专利名称：寡肽的纯化方法
技术领域：
本发明涉及 一 种从含有寡肽及中性氨基酸的溶液中分离.纯化寡 肽的方法。
背景技术：
作为制造寡肽的方法，例如已知(a)使用来自枯草杆菌的肽合成 酶由无保护的L-氨基酸进行制造的方法(参见非专利文献l) 、 (b) 使用具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的酶或含酶物质由L-氨基酸酰胺 及L-氨基酸进行制造的方法(参见专利文献1) 、 (c)使用具有生 成二肽活性的蛋白质由L-氨基酸酯及L-氨基酸进行制造的方法(参 见专利文献2 4) 、 (d)使用氨基酸酯水解酶进行制造的方法(参见 专利文献5) 、 (e)使用由属于稳杆菌属(empedobacter)的细菌得 到的酶进行制造的方法(参见专利文献6 9)等。另外作为上述(a) 的例子，还已知(f)在含有葡萄糖及铵盐的培养基中，在基质氨基 酸存在下，培养表达来自枯草杆菌的二肽合成酶基因ywfe及丙氨酸 脱氢酶基因ald的大肠杆菌，生成二肽的方法(例如参见专利文献10) 等。进而已知(g)通过化学合成进行制造的方法(参见非专利文献2)、
在所述方法中，必须分离生成的寡肽和残留的杂质(例如基质等)。 特别是在使用酶的制造方法(例如上述(a) (f))中，生成的寡 肽和基质的分离经常成为问题。
作为生成的寡肽与基质氨基酸的分离纯化方法，例如已知利用凝 胶色语法、亲和色谦法、使用合成吸附树脂的色谱法、高效液相色谱 法等各种色语法的分离纯化方法，通过将生成的寡肽进行结晶的纯化 方法等(例如参见非专利文献2)。但是，在利用色谱法的纯化方法中，对载体及溶剂的选择通常需要进行充分研究，另外经常难以进行令人满意的纯化。进而，通常用作载体的合成吸附树脂等价格较高，不适合大规模的商业生产。另外，在结晶纯化法中，从含有中性氨基酸的粗产物中分离 纯化寡肽的情况下，例如在含有亮氨酸等溶解度低、结晶性良好的氨基酸时，有时难以除去该氨基酸。
还已知采用使用比较便宜的离子交换树脂的离子交换色谱法的
纯化方法(例如参见非专利文献2 4等)。但是，在以等电点明显不同的酸性氨基酸和碱性氨基酸作为基质制备的寡肽的分离纯化中，因为能够仅使该氨基酸吸附于强酸性阳离子交换树脂上和强碱性阴离子交换树脂上，故而有效[例如已知将含有亚氨基二羧酸及甘氨酸的水溶液用弱碱性阴离子交换树脂处理，使酸性物质亚氨基二羧酸吸附于树脂来分离甘氨酸的方法(参见专利文献11 )],但由等电点相近的中性氨基酸构成的寡肽与该中性氨基酸的分离较难。
另一方面，已知(1)将含有数种氨基酸的中性水溶液用弱酸性阳离子交换树脂处理，使碱性氨基酸吸附于树脂，用盐酸进行洗脱，由此分离碱性氨基酸的方法(参见专利文献12) ; (2)使从鲣鱼汤中得到的含有碱性氨基酸的鹅肌肽(N-p-丙氨酰-L-l-曱基-组氨酸)及肌肽(N-(3-丙氨酰-L-组氨酸)吸附于弱酸性阳离子交换树脂上，用氨洗脱，由此分离.纯化鵝肌肽和肌肽的方法(参见专利文献13)。所述方法利用碱性氨基酸或含有碱性氨基酸的二肽吸附于该弱酸性阳离子交换树脂上的性质。
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国际公开第2003/010187号说明书国际公开第2003/010189号说明书国际公开第2003/010307号说明书特开2005-040034号公报特开2005-168405号公报特开2005-269905号公报国际公开第2004/011652号说明书国际公开第2004/011653号说明书专利文献9:国际公开第2004/022733号说明书专利文献10:国际公开第2006/001379号说明书专利文献11:特开2005-298366号公才艮专利文献12:美国专利第2549378号说明书专利文献13:特公平第6-93827号公报
非专利文献l:《FineChemical》平成17年6月号，CMC出版，2005年，vol.34 No.6, p.25~35
非专利文献2:《肽合成的基础和实验》，丸善抹式会社，泉屋信夫、加藤哲夫、青柳东彦、胁道典著，1985年
