
[0070]经以上处理后的标本可长期保存于4°C达二年以上。
[0071]从生物体液样本中富集稀有细胞的方法介绍
[0072]在本申请中，以富集循环肿瘤细胞(CTC)的方法为例，介绍富集稀有细胞的方法。富集CTC的方法以形态学和免疫学为主，主要有以下几种:
[0073]基于形态学的富集方法:
[0074]单核细胞相对于其他血液成分密度较低，因此能根据密度梯度的差别将其分离。采用1.077g/ml的密度梯度，单核细胞和肿瘤细胞可以与血液其他成分分离。Oncoquick就是基于密度梯度分离的原则，增加了多孔屏障，使分离出的细胞更加纯化。
[0075]ISET方法利用分子大小来分离肿瘤细胞，通过不同大小的孔径，将>8um的肿瘤细胞保存下来。
[0076]基于免疫学的富集方法:
[0077]免疫磁珠法原理是细胞表面抗原分子能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场的作用下，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸引而留在磁场中，而其他细胞因为不带磁性，不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。基于免疫学的富集方法分为阴性和阳性两种。免疫阴性富集可用抗CD45抗体，或是抗CD61抗体移除血液中的巨核细胞及血小板。免疫阳性分选可通过磁性微球连接上抗上皮的抗体，如EpCAM。
[0078]一般的稀有细胞的检测方法的步骤:
[0079]免疫细胞化学法是指以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学的呈色反应。其检测技术主要分为三类:1)上皮细胞角蛋白(CK)，如CK19、CK20等；2)上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA、HMFG、HEA-125等；3)肿瘤相关蛋白(TAG)。其主要优点是可进行细胞大小和形态学的分析，缺点是灵敏度低，只能在IO5个细胞中检测到一个肿瘤细胞。
[0080]流式细胞术作为检测CTC数目的方法之一，集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学及单克隆抗体技术为一体，不仅能鉴定标本中细胞抗原性和形态学特征，还能使富集的目的细胞保持形态学特性并保持细胞活力。但该技术检测细胞的价值很大程度上依赖于可分析的细胞数量，且受标本固定贮存及研究人员间的差异等因素的干扰，且价格昂贵、耗时较长。[0081]PCR检测CTC主要是通过检测癌基因、抑癌基因的突变。该方法灵敏度高，能在IO6个细胞中检测到一个肿瘤细胞，但极易出现假阳性，且使用范围有限。因血液中CTC和核酸的半衰期不稳定，检测到的游离DNA，可能仅仅是核酸，而不是真正的肿瘤细胞。
[0082]近些年开发出的实时定量RT-PCR，具有引物和探针的双重特性，扩增效率高，反应污染少，Ct值稳定等优势，但是该方法不能对细胞形态进行分析。
[0083]本发明的稀有细胞的检测方法包括以下步骤:
[0084]1.重固定剂重固定待检测样品；
[0085]2.进行FISH和免疫荧光处理；
[0086]3.读片(例如，在显微镜下读取处理结果)。
[0087]通常，在使用重固定剂重固定待检测样品之前，常常需要准备已固定于载玻片上的待检测样品；若待检测样品为液体，则要涂于载玻片上至完全干燥。然而这个步骤对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且本领域技术人员能够进行该步骤。
[0088]在步骤I中，对于待检测样品例如已富集的非体液性稀有有核细胞进行多聚甲醛重固定。