非专利文献3:《生物化学实验指导2蛋白质的分离'分析法》，化学同人，泉美治、中川八郎、三轮谷俊夫共同编著，1985年，p.1 20
非专利文献4:《Diaionl基础篇(第18版)》，三菱化学抹式会社离子交换树脂事业部，平成15年11月1日，p.1
发明内容
本发明的目的是提供一种从含有寡肽及中性氨基酸的溶液中简便地分离.纯化寡肽的方法。
本发明涉及以下(1 ) ~ (21 )。
(1) 寡肽的纯化方法，所述方法包括使含有该寡肽及中性氨基酸的溶液在有效pH范围内与离子交换树脂接触的工序。
(2) 如(l)所述的方法，包括下述工序(a)将含有寡肽及中性氨基酸的溶液通过填充有离子交换树脂的柱的工序，以及(b)将与离子交换树脂接触的该寡肽用洗脱溶剂洗脱的工序。
(3) 如(1 )或(2)所述的方法，其中，离子交换树脂为弱酸性阳离子交换树脂。
(4) 如(3)所述的方法，其中，离子交换树脂为含有羧基或酚羟基的树脂。
(5) 如(3)或(4)所述的方法，其中，含有寡肽及中性氨基酸的溶液的pH在4 14的范围。(6) 如(3)或(4)所述的方法，其中，含有寡肽及中性氨基酸的溶液的pH在5 12的范围。
(7) 如(1 )或(2)所述的方法，其中，离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂。
(8) 如(7)所述的方法，其中，离子交换树脂为具有选自氨基、低级烷基氨基及二低级烷基氨基中的基团的树脂。
(9) 如(7)所述的方法，其中，离子交换树脂为具有选自氨基、甲基氨基及二甲基氨基中的基团的树脂。
(10) 如(7) ~ (9)中任一项所述的方法，其中，含有寡肽及中性氨基酸的溶液的pH在0 9的范围。
(11) 如(7) ~ (9)中任一项所述的方法，其中，含有寡肽及中性氨基酸的溶液的pH在1 7的范围。
(12) 如(1 ) (11 )中任一项所述的方法，其中，中性氨基酸为选自L-氨基酸、作为其旋光异构体的D-氨基酸以及它们的外消旋混合物、甘氨酸以及(3-丙氨酸中的氨基酸，所述L-氨基酸选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺及L-谷氨酰胺。
(13) 如(1 ) (11 )中任一项所述的方法，其中，中性氨基酸为选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-酪氨酸、DL-丙氨酸、DL-缬氨酸、DL-亮氨酸、DL-异亮氨酸、DL-酪氨酸及谷氨酰胺中的氨基酸。
(14) 如(1 ) ~ ( 13)中任一项所述的方法，其中，寡肽为二肽或三肽。
(15) 如(1 ) ~ ( 13)中任一项所述的方法，其中，寡肽为二肽。
(16) 如(14)或(15)所述的方法，其中，二肽为用X-Y (式中，X表示丙氨酸，Y表示L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-酪氨酸、DL-缬氨酸、I)L-亮氨酸、DL-异亮氨酸、DL-酪氨酸或谷氨酰胺)表示的二肽。
(17) 如(1 ) (16)中任一项所述的方法，其中，构成寡肽的氨基酸为L-氨基酸。
(18) 如(1 ) (17)中任一项所述的方法，其中，寡肽选自下述寡肽(A)用使来自枯草杆菌的肽合成酶作用于无保护的L-氨基酸进行制造的方法得到的寡肽；(B)使具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的酶或含酶物质作用于L-氨基酸酰胺及L-氨基酸制造的寡肽；
(C )使具有生成二肽的活性的蛋白质作用于L-氨基酸酯及L-氨基酸制造的寡肽；(D)在氨基酸酯水解酶的作用下制造的寡肽；(E)在由属于稳杆菌属的细菌得到的酶的作用下制造的寡肽；以及(F)利用化学合成得到的寡肽。
(19) 一种寡肽的制造方法，包括使用如(1 ) ~ ( 18)中任一项所述的方法的工序。
(20) —种采用(19)所述的方法制造的寡肽。
(21) 如(20)所述的寡肽，其中不含作为杂质的氨基酸。本发明提供一种从含有寡肽及中性氨基酸的溶液中简便地分离 纯