[0089]FISH处理:在37 °C的2 X SSC中浸泡5_15min，后经75%、85%、无水乙醇逐级脱水。加入IOul探针，盖上盖玻片，变性5分钟，杂交20分钟-4小时不等。然后甲酰胺(ρΗ7.0±0.I)中洗涤 15min，或 ΝΡ40 洗涤 l_5min。
[0090]免疫荧光处理:室温下，体液性表面标志物避光孵育标本40分钟-1小时。轻轻洗掉标志物后，DAPI (4，6-二氨基一 2—苯基吲哚)复染封片，即可镜下观察。该处理后的标本可长期保存于4°C。
[0091]读片:在显微镜下读取检测结果。镜下“S”型扫读，确保无遗漏细胞。体液性有核细胞表现为:单个核呈圆形或椭圆形，体液性细胞表面标志物抗体呈阳性，DAPI呈阳性，以及任何数量的探针阳性点个数，多数情况下为2个点，部分细胞因试剂或血液中残留的杂质或自身的突变而表现为3个以上的点，或较少部分细胞未能充分杂交而呈现为I个点。非体液性稀有有核细胞需符合以下要求:单个核呈圆形或椭圆形，扩增型探针阳性表现为> 3个点，体液性细胞表面标志物为阴性，DAPI阳性。缺失型探针表现为〈2个点，体液性细胞表面标志物阴性，DAPI阳性。
[0092]本发明的方法提高灵敏度和特异性的原因:
[0093]DNA在稳定性方面，优于蛋白以及RNA等，因此利用FISH检测DNA，具有较高的灵敏度，但是如前述，检测同时产生的假阳性对特异性影响很大。本发明的方法在使用了 FISH技术的基础上，又结合了体液细胞标志物，降低了假阳性的出现，从而在很大程度上提高了特异性。
[0094]从生物体液中，通过上述某一种富集方法富集得到的非体液性稀有有核细胞后，将富集所得的样本涂于载玻片，并加以固定。经过本方法鉴定之后，该细胞可以其他方式将细胞取出，进行PCR的检测。
[0095]该体液可以是外周循环血、脐带血、尿液、脊髓及胸腔积液、腹水、精液、骨髓、羊水、痰液等多种可能存在稀有有核细胞，且可用于富集的生物体液。非体液性稀有有核细胞包括循环肿瘤细胞，循环内皮细胞，肿瘤干细胞，干细胞，血中胎儿细胞，某些免疫细胞等稀有细胞。[0096]该体液如含白细胞，即可用血源性表面标志物对其进行免疫荧光染色处理。血源性标志物包括:⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶50、⑶69、⑶84，或⑶102等。用于荧光原位杂交技术的探针为对待检测的稀有有核细胞具有特异性的核酸探针，其在肿瘤细胞中会有某种特异性的突变，如扩增、缺失等。
[0097]对标本处理，调节免疫荧光染色与荧光原位杂交的顺序，对最终效果有不同的影响。
[0098]同样条件下，包括同样的温度、PH值、处理时间，同样的固定方法等，不同的处理顺序所得到的效果不尽相同。
[0099]对标本先进行FISH，再进行免疫荧光染色处理，所得到的免疫荧光效果较弱。例如，在使用来源于血液的标本的情况下，在体液标本中的血源性表面标志物表达较强的情况下，该顺序操作较为简单，血源性表面标志物即可起到很好的辅助判断作用，且FISH信号能较好地得到保持。
[0100]而对于血源性表面标志物表达一般的情况下，先进行免疫荧光染色，再进行FISH处理；若该标志物表达较弱，可先进行免疫荧光染色，再进行FISH处理，之后再进行一次免疫荧光染色。这样所得的顺序，能得到较强的免疫荧光染色效果，又能观察到较好的FISH信号。
[0101]而同时进行免疫荧光和FISH处理，在这些处理顺续中，属于效果较不理想的一项。二者均受对方处理方式的影响，以至于效果均受影响，所得的免疫荧光效果稍显弥散，FISH信号也较弱。
[0102]以上任意一种本方法的处理，均可用自动化系统进行编程，继而对标本进行操作，包括不同顺序的处理，以及向标本加探针、抗体，以及对标本进行扫描读片等操作。
[0103]本发明的技术方法的具体步骤:
[0104]可用不同的富集方法，对可用于富集的体液进行富集非体液性稀有有核细胞获得带检测样品，用固定剂固定，均匀涂在载玻片上，面积约为4cm2。室温放置，直至样本全部干燥。
[0105]FISH处理，使标本的目标核酸结合上特异性的荧光探针。