化寡肽的方法。
具体实施例方式
作为本发明的中性氨基酸，只要是溶解在水中时显示中性附近的pH的氨基酸即可，没有特别限定，例如可以举出选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺及L-谷氨酰胺中的L-氨基酸、它们的旋光异构体D-氨基酸、或它们的外消旋混合物、甘氨酸、P-丙氨酸、i氨基丁酸、肉碱等。
作为可适用于本发明的纯化方法的寡肽，例如可以举出2 10个氨基酸结合成直链或环状的寡肽，具体可以举出二肽、三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽、十肽、环四肽、环五肽、环六肽、
8环七肽、环八肽、环九肽、环十肽等。优选由2 3个氨基酸构成的二肽、三肽等。
构成可适用于本发明的纯化方法的寡肽的氨基酸的种类，没有特
别限定，可以举出天然存在的L-氨基酸、它们的异构体D-氨基酸、它们的外消旋混合物、甘氨酸、(3-丙氨酸、Y-氨基丁酸、肉碱等，其中优选具有1个以上中性氨基酸，较优选含有l个以上中性L-氨基酸、其异构体D-氨基酸、它们的外消旋混合物、甘氨酸、(3-丙氨酸等。构成氨基酸可以相同也可以不同。具体而言，优选具有l个以上L-氨基酸、其异构体D-氨基酸、或它们的外消旋混合物、甘氨酸、(3-丙氨酸等，所述L-氨基酸例如选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺及L-谷氨酰胺。
作为本发明的寡肽，优选具有1 10个相同或不同的所述优选的中性氨基酸的寡肽，较优选具有1个以上相同或不同的所述中性氨基酸的二肽、三肽等。更具体而言，例如优选式(1 ) Xa-YY-ZZ (式中，Xa表示选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺及L-谷氨酰胺中的L-氨基酸、其异构体D-氨基酸或它们的外消旋混合物、甘氨酸或J3-丙氨酸，YY及ZZ相同或不同，表示天然存在的L-氨基酸、其异构体D-氨基酸、它们的外消旋混合物、甘氨酸、(3-丙氨酸、？氨基丁酸、肉碱等)表示的三肽、式(2) Xa-YY (式中，Xa及YY分别与上述同义)表示的二肽、式(3) Xa-Ya-ZZ (式中，Xa及ZZ分别与上述同义，Ya表示选
自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺及L-谷氨酰胺中的L-氨基酸、其异构体D-氨基酸或它们的外消旋混合物、甘氨酸或P-丙氨酸)表示的三肽、式(4)Xa-Ya(式中，Xa及Ya分别与上述同义)表示的二肽、式(5 )Xa-Ya-Za
(式中，Xa及Ya分别与上述同义，Za表示选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、L-天冬酰胺 及L-谷氨酰胺中的L-氨基酸、其异构体D-氨基酸或它们的外消旋混 合物、甘氨酸或(3-丙氨酸)表示的三肽、式(6) Xa-YY-Za (式中， Xa、 YY及Za分别与上述同义)、式(7 ) XX-Ya-Za (式中，XX表 示天然存在的L-氨基酸、其异构体D-氨基酸、它们的外消旋混合物、 甘氨酸、(3-丙氨酸、Y-氨基丁酸、肉碱等，Ya及Za分别与上述同义) 表示的三肽或式(8) XX-Ya (式中，XX及Ya分别与上述同义)表 示的二肽，
较优选式(9) Xb-YY-ZZ (式中，Xb表示选自L-丙氨酸、L-蛋 氨酸、L-丝氨酸及L-苏氨酸中的L-氨基酸、其异构体D-氨基酸、或 它们的外消旋混合物、甘氨酸或(3-丙氨酸，YY及ZZ分别与上述同 义)表示的三肽、式(10) Xb-YY (式中，Xb及YY分别与上述同 义)表示的二肽、式(11) Xb-Ya-ZZ (式中，Xb、 Ya及ZZ分别与 上述同义)表示的三肽、式(12) Xb-Ya (式中，Xb及Ya分别与上 述同义)表示的二肽、式(13) Xb-YY-Za (式中，Xb、 YY及Za分 别与上述同义)表示的三肽或式(14) Xb-Ya-Za (式中，Xb、 Ya及 Za分别与上述同义)表示的三肽，