[0106]免疫荧光处理，使标本的目标蛋白结合上体液性表面标志物。
[0107]读片。
[0108]一方面，本发明提供了一种对非体液性稀有有核细胞检测的方法，其包括使用体液性表面标志物、非体液性稀有有核细胞的特异性探针以及连接试剂1%多聚甲醛处理待检测样品。
[0109]另一方面，本发明提供了一种检测非体液性稀有有核细胞试剂盒，包括:a.)体液性表面标志物；b.)非体液性稀有有核细胞的特异性探针」和/或c)其组合；d) —种连接FISH和免疫荧光染色方法的试剂1%多聚甲醛。其中体液性表面标志物为抗单克隆或多克隆的混合物。特异性探针为适用于FISH杂交的核酸探针。
[0110]本发明的方法或者试剂盒具有高特异性、高灵敏度的特点，减小了细胞丢失频率，避免了操作的复杂性，可根据实验需求设置处理顺序，并且同时观察可极大地提高鉴别速度。而将两种方法分开处理样本则操作复杂(即先用FISH处理，镜下鉴别观察后，洗掉盖玻片，再进行免疫荧光；或反之，但均需洗掉盖玻片，该步骤极容易丢失细胞，操作需非常小心谨慎)，易丢失细胞，需重复定位，对于第一次处理后鉴别的阳性细胞，如无精密的定位系统，只有人工定位或不精密的定位装置，找到该阳性细胞的工作将非常困难。
[0111]在本发明的实施方式中，体液性表面标志物为某一生物的体液中，该体液性有核细胞共同表达或大部分表达的抗原。
[0112]优选地，生物体液性标志物是指血源性表面标志物，例如⑶3、⑶31、⑶34、⑶45、⑶50、⑶69、⑶84，或⑶102等，但不限于这些物质。
[0113]在本发明的实施方式中，所述的生物体液性标志物使用标记蛋白类的荧光素进行
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[0114]优选地，标记蛋白的荧光素是指能够直接或间接与蛋白共价或非共价偶联的任何颜色的突光素，例如，Alexa Flour系列分子,FITC, Texas Red,罗丹明(rhodamine),生物素(biotin),地高辛(digoxigenin),但不限于这些物质。
[0115]在本发明的实施方式中，FISH杂交所用的核酸探针为在某种疾病中出现遗传性改变的核酸片段。所述在某种疾病中出现遗传性改变的核酸片段包括扩增、缺失、重排，以及其他形式的突变等情况。
[0116]在本发明的实施方式中，FISH方法的鉴别原理是检测间期细胞的基因突变情况。正常人的体液性有核细胞正常情况下不会分裂生长，而处于间期状态，此时含有2条同源染色体，或2个等位基因。而恶性肿瘤细胞发生扩增或缺失等突变时，间期表现为> 3或< I条染色体，> 3或< I个等位基因。利用核酸探针，可与每条染色体发生突变的区域杂交，并通过结合荧光素，达到镜下观察的目的。CTC为恶性肿瘤细胞从组织上脱落入血，具有典型的恶性肿瘤细胞的特征。镜下观察到的FISH信号以“点”的形式表现出来，即I条染色体或I个等位基因对应I个点，如正常人体液性有核细胞为2个点，即可对应2条染色体，或2个等位基因。
[0117]优选地，由于某些恶性肿瘤的淋巴细胞也会发生突变，或试剂及血液中残留的杂质，部分细胞杂交异常等原因，使得体液性有核细胞也表现为异常，即镜下观察为> 3或< I个点。本发明的实施方式，通过体液性表面标志物⑶45即可排除以上三种形式的干扰，从而鉴别出真正的非体液性稀有有核细胞。因此当我们观察到一个细胞核中信号数目> 3或< 1，且无⑶45时，即可视为CTC阳性；反之，为阴性。
[0118]在本发明的实施方式中，该核酸探针尤其是指双链或单链DNA探针。
[0119]在本发明的实施方式中，优选待测样品是从生物体液富集非体液性稀有有核细胞获得的样品。
[0120]优选地，如检测对象为RNA，则一定在进行生物体液的前期富集步骤中采用RNA保护剂，以避免RNA降解。
[0121]在本发明的实施方式中，所述的特异性探针使用标记核酸类的荧光素进行标记。
[0122]优选地，标记核酸类的荧光素是指能够直接或间接与核酸共价或非共价结合的任何颜色的荧光素，例如，Alexa Flour系列分子，FITC，Texas Red，罗丹明(rhodamine)，生物素(biotin),地高辛(digoxigenin),但不限于这些物质。
[0123]在本发明的实施方式中，需将待检测样品涂在载玻片上。
[0124]优选地，载玻片是指任何经过或未经过化学处理的适合荧光显微镜下观察的载玻片。[0125]优选地，为了减少非体液性稀有有核细胞的丢失，本技术所用的载玻片尤其是指防脱载玻片，即在普通载玻片表面涂有防脱剂，如多聚赖氨酸，但不限于该物质。
[0126]在本发明的实施方式中，在室温下利用免疫荧光技术，将样本与体液性标志物孵育。
[0127]优选地，该孵育过程避光处理，可避免光线引起的荧光素降解。
[0128]在一种实施方式中，使用本方法提供的试剂盒时，或者实施本发明的方法时，在FISH过程中控制变性温度为71-81°C，优选为76 V ;控制杂交温度为32至42°C，优选为37。。。
[0129]在一种实施方式中，为了减少非体液性稀有有核细胞的丢失，可使用杂交仪。所述杂交仪是一种通过金属加热板对载玻片整体温度进行控制的仪器。避免使用液体控温，因为如果将载玻片浸没在液体中，则有可能增加稀有有核细胞丢失的可能性。
[0130]对于不同的疾病来说，例如肿瘤、心脏病等，只要其细胞具备进入体液的功能，使用相应的特异性探针，即可将其与生物体液性有核细胞区分开来，增加了鉴定的特异性。该点克服了上皮源标志物不具有指向性的缺陷，从而为肿瘤的早期诊断提供了良好的手段。
[0131]而相比于传统FISH，本方法借助于生物体液性标志物，很大程度上减小了假阳性的出现率，解决了 CTC鉴别上的难题(图1)。
[0132]本鉴定技术不受富集方法的影响，对于任何一种富集方法所得的非体液性稀有有核细胞，只要将所得细胞涂片于载玻片上，均可用该试剂盒来鉴别。
[0133]另一方面，该方法避开上皮标志物的使用，能很大程度减小因上皮间皮化而产生的弱阳性及假阴性，以及上皮细胞的假阳性污染。
[0134]该手段检测到的肿瘤细胞，结果清晰，易于观察，特异性高，为进一步研究搭建了良好的平台。
[0135]该法由于灵敏度高，对用血量要求即可降低到3.75ml左右，较FDA通过的CellSearch? CTC检测试剂盒所需的7.5ml血量低，从而进一步减少了处理血样品所耗费的人力及物力。
[0136]本方法的标本(本申请中所述的标本即为待检测样品)来源为人或其他动物的体液。
[0137]优选地，本方法的标本来源尤其是指人的体液。
[0138]优选地，本方法的标本来源尤其是血液。
[0139]本方法不需对标本进行任何处理，如消除外源性蛋白酶、RNA等，从而减小了损失细胞的可能性，同时也利于最大程度地保存生物体液的标志物。
[0140]后期鉴定方法标志性较强，很大程度上排除了主观上的干扰，能够相对客观地评价出非生物性稀有有核细胞。
[0141]除此之外，该方法耗时相对较短，整个操作过程可控制在2小时内完成。
[0142]本发明的方法的优点在于，是针对同一标本，在一次系统性结合性的操作中完成FISH与免疫荧光染色，可根据实验需求设置两种方法的处理顺序，最后同时观察这两种处理结果，而不是分次完成，分别观察上述两种结果。
[0143]相对于目前市场上已有的商品化鉴别方法而言，本方法将处理特异性稀有有核细胞的荧光原位杂交(FISH)方法与处理体液性有核细胞的免疫荧光染色进行了良好的结合，针对同一张标本片进行系统的结合性处理，能同时并清晰地观察到这两种标志物。避免了分开使用上述两种方法处理同一标本，导致的细胞丢失及伤害的可能性，不需通过重复定位来找寻第一次处理所得的目标细胞，从而使鉴别的灵敏度、特异性、观察速度均有了很大提高，且已被证明成本低、效率高、耗时短，能够满足检测稀有有核细胞的需要。
[0144]实施例
[0145]实施例中使用的材料以及来源