更优选式(15 ) Xc-YY-ZZ (式中，Xc表示L-丙氨酸，YY及ZZ 分别与上述同义)表示的三肽、式(16) Xc-YY (式中，Xc及YY分 别与上述同义)表示的二肽、式(17) Xc-Ya-ZZ (式中，Xc、 Ya及 ZZ分别与上述同义)表示的三肽、式(18) Xc-Ya (式中，Xc及Ya 分别与上述同义)表示的二肽、式(19) Xc-YY-Za (式中，Xc、 YY 及Za分别与上述同义)表示的三肽或式(20) Xc-Ya-Za(式中，Xc、 Ya及Za分别与上述同义)表示的三肽，
进一步优选式(21 )Xc-Yb-ZZ(式中，Xc及ZZ分别与上述同义， Yb相同或不同，表示L-氨基酸、其异构体D-氨基酸、或它们的外消 旋混合物、甘氨酸或(3-丙氨酸，所述L-氨基酸选自L-缬氨酸、L-亮 氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸或L-谷氨酰胺)表示的三肽、式(22)Xc-Yb (式中，Xc及Yb分别与上述同义)表示的二肽、式(23 ) Xc-Yc (式中，Xc与上述同义，Yc表示L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、 L-酪氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-酪氨酸、DL-缬氨 酸、DL-亮氨酸、DL-异亮氨酸、DL-酪氨酸或谷氨酰胺)表示的二肽、 式(24 ) Xc-YY-Zb (式中，Xc及YY分别与上述同义，Zb相同或不 同，表示L-氨基酸、其异构体D-氨基酸、或它们的外消旋混合物、 甘氨酸或(3-丙氨酸，所述L-氨基酸选自L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异 亮氨酸、L-酪氨酸或L-谷氨酰胺)表示的三肽、式(25) Xc-Yb-Za (式中，Xc、 Yb及Za分别与上述同义)或式(26) Xc-Yb-Zb (式 中，Xc、 Yb及Zb分别与上述同义)表示的三肽。
另外，在上述式(1) ~ (26)表示的寡肽中，较优选构成氨基酸 均为L-氨基酸的寡肽。更具体而言，优选丙氨酰缬氨酸、丙氨酰亮氨 酸、丙氨酰异亮氨酸、丙氨酰酪氨酸、丙氨酰谷氨酰胺等，较优选 L-丙氨酰-L-缬氨酸、L-丙氨酰-L-亮氨酸、L-丙氨酰-L-异亮氨酸、L-丙氨酰-L-酪氨酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺等。
本发明中使用的含有寡肽及中性氨基酸的溶液为在上述寡肽中 含有1种以上上述中性氨基酸的溶液，还可以含有其它的氨基酸、蛋 白质、无机盐等离子型物质、糖或色素等非离子型物质等。但是，为 了实施本发明的纯化方法，优选离子型物质的含量较少。另外，该溶 液优选为水溶液或含有甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等的醇水溶液，较 优选为水溶液。
含有该寡肽及中性氨基酸的溶液可以通过对由下述方法得到的 酶反应溶液或培养液进行离心分离、膜分离或过滤等除去菌体后，利 用电渗析或强酸性阳离子交换树脂等进行脱盐而得到，所述方法例如 为上述(a)使用来自枯草杆菌的肽合成酶由无保护的L-氨基酸进行 制造的方法、(b)使用具有L-氨基酸酰胺水解酶活性的酶或含酶物 质由L-氨基酸酰胺及L-氨基酸进行制造的方法、(c)使用具有生成 二肽的活性的蛋白质由L-氨基酸酯及L-氨基酸进行制造的方法、(d) 使用氨基酸酯水解酶进行制造的方法、(e)使用由属于稳杆菌属的
ii细菌得到的酶进行制造的方法、(f)在含有葡萄糖及铵盐的培养基 中，在基质氨基酸存在下，培养表达来自枯草杆菌的二肽合成酶基因
ywfe和丙氨酸脱氢酶基因aid的大肠杆菌，生成二肽的方法等。另夕卜， 也可以通过将由(g)利用化学合成进行制造的方法、在上述(a) (f)的方法中组合化学合成的方法进行制造的方法等得到的粗产物 溶解于水或甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇等醇与水的混合溶剂而得到。
作为本发明中使用的离子交换树脂，没有特别限定，可以适当使 用各种离子交换树脂，但优选使用弱酸性阳离子交换树脂或弱碱性阴 离子交换树脂。作为弱酸性阳离子交换树脂，例如可以举出在树脂上 具有羧基、酚羟基等作为官能团的树脂，更具体而言，例如可以举出 DiaionWK-40 (三菱化学公司制)、MAC3 (道化学(Dow Chemical) 公司制)、CNP80ws及CNPLF (拜耳(Bayer )公司制)、IRC50及 IRC76 (罗门哈斯(amberlite)公司制)等丙烯酸类或甲基丙烯酸类 树脂、以及由该树脂制备的树脂。作为所述弱酸性阳离子交换树脂的 离子型，优选H型。作为弱碱性阴离子交换树脂，例如可以举出在树 脂上具有伯氨基、仲氨基或叔氨基作为官能团的树脂。具体而言，可 以举出具有氨基、低级烷基氨基、二低级烷基氨基等的树脂，更具体 而言，可以举出具有氨基、曱基氨基、乙基氨基、二曱基氨基、二乙 基氨基等的树脂，更具体而言，例如可以举出DiaionWA-lO、 21、 30 (三菱化学公司制)等丙烯酸类或苯乙烯类树脂、以及由该树脂制备 的树脂。作为所述弱碱性阴离子交换树脂的离子型，优选为Cl型。 另外，通常使用1种所述离子交换树脂来进行本发明的寡肽的纯化方 法，但还可以根据需要适当组合选自上述弱酸性阳离子交换树脂及弱 碱性阴离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树 脂等中的2 4种离子交换树脂加以使用。作为该组合的例子，可以举 出在树脂上具有的官能团不同的2 4种离子交换树脂的组合等，例如 可以举出强酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂、弱酸性阳 离子交换树脂及弱碱性阴离子交换树脂的组合，强酸性阳离子交换树 脂、弱酸性阳离子交换树脂及弱碱性阴离子交换树脂的组合，强碱性
12阴离子交换树脂、弱酸性阳离子交换树脂及弱碱性阴离子交换树脂的 组合，强酸性阳离子交换树脂及弱酸性阳离子交换树脂的组合，强碱 性阴离子交换树脂及弱酸性阳离子交换树脂的组合，强酸性阳离子交 换树脂及弱碱性阴离子交换树脂的组合，强碱性阴离子交换树脂及弱 碱性阴离子交换树脂的组合，弱酸性阳离子交换树脂及弱碱性阴离子 交换树脂的组合等。
本发明的所谓使含有寡肽及中性氨基酸的溶液在有效pH范围内
与离子交换树脂接触的工序，例如可以通过下述方法实施，所述方法
为将含有寡肽及中性氨基酸的溶液在有效pH范围内通过填充有离子 交换树脂的柱；在分散有离子交换树脂的水溶液等中添加含有寡肽及 中性氨基酸的溶液，并在有效pH范围内混合；在含有寡肽及中性氨 基酸的溶液中添加离子交换树脂，并在有效pH范围内混合等，但优 选通过将含有寡肽及中性氨基酸的溶液在有效pH范围内通过填充有
离子交换树脂的柱进行实施。
将含有寡肽及中性氨基酸的溶液通过填充有离子交换树脂的柱
时，含有寡肽及中性氨基酸的溶液优选含有的寡肽或中性氨基酸的浓
度较低，可以根据需要加入水后使用。
有效pH范围是指用于利用离子交换树脂的适当的pH范围，可根 据使用的离子交换树脂的种类设定适当的pH范围。例如使用弱酸性 阳离子交换树脂时，该溶液的pH为4 14、优选5 14、较优选5 12、 更优选6 12、进一步优选7 10的范围内。另外，例如使用弱碱性阴 离子交换树脂时，该溶液的pH为0 9、优选1~9、较优选1 7、更优 选2 7、进一步优选2 6的范围内。
使用的含有寡肽及中性氨基酸的溶液的pH可以根据所使用的离 子交换树脂的种类配制成最佳pH(有效pH范围)，例如使用弱酸性 阳离子交换树脂时，该溶液的pH为4 14、优选5 M、较优选5 12、 更优选6~12、进一步优选7 10的范围内。优选为碱性状态。另外， 例如使用弱〃喊性阴离子交换树脂时，该溶液的pH为0 9、优选1 9、 较优选1 7、更优选2~7、进一步优选2 6的范围内。优选为酸性状