【权利要求】
1.一种对非体液性稀有有核细胞进行检测的方法，其包括: a.用重固定剂重固定待检测样品， b.在步骤a之后，使用体液性细胞表面标志物的抗体和非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理待检测样品， c.读片，例如在显微镜下读取处理结果。
2.权利要求1的检测方法，其中所述待检测样品是从生物体液富集非体液性稀有有核细胞获得的样品。
3.权利要求1的方法，其中所述非体液性稀有有核细胞是体液中非体液性质的稀有有核细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述体液性细胞表面标志物是用于免疫荧光技术的标志物，包括:CD3、CD31、CD34、CD45、CD50、CD69、CD84,或 CD102。
5.权利要求1的方法，其中所述非体液性稀有有核细胞的特异性探针是用于荧光原位杂交(FISH)的探针。
6.权利要求1的方法，步骤b为以下的任一种: (i):先用体液性细 胞表面标志物的抗体处理，再用非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理； (?):先用非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理，再用体液性细胞表面标志物的抗体处理； (iii):同时使用体液性细胞表面标志物的抗体和非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理； (iv):交替使用体液性细胞表面标志物的抗体和非体液性稀有有核细胞的特异性探针处理，或包含(i)至(iii)中两种、三种或四种的组合。
7.权利要求1的方法，其中所述重固定剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸，或其组合，优选为多聚甲醛为0.2-8% (W/V)，更优选0.8-5%多聚甲醛，最优选1.0-4%多聚甲醛。
8.权利要求1的方法，其中所述方法用于非治疗用途。
9.权利要求8的方法，其中所述非治疗用途包括:用于科研目的的非体液性稀有有核细胞计数，用于非体液性稀有有核细胞遗传信息的研究平台。
10.一种用于检测稀有细胞的试剂盒，其包括:1.)体液性细胞表面标志物的抗体；i1.)非体液性稀有有核细胞的特异性探针；和ii1.)重固定剂。
11.权利要求10的试剂盒，其中所述体液性细胞表面标志物是用于免疫荧光技术的标志物。
12.权利要求10的试剂盒，其中所述非体液性稀有有核细胞的特异性探针是用于荧光原位杂交技术的探针。
13.权利要求11的试剂盒，其中所述用于免疫荧光技术的标志物为血源性细胞表面标志物。
14.权利要求12的试剂盒，其中所述用于荧光原位杂交技术的探针为所述非体液性稀有有核细胞特异性的核酸探针。
15.权利要求10的试剂盒，其还包括说明书，其中所述说明书中记载前述权利要求1至9中任一项的方法。
16.权利要求10的试剂盒，其中所述重固定剂选自戊二醛、甲醛、丙酮、甲醇、乙醇、醋酸、丙烯醛、醋酸铀、铬酸、苦味酸，或其组合，优选为多聚甲醛为0.2-8% (W/V)，更优选0.8-5%多聚甲醛，最优选1.0-4%多聚甲醛。
17.一种稀有细胞的检测系统，其能够进行权利要求1至9中任一项的方法，和/或能够使用权利要求10至16中任一项的试剂盒处理待检测样品。
18.权利要求17的系统，其中所述系统是自动化系统。
19.权利要求10至16中任一项的试剂盒用于权利要求1至9中任一项的方法中的用途。
【文档编号】G01N21/64GK104007257SQ201310057307
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月24日 优先权日:2013年2月24日
【发明者】詹厅 申请人:北京莱尔生物医药科技有限公司