13态。因此，优选根据需要使用盐酸、硫酸、乙酸、苹果酸等酸、氢氧 化钠、碳酸钠、碳酸氬钠、氨水等碱，将溶液的pH调整至上述优选 范围内。
本发明中使用的离子交换树脂的量，优选使用使离子交换树脂上 的官能团(离子交换基团)的量相对于含有寡肽及中性氨基酸的溶液 中的总离子量足够多的量，例如使用弱酸性阳离子交换树脂时，优选 设定为离子交换基团的量超过溶液中总阳离子的量，使用弱碱性阴离 子交换树脂时，优选设定为离子交换基团的量超过溶液中总阴离子的
作为在将本发明的纯化方法中使用的含有寡肽及中性氨基酸的 溶液通过填充有离子交换树脂的柱时使用的柱，只要是能用于化学物 质纯化的柱即可，可以为任意的柱，但优选在将离子交换树脂填充到 柱内时使树脂层高度/柱内径变大的柱，较优选使树脂层高度/柱内径
为3.5以上。
为了将本发明的纯化方法中使用的含有寡肽及中性氨基酸的溶 液通过填充有离子交换树脂的柱，例如可以使该溶液从填充有离子交 换树脂的柱的上部即柱床(column bed)上层通过，也可以,人柱的下 部即柱床下层通过，较优选从柱床上层通过。作为通过速度，优选空 速为2 [ 1/小时]以下，较优选为1 [ 1/小时]以下。
将含有寡肽及中性氨基酸的溶液通过填充有离子交换树脂的柱， 并用洗脱溶剂洗脱时，作为洗脱溶剂，没有特别限定，例如优选水(可 以去离子也可以不去离子)、浓度为0.02 6mol/L的盐酸、硫酸、乙 酸、苹果酸等酸性水溶液、浓度为0.02 6mol/L的氢氧化钠、碳酸钠、 碳酸氢钠、氨等碱性水溶液、与含有寡肽及中性氨基酸的溶液的溶剂 组成相同的溶剂等。特别是使用弱酸性阳离子交换树脂时，优选浓度 为0.02 6mol/L的盐酸、硫酸、乙酸、苹果酸等酸性水溶液，使用弱 碱性阴离子交换树脂时，优选0.02 6mol/L的氢氧化钠、碳酸钠、碳 酸氢钠、氨等碱性水溶液。
根据本发明的纯化方法，例如将含有寡肽及中性氨基酸的溶液通过填充有离子交换树脂的柱，优选使上述洗脱液连续通过，使该寡肽 与离子交换树脂接触，将该寡肽洗脱，从而可以分离.纯化该寡肽。构 成寡肽的氨基酸为中性氨基酸时特别有效，可以从含有寡肽及中性氨 基酸的溶液中除去中性氨基酸来纯化该寡肽。作为洗脱液的通过速
度，优选空速为0.3 10 [ 1/小时]，较优选为0.5 2 [ 1/小时]。
本发明的纯化方法，如上所述可从含有寡肽及中性氨基酸的溶液 中，有效地分离寡肽和氨基酸、盐、金属离子等，对构成氨基酸中含 有中性氨基酸的寡肽、优选由中性氨基酸构成的寡肽和中性氨基酸的 分离特别有效。
本发明的纯化方法，除上述利用柱的方法外，还可如下实施，即， 根据需要将含有寡肽及中性氨基酸的溶液与离子交换树脂的混合物 用水等稀释、混合后，利用过滤等将离子交换树脂分离。
另外，含有L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、L-谷 氨酰胺等结晶性良好的氨基酸的溶液，也可以容易地实施本发明的纯 化方法。进而，对由本发明的纯化方法得到的上述洗脱液或滤液进^亍 制造肽时通常实施的公知的方法，例如脱盐、浓缩、结晶等操作，由 此能得到纯度较好的寡肽。
如上所述，在含有中性氨基酸作为其构成氨基酸的寡肽的制造方 法中，可包括本发明的纯化方法作为1道工序。另外，由包括本发明 的纯化方法作为1道工序的制造方法制造的寡肽，具有中性氨基酸等
杂质的含量特别小的特征。
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明不限于所述实施例。
实施例1 Ala-Ile的纯化
将溶解了 Ala-Ile 2.75g、 Ala 2.50g、 lie 0.40g及Ala-Ala 1.89g的 1000ml水溶液以空速0.5 [ 1/小时]从填充有1000ml WK-40 (三菱化
学公司制)的柱的柱床上层通过后，使水连续地从柱床上层通过。在 柱出口部安装紫外传感器进行监测，由此观察分离情况。收集洗脱 Ala-Ile的馏分并分析成分时，以83.1%的收率含有Ala-Ile。 lie及Ala的去除率分别为98.1%、 100.0%。 实施例2 Ala-Leu的纯化
将溶解了 Ala-Leu lO.Og、 Ala 0.80g、 Leu 0.99g及Ala-Ala 1.49g 的1000ml水溶液以空速0.5 [1/小时]从填充有720ml WK-40 (三菱 化学公司制)的柱的柱床上层通过后，使0.02mol/L的盐酸连续地从 柱床上层通过。在柱出口部安装紫外传感器进行监测，由此观察分离 情况。收集洗脱Ala-Leu的馏分并分析成分时，以85.9。/。的收率含有 Ala-Leu。 Leu及Ala的去除率分别为99.0%、 99.9%。 实施例3 Ala-Val的纯化
将溶解了 Ala-Val 7.84g、 Ala 0.53g、 Val 1.49及Ala-Ala 1.27g的 800ml水溶液以空速0.5 [ 1/小时]从填充有1000ml WK-40 (三菱化
学公司制)的柱的柱床上层通过后，使水连续地从柱床上层通过。在
柱出口部安装紫外传感器进行监测，由此观察分离情况。收集洗脱
Ala-Val的馏分并分析成分时，以86.0%的收率含有Ala-Val。 Val及
Ala的去除率分别为95.0%、 96.7%。
实施例4
Ala-Tyr的纯化
将溶解了 Ala-Tyr 7.88g、 Ala 0.57g、 Tyr 0.21及Ala-Ala 1.30g的 800ml水溶液以空速0.5 [ 1/小时]从填充有1000ml WK-40 (三菱化 学公司制)的柱的柱床上层通过后，使水连续地从柱床上层通过。在 柱出口部安装紫外传感器进行监测，由此观察分离情况。收集洗脱 Ala-Tyr的馏分并分析成分时，以84.6%的收率含有Ala-Tyr。 Tyr及 Ala的去除率分别为96.2%、 97.7%。 实施例5 Ala-Val的纯化
将溶解了 Ala-Val 5.32g、 Ala 0.86g、 Val 1.18及Ala-Ala 3.73g的 500ml水溶液以空速0.5 [ 1/小时]从填充有1000ml WA-21 (三菱化
16学公司制)的柱的柱床上层通过后，使水连续地从柱床上层通过。在 柱出口部安装紫外传感器进行监测，由此观察分离情况。收集洗脱
Ala-Val的馏分并分析成分时，以74.5%的收率含有Ala-Val。 Val及 Ala的去除率分别为100.0%、 100.0%。
实施例6
Ala-Leu的制造方法
向含有根据WO2004/058960中记载的方法得到的Ala-Leu (44.7g/l)以及Ala、 Leu等杂质、表达来自枯草杆菌的二肽合成酶 的大肠杆菌的细胞的4L培养液中加入硫酸调节pH至3.0后，通过离 心分离使菌体沉降。将菌体沉降的上清液以空速1.0 [ 1/小时]从柱床 上层通过填充有9L强酸性阳离子交换树脂SK-1B (H+)(三菱化学 公司制)的柱后，使水连续地从柱床上层通过，使Ala-Leu吸附于该 树脂上。进而，使0.7mol/L的氢氧化钠从柱床上层通过，洗脱吸附于 该树脂上的Ala-Leu。从洗脱液中分离得到含有Ala-Leu的馏分。得 到的馏分中含有上述培养液中92%的Ala-Leu,但含有的Ala、 Leu等 各杂质相对于Ala-Leu的比例未见变化。将该馏分以空速0.5[ 1/小时] 从填充有12L WK-40 (H+)(三菱化学公司制)的柱的柱床上层通 过后，使水连续地从柱床上层通过。在柱出口部安装紫外传感器进行 监测，分离得到含有Ala-Leu的馏分。通过该操作可以将作为杂质的 Leu及Ala分别除去98.3%及99.4%。通过使该馏分结晶得到98.7g Ala-Leu。
产业上的可利用性
由本发明提供的包括使含有寡肽及中性氨基酸的溶液在有效pH范 围内与离子交换树脂接触的工序的该寡肽的纯化方法，作为寡肽的分 离-纯化方法有用。
权利要求
1、一种寡肽的纯化方法，包括使含有所述寡肽及中性氨基酸的溶液在有效pH范围内与离子交换树脂接触的工序。
2、 如权利要求l所述的方法，包括下述工序(a)将含有寡肽 及中性氨基酸的溶液通过填充有离子交换树脂的柱的工序，以及(b) 将与离子交换树脂接触的所述寡肽用洗脱溶剂洗脱的工序。
3、 如权利要求1或2所述的方法，其中，离子交换树脂为弱酸 性阳离子交换树脂。
4、 如权利要求3所述的方法，其中，离子交换树脂为具有羧基 或酚羟基的树脂。
5、 如权利要求3或4所述的方法，其中，含有寡肽及中性氨基 酸的溶液的pH在4 14的范围。
6、 如权利要求3或4所述的方法，其中，含有寡肽及中性氨基 酸的溶液的pH在5 12的范围。
7、 如权利要求1或2所述的方法，其中，离子交换树脂为弱碱 性阴离子交换树脂。
8、 如权利要求7所述的方法，其中，离子交换树脂为具有选自 氨基、低级烷基氨基及二低级烷基氨基中的基团的树脂。
9、 如权利要求7所述的方法，其中，离子交换树脂为具有选自 氨基、曱基氨基及二甲基氨基中的基团的树脂。
10、 如权利要求7~9中任一项所述的方法，其中，含有寡肽及中 性氨基酸的溶液的pH在0 9的范围。
11、 如权利要求7 9中任一项所述的方法，其中，含有寡肽及中 性氨基酸的溶液的pH在1~7的范围。
12、 如权利要求1 11中任一项所述的方法，其中，中性氨基酸 为选自L-氨基酸、作为其旋光异构体的D-氨基酸及它们的外消旋混 合物、甘氨酸以及(3-丙氨酸中的氨基酸，所述L-氨基酸选自L-丙氨 酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-半胱氨酸、L-酪氨酸、 L-天冬酰胺及L-谷氨酰胺。
13、 如权利要求1 11中任一项所述的方法，其中，中性氨基酸 为选自L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-酪氨酸、D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-酪氨酸、DL-丙氨酸、 DL-缬氨酸、DL-亮氨酸、DL-异亮氨酸、DL-酪氨酸及谷氨酰胺中的 氨基酸。
14、 如权利要求1 13中任一项所述的方法，其中，寡肽为二肽或三肽。
15、 如权利要求1~13中任一项所述的方法，其中，寡肽为二肽。
16、 如权利要求14或15所述的方法，其中，二肽为用X-Y表示 的二肽，式中，X表示丙氨酸，Y表示L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮 氨酸、L-酪氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-酪氨酸、 DL-缬氨酸、DL-亮氨酸、DL-异亮氨酸、DL-酪氨酸或谷氨酰胺。
17、 如权利要求1 16中任一项所述的方法，其中，构成寡肽的 氨基酸为L-氨基酸。
18、 如权利要求1 17中任一项所述的方法，其中，寡肽是选自 下述(A) ~ (F)组成的组中的寡肽，(A)用使来自枯草杆菌的肽合成酶作用于无保护的L-氨基酸进 行制造的方法而得到的寡肽；(B)使具有L-氨基酸酰胺水解酶活性 的酶或含酶物质作用于L-氨基酸酰胺及L-氨基酸而制造的寡肽；(C) 使具有生成二肽的活性的蛋白质作用于L-氨基酸酯及L-氨基酸而制 造的寡肽；(D)在氨基酸酯水解酶的作用下制造的寡肽；(E)在 由属于稳杆菌属的细菌得到的酶的作用下制造的寡肽；以及(F)利 用化学合成得到的寡肽。
19、 一种寡肽的制造方法，包括使用权利要求1~18中任一项所 述的方法的工序。
20、 一种寡肽，是采用权利要求19所述的方法制造的寡肽。
21、 如权利要求20所述的寡肽，不含作为杂质的氨基酸。
全文摘要
本发明提供包括使含有寡肽及中性氨基酸的溶液在有效pH范围内与离子交换树脂接触的工序的该寡肽的纯化方法；包括(a)将含有寡肽及中性氨基酸的溶液通过填充有离子交换树脂的柱的工序、以及(b)将与离子交换树脂接触的该寡肽用洗脱溶剂洗脱的工序的该寡肽的纯化方法；使用弱酸性阳离子交换树脂的上述方法；使用弱碱性阴离子交换树脂的上述方法等。
文档编号C07K5/00GK101479292SQ20078002410
公开日2009年7月8日 申请日期2007年6月28日 优先权日2006年6月28日
发明者土屋静夫, 神童利胜, 西村哲夫 申请人:协和发酵生化株式会社